Summary
Mit dieser Studie stellen wir einen standardisierten Stress-Modell für die isolierte superfundiert Rinderretina für zukünftige therapeutische präklinischen Tests. Die Wirkung von entweder Hypoxie (reines N 2) oder Glutamat Stress (250 uM Glutamat) auf Netzhautfunktion von a- und b-Wellenamplituden dargestellt wurde ausgewertet.
Abstract
Neuroprotektion ist in der ophthalmologischen Forschung in den letzten Jahrzehnten eine starke Untersuchungsfeld und wirkt sich Krankheiten wie Glaukom, Netzhautgefäßverschluss, Netzhautablösung, und diabetische Retinopathie. Es war das Ziel dieser Studie, einen standardisierten Stress-Modell für zukünftige therapeutische präklinischen Tests einzuführen.
Rindernetzhäute wurden präpariert und mit einem Sauerstoff gesättigt Standardlösung durchströmt, und der ERG wurde aufgezeichnet. Nach dem Aufzeichnen stabil b-Wellen, Hypoxie (reines N 2) oder Glutamat Belastung (250 & mgr; m glutamat) wurde für 45 min ausgeübt wird. Um die Auswirkungen auf allein Photorezeptorfunktion zu untersuchen, wurde 1 mM zugegeben, um eine Aspartat-Wellen erhalten. ERG-Erholung wurde für 75 min überwacht.
Hypoxie wurde eine Abnahme in einer Wellenamplitude von 87,0% nach einer Expositionszeit von 45 min (Abnahme von 36,5% nach dem Ende der Auswaschphase p = 0,03) angemerkt (p <0,01). Zusätzlich wird ein Anfangs decrLeichtigkeit der b-Wellenamplituden von 87,23% erfasst wurde, dass die statistische Signifikanz erreichte (p <0,01, Abnahme von 25,5% am Ende der Auswaschphase, p = 0,03).
Für 250 & mgr; m Glutamat, einem anfänglichen 7,8% Reduktion der a-Wellen-Amplituden (p> 0,05), gefolgt von einer Reduktion von 1,9% (p> 0,05). Eine Verringerung von 83,7% der b-Wellenamplituden (p <0,01) wurde festgestellt; nach einer Auswaschung von 75 min war die Reduktion von 2,3% (p = 0,62). In dieser Studie wird eine standardisierte Spannungsmodell dargestellt, die nützlich für mögliche neuroprotektive Wirkung in der Zukunft identifiziert werden kann.
Introduction
Neuroprotektion ist ein starker Forschungsgebiet in der ophthalmologischen Forschung in den letzten Jahrzehnten. Die Retina ist ein hochempfindliches neuronalen Netzwerk, hängt signifikant von Sauerstoffversorgung und wird stark durch den Stoffwechsel des ihn umgebenden Zellen beeinflusst. Die wichtigsten Augenkrankheiten zu Schädigungen von Nervenzellen im Zusammenhang stehen retinalen Gefäßverschlüssen, Glaukom und Netzhautablösung.
Arterienverschluss, als Beispiel für die Netzhautgefäßverschluss führt zu einem plötzlichen Verlust des Sehvermögens durch Hypoxie des inneren Netzhaut ein. Es wird häufig mit allgemein vaskulären Pathologien 2 und führt zu einer anhaltenden Sehverlust 1 zugeordnet sind, wobei nur 8% der Patienten nach der Sehschärfe signifikant 1. Obwohl arteriellen Fibrinolyse wurde als Behandlungsoption vorgeschlagen worden, könnte der Nutzen nicht in einer randomisierten klinischen Studie 3 angezeigt.
Glaukom und Netzhautablösungbeide haben eine Erhöhung der Glutamatkonzentration 4-6. Glutamat unter physiologischen Bedingungen als exzitatorische Transmitter im gesamten Zentralnervensystem und der inneren Retina 7,8 angetroffen. Erhöhte Glutamatspiegel nicht nur bei Glaukom und Netzhautablösung 5,6, sondern auch in proliferative diabetische Retinopathie 9 gefunden. Eine Erhöhung Glutamat führt möglicherweise zu Exzitotoxizität und daher Nervenzellschädigung 10. In den meisten Fällen von Netzhautablösung und in einigen Fällen der proliferativen diabetischen Retinopathie Operation auf der Netzhaut (Vitrektomie) notwendig. Während der Vitrektomie mechanische Manipulation, helles Licht von der optischen Faser oder durch hohe Durchflussraten von Spüllösungen bei langen Operationen ausgeübten Scherspannung üben eine zusätzliche Belastung auf der Netzhaut 11,12.
Alle genannten Erkrankungen ist gemeinsam, dass die Pathologie zur retin lokalisiertenein allein und stellen die ophthalmologische Gemeinschaft vor der Herausforderung, Wege, um die Netzhaut als neurosensorische System zu schützen.
Das Elektroretinogramm (ERG) ist das Standardverfahren für die Bewertung der in vivo-Photorezeptor-Funktion (a-Welle), und die Funktion der inneren Retina (b-Welle). Die ERG wird durch Silber-Elektroden in die Hornhaut eingeführt, gemessen und die Augen sind durch eine zunehmende Licht stimuliert, um Defekte in Stäbchen oder Zapfen oder in der inneren Netzhaut erkennen. Unterschiedliche Fehler in der Netzhaut kann durch Veränderungen in der Amplitude (der Stärke der Antwort) oder die Latenz (die Zeit bis zur Antwort-Intervall) des ERG festgestellt werden. Verschiedene ERG-Protokoll und Messverfahren (Muster-ERG, multifokalen ERG-oder Hellfeld-ERG) ermöglichen eine weitere Differenzierung von Mängeln. Die Technik des isolierten Netzhaut wurde vor kurzem eingeführt wurde, wodurch es möglich wird, um Effekte auf die Netzhaut ohne Interferenzen von zB eine Studie Tieres zu evaluierenAllgemeinreaktionen 13,14.
Es war das Ziel dieser Studie zu bewerten, und die Einführung einer definierten und standardisierten Spannungsmodell für Hypoxie und Glutamat Belastung des Superfusion isoliert Retina. So hoffen wir, die Grundlagen für künftige Studien über neuroprotektive Effekte von bestimmten Agenten oder intraokularen Spüllösungen legen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung der Rinderaugen
- Erhalten Rinderaugen direkt nach der Schlachtung des Tieres.
- Transportieren die geschützten Augen "sichel Lösung" ein spezielles Medium, enthaltend 120 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,1 mM MgCl 2, 0,15 mM CaCl 2, 1,5 mM NaH 2 PO 4, 13,5 mM Na 2 HPO 4 und 5 mM Glucose bei RT.
- Führen Sie die Vorbereitung der Netzhaut unter dunklen Bedingungen angepasst mit einem dim rotes Licht.
- Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges. Führen Sie einen äquatorialen Schnitt ca. 4 mm hinter dem Limbus. Hornhaut, Iris, Ziliarkörper und Linse Danach entfernen Sie in einem Stück. Halten Sie die Netzhaut in Sickel-Lösung.
- Mechanisch lösen Sie die Glaskörper-Anhänge an den Netzhautoberfläche und entfernen Sie die Glaskörper aus der offenen Augenmuschel.
- Danach teilen das Auge in vier Quadranten und Punch-Out runden Flächen von ca. 7 mm Durchmesser mit einem Hohlbohrer.
- Trennen die Netzhaut vorsichtigaus dem Pigmentepithel und auf ein Aufnahmegerät in einem Karton vor Licht geschützt. Die Aufzeichnungsvorrichtung besteht aus einem Kunststoff mit einer Maschen Betreuers in der Mitte; legen Sie die Netzhaut auf dem Netz und dann fix mit einem Kunststoffring direkt auf den Elektroden.
HINWEIS: Die Kunststoff Maintainer hat zwei Kanäle, um eine konstante Strömung des Mediums zu ermöglichen.
2. Aufnahme der Elektroretinogramm (ERG)
- Um das Elektroretinogramm aufzunehmen, verwenden zwei Silber / Silberchlorid-Elektroden auf jeder Seite der Netzhaut und versorgen die Retina bei einer konstanten Geschwindigkeit von ca. Perfusion 1 ml / min, und konstanter Temperatur von 37 ° C. Verwenden Sie die "Sickel-Lösung" mit Sauerstoff gesättigt.
- Vor Beginn der Messung, dunkel Anpassung der Netzhaut (Schutz vor Licht bei allen Messungen) und verwenden Sie Stimulus Abständen von fünf Minuten. Verwenden Sie eine 1 Hz einzelne weiße Xenon-Blitz für die Stimulation mit einer Intensität von 6,3 mlx an der Netzhautoberfläche gesetzt. Verwenden kalibrierten Neutralfilter und einen Lichtreiz von 10 us durch einen Timer, um optimale Antworten haben gesteuert.
- Zur Messung und Verarbeitung der Daten, filtern die ERG und verstärken sie (100 Hz Hochpassfilter, 50 Hz Notch-Filter, 100.000 x Verstärkung) mit einem Gras RPS312RM Verstärker. Versuchen herausfiltern möglich Störfrequenzen, die das Signal stören können. Um die Daten zu verarbeiten, verwenden Sie einen Analog-zu-Digital-Datenerfassungskarte auf einem Desktop-Computer (PC-kompatibel).
- Nach der Dunkeladaptation Zeitraum konstant Perfusion messen die Amplituden des elektrischen Signals, bis stabile b-Wellenamplituden erfasst werden.
HINWEIS: Die Amplituden gilt als stabil, wenn fünf Einzelmessungen erreicht einen Mittelwert abweichen und weniger als 10%. Ein gutes Beispiel für Einzelmessungen wird in Abbildung 1 wiedergegeben. - Um den Test zu starten, wechseln reinem Sauerstoff entweder durch reinen Stickstoff (Anzahl der Einzelversuche, n = 5), um eine Hypoxie testenoder 250 & mgr; m Glutamat (n = 5).
- Notieren Sie die elektrischen Antworten alle 5 min für 45 min.
- Nach der Testphase durchströmen die Netzhaut mit Standardmedium mit Sauerstoff gesättigt 75 Minuten und Blick auf die Veränderungen der b-Wellenamplitude. Dies ist der Auswaschphase. Messen des b-Wellenamplitude von der Wanne der a-Welle auf die Spitze der b-Welle.
- Um die Wirkung von Hypoxie oder Glutamat an der Photorezeptor-Potentials unter skotopischen Bedingungen zu untersuchen, unterdrücken die b-Welle, die durch Zugabe von 1 mM in die Nährlösung.
- Nach der Aufnahme einer stabilen Photorezeptor-Potentials für 30 Minuten, führt das Verfahren nach wie vor Freilegung der Netzhaut 45 Minuten zu den verschiedenen Spüllösungen mit 1 mM Aspartat. Verwenden Sie den gleichen Zeitraum Auswaschen (Schritt 2.8), wie oben erwähnt.
3. Datenanalyse
- Um die Daten statistisch auszuwerten, sorgen für eine Normalverteilung für alle Daten, beispielsweise unter Verwendung des Kolmogorov-SmirnovTest 15.
- Berechnen Sie die Reduzierung der a- und b-Wellenamplituden in Prozent nach der Belichtungsphase im Vergleich zur letzten Messung vor der Ausstellung. Vergleichen Sie die Reduzierung der ERG-Amplituden nach 45 Minuten - am Ende der Ausstellung Zeitraum - zum ERG gemessen vor der Anwendung.
- Vergleichen der A- und B-Welle am Ende der Auswaschphase zur entsprechenden Amplitude vor Exposition, um eine mögliche Wiederherstellung zu prüfen.
- Für die statistische Analyse, die Software JMP Statistik-Software SPSS oder Software. Berechnen von Daten im gesamten als Mittelwert ± Standardabweichung. Schätzwert von der entsprechenden statistischen Grundlage.
HINWEIS: Diese Tests können unterschiedlich sein, je nach Versuchsumfang. Bei dieser Einstellung verwendet der Student-gepaarten t-Test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach 1 Stunde der Durchblutung der Netzhautpräparate mit sauerstoffgesättigten Standardlösung (1A und B) ERG-Amplituden zeigten Stabilisierung und weniger Variation der Amplituden zwischen Einzelmessungen. pH-Wert, osmotischer Druck, Temperatur und pO 2 (außer für Hypoxie testing) wurden für alle Versuche konstant gehalten.
Um die Photorezeptorsignal aus dem Signal der inneren Retina zu isolieren, wurde 1 mM Aspartat zu der Standardlösung zugesetzt, um die b-Welle (1A), zu unterdrücken. Während des Testens der Wirkung des Hypoxie wurde eine Abnahme in einer Wellenamplitude von 87,0% nach einer Exposition von 45 Minuten notiert (p <0,01). Am Ende der Auswaschphase wurde eine Abnahme von 36,5% angemerkt, daß war statistisch signifikant (p = 0,03, 2A). Zusätzlich wurde ein erster Rückgang der b-Wellenamplituden von 87,23% zu verzeichnen, dass ebenso statistisch signifikant (p <0,01). In dieser Einstellung wird eine Reduktion von 25,5%wurde festgestellt, daß war statistisch signifikant (p = 0,03, 2B).
Nach Exposition mit 250 um Glutamat, einer 7,8% nicht-signifikanten Reduktion von a-Wellen-Amplituden wurde nach (p> 0,05) der definierten Zeitintervall erkannt. Dies wurde durch einen nicht-signifikanten Reduktion von 1,9% (p <0,05, 3A) folgt. Einzelmessungen sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
In Bezug auf die b-Welle, verminderte Amplituden der ERG von 83,7% zu verzeichnen, die statistisch signifikant waren (p <0.01, 3B). Am Ende der Auswaschphase wurde ein b-Welle Erholung hingewiesen, was zu einem nicht-signifikanten Reduktion von 2,3% nach 75 Minuten Perfusion mit Standardlösung (p = 0,62).
Abbildung 1: Beispiel eines ERG-Messung von der isoliert perfundierten Rindenetzhaut (A) Die a-Welle ist in dargestellt.die ERG der isolierten perfundierten Rinderretina. Die b-Welle wird durch Zugabe von 1 mM Aspartat in die Nährlösung unterdrückt. (B) Die b-Welle ist unter skotopischen Lichtverhältnissen dominant. Ein 10 ms Lichtreiz bei einer Lichtintensität von 6,3 mlx verwendet.
Abbildung 2: Wirkungen von Hypoxie nach einer Einwirkzeit von 45 min auf der (A) a-Welle und auf der (B) b-Wellenamplitude des ERG. Durchschnittliche repräsentativer Droge-Serie (n = 5). Der horizontale Balken über der Kurve markiert den Hypoxie Zeit. Die gestrichelte Linie (A) markiert den Auftrag von Aspartat 1 mM Photorezeptorpotential demaskieren. Standardabweichungen für jede Versuchsreihe werden direkt vor und nach der Anwendung als auch am Ende des Versuchs angegeben. Die statistische Analyse wurde an den Zeitpunkten mit Hilfe der Standardabweichung ausgeführt (unmittelbar vor und nach applicatIonen als auch am Ende der Prüfung): (A) Eine Abnahme in einer Wellenamplitude von 87,0% wurde nach einer Expositionszeit von 45 Minuten im Vergleich zu dem Beginn der Studie festgestellt. Am Ende der Studie wurde ein signifikanter Rückgang von 36,5% festgestellt. Wurde (B) eine signifikante Abnahme der b-Wellenamplituden von 87,23% am Ende der Expositionszeit aufgezeichnet. Am Ende der Studie wurde eine signifikante Reduktion von 25,5% festgestellt.
Abb. 3: Auswirkungen von 250 uM Glutamat für 45 Minuten auf dem (A) angewendet a-Wellenamplitude und der (B) b-Wellenamplitude der ERG der isolierten perfundierten Rinderretina Durchschnitt der repräsentativen Droge-Serie (n = 5) . Der horizontale Balken über der Kurve markiert die Anwendung von Glutamat. Die gestrichelte Linie (A) markiert den Auftrag von Aspartat 1 mM Photorezeptorpotential demaskieren. Standard Abweichungen für jede Serie der Versuche sind unmittelbar vor und nach der Applikation als auch am Ende des Versuchs angegeben. (A) Nach einer Einwirkungszeit von 250 um Glutamat eine nicht signifikante Verringerung der A-Welle: Die statistische Analyse wurde an den Zeitpunkten mit der Standardabweichung (unmittelbar vor und nach der Anwendung am Ende der Studie als auch) durchgeführt Amplituden (7,8%) festgestellt. Am Ende des Versuchs wurde eine nicht signifikante Verringerung von 1,9% gefunden. (B) bezüglich der b-Welle, signifikant verringert Amplituden des ERG um 83,7% wurden aufgezeichnet. Am Ende des Versuchs wurde eine nicht signifikante Verringerung von 2,3% festgestellt.
| Zeit [min] | b-Wellenamplitude [uV] | SD | a-Wellenamplitude [uV] | SD |
| 0 | 9.2 | <td align = "right"> 0,836660027-10,4 | 1,140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1,095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10,6 | 0,547722558 |
| 15 | 9.4 | 1,140175425 | -9,6 | 0,547722558 |
| 20 | 9.4 | 0,547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | 0,894427191 | -10,8 | 0,447213595 |
| 4.2 | 2,774887385 | -6,6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2,449489743 | -5 | 2,236067977 |
| 40 | 3.8 | 1,788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1,341640786 | -5 | 2,121320344 |
| 50 | 2.4 | 1,140175425 | -4 | 1.870828693 |
| 55 | 2.2 | 0,836660027 | -3,4 1,140175425 | |
| 60 | 2.6 | 0,547722558 | -3,4 | 1,816590212 |
| 65 | 1.8 | 0,836660027 | -2,8 | 1,303840481 |
| 70 | 1.2 | 0,447213595 | -1,4 | 0,894427191 |
| 75 | 4.2 | 0,836660027 | -5,2 | 2,683281573 |
| 80 | 5.8 | 1,303840481 | -6 | 2,828427125 |
| 85 | 1,095445115 | -4,8 | 0,836660027 | |
| 90 | 6.8 | 1,095445115 | -6,2 | 2,387467277 |
| 95 | 7.4 | 1,816590212 | -5,6 | 2,302172887 |
| 100 | 6.4 | 0,547722558 | -6,2 | 2,863564213 |
| 105 | 6.6 | 0,894427191 | -7,2 | 2,049390153 |
| 110 | 6.2 | 1,643167673 | -6,4 | <td align = "right"> 2,966479395|
| 115 | 8.8 | 3,898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7.4 | 1,516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6.8 | 1,095445115 | -6 | 2,645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6,6 | 1,816590212 |
Tabelle 1: Kolmogorov-Smirnov führt.
| Zeit [min] | b-Wellenamplitude [uV] | SD | a-Wellenamplitude [uV] SD | |
| 0 | 9.25 | 0,5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10,25 | 0,5 | -10,4 | 0,894427191 |
| 15 | 10.5 | 0,577350269 | -9,6 | 0,894427191 |
| 20 | 10 | 0,816496581 | -9,6 | 0,547722558 |
| 25 | 10,75 | 0,5 | 0,836660027 | |
| 30 | 3 | 1,825741858 | -8,4 | 2,701851217 |
| 35 | 6 | 3,559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5.25 | 2.62995564 | -8,4 | 2,966479395 |
| 45 | 2.75 | 2,061552813 | -9 | 1,414213562 |
| 50 | 2.75 | 0,957427108 | -8 | 0,707106781 |
| 55 | 1 | -10,2 | 1,095445115 | |
| 60 | 2.25 | 0,957427108 | -8,4 | 1,816590212 |
| 65 | 2 | 1,414213562 | -8,6 | 1,140175425 |
| 70 | 1,75 | 0,5 | -9,4 | 2,701851217 |
| 75 | 8 | 3,464101615 | -9,2 | 2.28035085 |
| 80 | 9.5 | 3,696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2,160246899 | -10,8 | 2.48997992 |
| 90 | 8,25 | 0,957427108 | -9,2 | 2,167948339 |
| 95 | 9.25 | 2,872281323 | -10 | 1.870828693 |
| 100 | 9,75 | 0,957427108 | -9,6 | 1,140175425 |
| 105 | 13,5 | 3,872983346 | -9,2 | 1,643167673 |
| 110 | 11,75 | -9,6 | 1,140175425 | |
| 115 | 9 | 1,825741858 | -10 | 1.870828693 |
| 120 | 11 | 3,366501646 | -9,8 | 1,303840481 |
| 125 | 11 | 2,708012802 | -10,8 | 0,447213595 |
| 130 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
Tabelle 2: Repräsentative Messungen für Hypoxie für b-Wellenamplituden und einem Wellenamplituden.
| Glutamat eine Wellendaten | Glutamat b-Wellendaten | Hypoxie a-Wellendaten | Hypoxie b-Wellendaten | |
| D | 0,103827009 | 0.17415038 | 0,195 | 0,125 |
| p-Wert | 0,928603977 | 0,375501627 | 0,250 | 0,781 |
| Alpha | 0,05 | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
Tabelle 3: Repräsentative Messungen für 250 uM Glutamat für b-Wellen-Amplituden und eine Wellenamplituden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie wurde eine signifikante Auswirkung auf die b-Wellenamplitude nach 45 min von Hypoxie gefunden. Diese Reduktion war nach der Auswaschphase signifikant. Eine ähnliche Wirkung auf die Photorezeptor-Potentials beobachtet werden.
Die Ergebnisse werden von anderen veröffentlichten Daten 16 und geben Sie uns die Gelegenheit, mögliche neuroprotektive Effekte nach Hypoxie Studium unterstützt.
Nach 45 min Exposition von 250 & mgr; M Glutamat, fanden wir eine statistisch signifikante Wirkung nur auf der b-Wellenamplitude, die am Ende der Auswaschphase vollständig reversibel war. Die Photorezeptor-Potentials wurde durch 250 uM Glutamat beeinflusst. Die Tatsache, dass nur die innere Retina durch Hypoxie betroffen anzeigt, dass die Änderungen sind sehr fein, und wir haben deshalb eine sehr empfindliche und standardisierten Indikator für mögliche Neuroprotektion. Aspartat hemmt spezifisch Übertragung von dem Photorezeptor auf den Horizontal oder bipolaren Zellen und damit unterdrückt die b-Welle.
Dieser Befund steht im Widerspruch zu den Ergebnissen der DG Grün und Kapousta-Bruneau NV, die sich gezeigt, dass bei Konzentrationen von 250 und 500 mM Glutamat im Vergleich zu Medien allein 17 der b-Wellen Aufnahme waren über die Zeit stabiler. Um diesen Widerspruch einige Unterschiede in den Einstellungen müssen berücksichtigt werden, zu erklären: Sickel-Lösung wurde in diesem Modell das andere Publikation Ringer-Lösung verwendet.
Die Messungen wurden mit einer Reihe der anderen Veröffentlichung mit einer einzelnen Elektrode. Rinderaugen aus dem Schlachthaus wurden verwendet, während der andere Druckschrift beschriebene frische Ratte Augen. Der Effekt war reversibel mit einer zeitlichen Hemmung bei hohen Glutamatkonzentrationen. Es ist allgemein bekannt, dass eine bestimmte sehr geringen Menge an Glutamat ist für gute Wartung des Auges notwendig ist und dass höhere Mengen sind giftig. Wir könnten, dass in den Rinderaugen aus dem sl nehmenaughterhouse mehr Glutamat wird im Vergleich zu frisch zubereiteten Augen was Glutamatspiegel, anders als von der experimentell aufgenommen Glutamat erwartet freigegeben.
Messen der Antwort unter Verwendung eines Arrays über die gesamte Retina statt einer Elektrode, die hauptsächlich durch den engsten Zellen beeinflusst wird, könnte auch zu einer längeren Lebenszeit führen aufgrund der geringeren mechanischen Beschädigungen. Schließlich ist die Zusammensetzung der Medien entscheidend. In den 1960er Jahren Prof. Sickel stark in die Entwicklung dieses Fachmedien für diese Messungen investiert und er war in der Lage, eine optimierte Medien ohne Glutamat für eine stabile Netzhautreaktion 13,14 zu finden.
Das beschriebene Modell beruht auf einem isolierten Netzhaut statt eines ganzen Tieres. In einem in vivo-System, das Auge von der Blut-Retina-Schranke aus anderen Organen des Tieres isoliert. Der Vorteil dieses Modells ist, dass störende Parameter in Versuchstiere, wie zB Anästhesieoder der Position von Elektroden nicht auftritt, die einen höheren Grad an Standardisierung ermöglicht. Normung ist ein kritischer Punkt im Tierversuch, vor allem in Bezug auf das Auge 18.
Die Grenzen dieses Verfahrens sind die kurzen Testperiode und der Tatsache, dass es nicht ein Tiermodell. Wir wissen aus Erfahrung, dass ERG-Amplituden bleiben für ca. 8 h stabil, damit die in der Einleitung genannten Testzeitraum kann auf eine etwas längere Belichtung und Follow-up-Frist verlängert werden, aber man sollte immer bedenken, dass je länger ein einzelnes Experiment erweitert wird, die eher höhere Standardabweichungen auftreten.
Ein Nachteil des Modells ist daher, daß keine Langzeitstudien durchgeführt werden können und nur eine begrenzte Menge von Manipulationen an der Retina möglich. Für umfangreiche Manipulation und spezielle ERGs wie multifokalen ERG von SLO nach Dutescu et al geführt. B. in vivo-Experiments erforderlich 19.
Dieses Modell kann leicht für die menschliche Netzhaut explantiert zB aus entkernten Augen verwendet werden. Da dieses empfindlichen Materials ist kompliziert zu erhalten, Experimente an Rindernetzhäute sind möglich, aber zu interpretieren ist vor diesem Hintergrund.
Die kritischen Schritte im Protokoll transportieren und die Vorbereitung der Netzhaut unter dunklen Bedingungen angepasst. Dies ist wichtig, um die maximal mögliche Antworten zu erhalten. Es kann manchmal ein paar Minuten vorsichtig trennen die Netzhaut von der darunter liegenden Pigmentepithel. Leichtem Schütteln des ausgestanzten Netzhaut erleichtert manchmal diesen Prozess. Beim Aufsetzen der Netzhaut auf dem Netz ist es wichtig, um die Netzhaut mit der äußeren Netzhaut auf dem Netz zu setzen. Nach trephanization, werden die Kanten der Retina leicht nach oben biegen, die die Position des inneren Retinaschicht.
Die Rindernetzhaut ähnelt mehr der menschlichen Netzhaut vergleichend auf der Netzhaut des Auges Nagetier wegen ähnlicher glasig-Linse-Verhältnis und einer Gefäßstruktur, die eine der für das menschliche Auge 20 ähnelt; Obwohl kleine Labortiere wie Ratten oder Mäuse sind weit verbreitet zum Testen retinale Biokompatibilität, Toxizitätsuntersuchungen an Tieren durchgeführt, wie oft weniger auf den Menschen 20. Die phylogenetische Analyse des Myocilin Gen - ein Gen, das in seiner mutierten Form bewirkt autosomal dominanten juvenilen Weitwinkelglaukom - zeigt, dass die Rinder-Gen näher zum menschlichen Gen als die der Ratte oder der Maus 21 bezogen. Myocilin in trabekulären Netzwerkzellen, sowie in der Netzhaut ist. Endlich haben wir gezeigt, eine gute Korrelation zwischen Rindern und Menschen isoliert ERGs und ERG Auswirkungen 12.
In unserem Modell wurde Aspartat eingesetzt, um die Photorezeptorpotential P III durch die Abschaffung der b-Welle zu entlarven. Dies gibt dem Prüfer die Möglichkeit, zu unterscheidenzwischen den Wirkungen auf die innere Retina Netzwerk und dem Photorezeptorfunktion 22. Während die b-Welle ist eine sehr viel empfindlicher Parameter bezüglich der integrierten Funktion, ist der a-Wellenamplitude stabiler und widerstandsfähiger gegen Druck, aufgrund der Tatsache, dass der a-Welle reflektiert nur die Reaktion der Photorezeptoren Licht es. Im Gegensatz dazu hängt die b-Welle auf der Zell-Zell-Wechselwirkung von verschiedenen Netzhautzellen und die Aktivität der Photorezeptoren. Durch die Verwendung von Aspartat, die Isolierung A-Welle ist es möglich, den Effekt der Manipulation an den Photorezeptoren allein 23 zu untersuchen.
In dieser Studie wurde eine standardisierte neuronale Toxizität Modell, das verwendet werden kann, um neuroprotektive Mittel Test wurde bewertet. Als Ausblick wird es interessant sein, um elektrophysiologische Funktion mit Protein-biochemische Analyse korrelieren oder Funktion mit den Zellstoffwechsel oder auch mRNA-Expression korreliert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J.
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
