Isolamento e Imortalidade de linhas celulares derivadas do paciente a partir de biópsia muscular para a doença Modeling

Protocol

NOTA: Os protocolos para a coleta do tecido humano deve ser analisado e aprovado pelo Comitê Institucional IRB. Coleção de descartado, tecido humano identificado-de ter sido aprovado pelo Hospital Infantil de Boston e Comitês IRB Hospital Brigham and Women. Os métodos descritos a seguir foram aplicadas para o isolamento de células miogénicas do de-identificados, tecido descartado. Os métodos descritos são aplicáveis ​​ao tecido a partir de material coletado do paciente consentiu.

1. Isolamento celular

1. A dissociação de biópsia do músculo e purificação de células miogénicas
   1. Pré-pesar uma placa de cultura de tecido de 10 centímetros em uma biossegurança capa de cultura de tecidos, e, em seguida, re-pesar a placa contendo a biópsia muscular para calcular a quantidade de tecido a ser dissociados.
   2. Usando bisturis estéreis, tecido muscular pique finamente e adicione algumas gotas de estéril 1x HBSS para evitar que o tecido seque.
   3. Adicionar 3,5 ml de cada dispase II e colagenase D por grama de tecido muscular a ser digerido. Pipeta o tecido picada e solução de enzima através de uma pipeta estéril 25 ml algumas vezes. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 15 minutos e digerir tecido até que a lama passa facilmente através de uma pipeta de 5 ml estéril.
      NOTA: dissociação Tissue é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. Por favor, consulte a secção 'Os resultados representativos "para obter detalhes adicionais.
   4. Adicionar 2 volumes de meio de cultura estéril de tecido dissociado, filtrar através de um filtro de 100 um sobre uma célula de células de 50 ml para tubos cónicos e pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1100 rpm), a temperatura ambiente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia.
   5. Ressuspender o sedimento em 1 volume de meio de cultura estéril e adicionar 7 volumes de solução de lise de glóbulos vermelhos. Filtrar a solução através de um filtro de células 40 pm, então sedimentar tele células durante 10 minutos a 329 xg, à temperatura ambiente.
   6. Contar as células num hemocitómetro e ressuspender as células em HBSS 1x 0,5% de BSA numa concentração de 1 x 10 ⁶ células / 100 ul. Separe ~ 250.000 células em um único tubo que vai ser utilizado como um controlo negativo (sem mancha). Definir uma só cor manchadas tubos de controle de lado adicionais de iodeto de propídio e para CD56, que são necessários para a correcta delimitação de células positivas CD56 por FACS classificação. Por favor, consulte a célula manuais seleção ou consultar com FACS triagem especialistas instalação central para assegurar os controlos adequados estão incluídos.
   7. Corar as células a serem classificados com 5 ul / 10 ⁶ células do anticorpo anti CD56. Incubar todas as amostras (incluindo o controlo) em gelo durante 30 min.
   8. Lavar as amostras em 10 ml de HBSS e 1x células pelotas durante 10 minutos a 329 xg (~ 1.100 rpm) numa centrifugadora refrigerada, 4 ° C de temperatura.
   9. Adiciona-se iodeto de propídio a uma concentração final de 1 ug / ml para a amostra a ser sorted para a exclusão de células mortas. Purifica-se células positivas para CD56 a partir de células miogénicas não miogénicos usando o separador de células activadas por fluorescência.
2. A dissociação de biópsia de pele
   NOTA: dérmica de fibroblastos podem ser isolados a partir de uma punção da pele de doentes biópsias musculares quando não estão disponíveis. Fibroblastos dérmicos podem ser usadas como biomaterial para diversos estudos, incluindo a transdução com MyoD para gerar células miogénicas. Além disso, os fibroblastos da derme pode ser usado para gerar células iPS, que podem ser diferenciadas em vários tipos de células para estudo posterior.
   1. Transportar a biópsia da pele para o laboratório em meio de transporte. Uma vez que a amostra é recebido, realizar a cultura primária tão rapidamente quanto possível. Se a cultura primária não podem ser estabelecidos no mesmo dia, armazenar a amostra à temperatura ambiente durante a noite.
   2. Transfira a biópsia da pele para um estéril 35 milímetros placa de Petri na capela de fluxo laminar.
   3. Lavar a biópsia da pele em uma placa de Petri estéril com 1x PBS para remover o sangue e detritos. Remover o tecido adiposo com um bisturi estéril.
   4. Adicionar 2 ml de solução de colagenase e mediu o tecido com bisturi, incubar a 37 ° C durante 45 min a 1 hora, dependendo do tamanho do tecido.
   5. Transferir o tecido digerido a um tubo de 15 ml, lavar a placa de Petri com 2 ml de meio de cultura de fibroblastos duas vezes, e recolher o meio no mesmo tubo.
   6. Sedimentar as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   7. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 3 ml de meio de fibroblastos para remover a colagenase, em seguida, as células pellet novamente. Por favor, consulte a Tabela de Materiais para a composição de mídia.
   8. Repita o passo 1.2.7 mais uma vez.
   9. Re-suspender o sedimento em 5 ml de células de fibroblastos e médias placa em um frasco de cultura de tecidos T25 estéril. Incubar o balão a 37 ° C com 5% de CO _2.
   10. Avaliar a cultura de fibroblastos para fixação e crescimento nos próximos 1-3 dias. <br /> NOTA: Alguns pequenos pedaços de tecido também pode anexar a placa e fibroblastos migram para fora desses pedaços de tecido.
   11. Manter a cultura sob as mesmas condições até que os fibroblastos são cultivadas a cerca de 80% de confluência.
   12. Recolhe fibroblastos por tripsinização e transferir para frascos de cultura frescas para a expansão adicional. Realizar tripsinização por lavagem das culturas 3 vezes em PBS 1x isento de Ca ⁺⁺ e Mg ^++. Adicionar tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) para as células (frascos de 2 ml / T25), durante 2 min a 37 ° C.
   13. Dividir células destacadas em frascos adicionais. Se alguns pedaços de tecido permanecer solidários com os frascos T25 originais, adicionar 5 ml de meio de cultura fresco para este frasco e mais fibroblastos vão migrar para fora continuamente.
       NOTA: A cultura de fibroblastos expandidos podem ser congelados para baixo como P1 e armazenados em azoto líquido para futuras experiências.

2. Imortalidade de Células Miogênica

1. Células de alimentação 30 minutos antes da transfecção com 5 ml de meio fresco suplementado com 10 mM de cafeína.
2. Homogeneizar uma mistura de 2 ug de DNA de plasmídeo a partir de uma preparação midi (hTERT CDK4 ou plasmídeo) e PolyJet e incubar à temperatura ambiente durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante.
3. Adicione a mistura de plasmídeo / PolyJet às células PE durante a noite.
4. Células de alimentação com meio fresco (DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 10% de soro de vitelo). Doze horas mais tarde, recolhe-se o sobrenadante contendo vírus, filtrando-a através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um.
5. Use 1 ml de sobrenadante recolhido para infectar durante a noite a linha celular de empacotamento anfotrópico PA317 ⁵ e obter uma linha de células produtoras de vírus, após selecção com estável ou 0,5 mg / mL de neomicina (G418) para CDK4 ou 0,5 mg / ml de higromicina para hTERT.
6. Prepare trabalhando sobrenadantes virais pelo crescimento das células de embalagem estáveis ​​para próximo da confluência, em seguida, a colheita do sobrenadante cada manhã, à noite e de manhã a três colheitas.
7. Filtrar os sobrenadantes virais e utilizar quer directamente ou dividi-los em alíquotas de 1 ml e armazenar a -80 ° C para uso posterior. Note-se que o sobrenadante viral perde 50% de eficiência de infecção com cada congelamento-descongelamento. Lembre-se de branquear-lavagem antes de descartar tudo o que tem tocado as partículas virais.
   NOTA: A linha de células produtoras de vírus PA317 estáveis ​​pode ser congelada e mantida a -150 ° C para o armazenamento permanente (meio de congelação é de 10% de DMSO; 90% soro).
8. Placa células miogénicas-purificado FACS (descrito nos passos 1,1-1,9) a uma densidade de 5 x 10 ⁴ células / poço em placas de 6 poços revestidas com 0,1% de gelatina. Certifique-se de que as células estão ligados à placa antes de prosseguir com a infecção viral.
9. Adicionar 400 ul filtrada, freshly produzido sobrenadante viral ou alíquotas congeladas a cada seis poços durante a noite (manter dois poços como controles).
10. Mudar meio alimentando as células com 2,5 ml de poço de media / fresco muscular (4: 1 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio 199 suplementado com 15% de soro fetal de bovino; 0,02 M de tampão HEPES; 1,4 mg / L de vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l dexametasona, factor de crescimento de hepatócitos de 2,5 ug / L e factor de crescimento de fibroblastos básico / L 10? g). Descartar os meios de comunicação e pipetas contendo as partículas virais em um recipiente de água sanitária. Deixar as células no mesmo meio durante 3 dias para recuperar de infecção, em seguida, tratar por selecção usando 400 ug / ml de neomicina (infecção CDK4) ou 300 ug / ml de higromicina (infecção hTERT).
11. Manter as células sob selecção de droga até as células da matriz de controlo prato (1-2 semanas).
12. Células de passagem antes de se tornarem confluentes (60-80% de confluência, utilizando tripsina EDTA 0,05%), mesmo durante a selectino período. Células replate 10 centímetros em vários pratos com meio de mioblastos fresco (como descrito em 2.11) suplementadas com a droga seleção. Manter células imortalizadas seleccionados como uma população heterogénea ou clonar obter um fundo genético completamente homogénea (mesma inserção do transgene em todas as células).
13. Realizar a selecção clonal utilizando os seguintes passos:
    1. Semear as células a uma densidade baixa (por exemplo, 300 a 500 células em placas de 10 cm) e mantê-los durante cerca de duas semanas, até que colónias pequenas são formadas células (10-20).
    2. Remover a maior parte do meio, neste ponto, deixando apenas uma película fina para evitar que as células de secar.
    3. Coloque um anel de clonagem (com uma extremidade mergulhada em silicone graxa de vácuo) ao longo de cada clone desejado e adicione algumas gotas de tripsina / EDTA.
    4. Células colheita, uma vez que se tornam arredondadas com cuidado aspirar as células utilizando uma ponta de 1 ml ou uma pipeta de Pasteur e transferi-las para o menor pla multipoço disponívelte (96 ou 48, 24 ou placas de 12 poços).
    5. Expandir clones conforme necessário para evitar confluência local.

Representative Results

A Figura 1 ilustra alguns dos principais passos envolvidos na dissociação de tecido primário: a quantidade exacta de tecido é pesada num estéril de cultura de tecido de petri (Figura 1A, B). O tecido é então finamente picada usando bisturis estéreis, até que uma suspensão de tecido é obtida (figura 1C, D). Após a adição das enzimas de digestão, o tecido muscular primária dissociação é geralmente obtida por digestão enzimática dentro de 45-90 min. A progressão da digestão do tecido é tipicamente monitorizada a cada 15-20 min para evitar overdigestion e morte celular. A digestão enzimática pode ser suavemente pipetado e misturado algumas vezes a cada 15-20 min. No final da etapa de digestão, as células são filtradas através de uma de 100 um (Figura 1E, F) e, em seguida, um filtro de 40 um. Dependendo da quantidade de partida de tecido muscular e se a amostra é obtida de levemente ou severamente músculo afectado, o cel primário dissociadols será heterogénea. A Figura 1G mostra um exemplo de células mononucleares em suspensão imediatamente a seguir à digestão, enquanto a Figura 1H mostra um exemplo de células primárias dissociadas de 3-6 horas a seguir à digestão e plaqueamento em placas de cultura de tecido. As células miogénicas será normalmente misturado com fibroblastos e células adipog�icas. As células imunes pode também estar presente nos casos em que a inflamação está associada com a doença do paciente. Por conseguinte, a separação em perspectiva dos diferentes tipos de células pode ser desejável. Para o isolamento de células miogénicas prospectivo humanos, CD56 ou N-CAM tem sido amplamente utilizada como um marcador fiável ^6-9. Esta purificação pode ser benéfico logo após isolamento para o enriquecimento de células progenitoras miog�icas e antes do processo de imortalização das células. Alternativamente, a imortalização de células primárias pode ser realizada, inicialmente, células miogénicas então imortalizadas pode ser seleccionada com base na expressão de CD56 por FACS. A sobre esquemáticaos passos necessários antes da separação por FACS e um exemplo de um perfil de FACS é ilustrada na Figura 2. Resumidamente, as células primárias são contadas e ressuspensas numa concentração elevada, tal como indicado, em seguida, o anticorpo primário (ie anti CD56) é adicionado às células e incubado durante 30 minutos em gelo. Após uma lavagem, as células são analisadas por meio de um classificador de células activadas por fluorescência e purificado (Figura 2) .O rendimento aproximado de células positivas para CD56 varia de amostra para amostra, variando de 40-70% do total de células mononucleares. O rendimento varia, dependendo da idade do indivíduo e se as células miogénicas são extraídos a partir do músculo afectado, ou doente. Músculo Unaffected normalmente tem alta porcentagem de células miogênicas, enquanto músculo distrófico muitas vezes tem menor porcentagem de células positivas para CD56. As células purificadas são plaqueadas em meio de crescimento completo miogénica (ver Tabela de Materiais). As células podem ser passadas por tripsinização quando Reach 60-70% de confluência. As células que expressam CD56 são miogénica e capaz de formar miotubos in vitro ^10,11 .O imortalização de células miogénicas requer a transfecção sequencial de dois genes ^12,13 (como esquematizado na Figura 3). Ciclina dependente Kinase 4 (CDK4) é usado para superar o estresse da cultura de tecidos, devido às condições de cultura inadequados e telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) impede o encurtamento do telômero devido ao fenômeno replicação final ^12. Ambos os plasmídeos pré-virais estão no esqueleto do vector pBabe. A construção de ADNc de rato CDK4 contém o gene de resistência à neomicina e de ADNc da hTERT construção contém o gene de resistência à higromicina. Esta última contém igualmente uma cassete de Vírus Herpes Simplex timidina quinase (TK) e locais loxP colocadas em ambas as extremidades da cassete de hTERT / TK. Isto permite que a excisão de toda a unidade de expressão pela recombinase Cre ¹⁴ e contra-selecção utilizando ganciclovir.

Células imortalizadas pode ser mantido como um recém população onde os vírus são integrados em diferentes locais, ou clonado, para obter um fundo completamente homogéneo genética (inserção única no genoma da célula e a sua progénie). Na maioria dos casos, o isolamento de clones a partir de uma população principal irá resultar em pequenas diferenças entre clones, dependendo da inserção da cassete no genoma da célula. Além disso, a grande cultura de tecido vai favorecer a seleção de células com vantagem de crescimento, em vez do que os que se diferenciam. EUsolation de clones individuais é feito simplesmente por sementeira de células a uma densidade baixa (por exemplo: 300 a 500 células em placas de 10 cm) e cultivar durante cerca de duas semanas até que colónias pequenas são formadas células (10-20). A maior parte do meio é em seguida removido, deixando apenas uma película fina para evitar que as células de secar. Clones são tripsinizadas usando anéis de clonagem e depois expandida conforme necessário. Os clones expandidos imortalizadas pode ser testado para a expressão de marcadores de células miogénicas comuns, tais como CD56 por FACS, desmina e expressão MyoD por imunofluorescência, ou mediante formação de miotubos diferenciação. Miotubos são mais evidentes quando as células miogénicas confluentes (90% de confluência) são colocados em meio de diferenciação (DMEM e Meio 199 numa proporção de 4: 1, suplementado com 2% de soro de cavalo) após 3-5 dias (Figura 4). Não foram observadas diferenças em miotubo formação e em miotubo capacidade de contração entre as células de controle não-imortalizadas e células imortalizadas (Vídeos 1 e 2).

(Figura 5). Exemplos de curvas de crescimento são apresentadas na Figura 5A, onde encurtamento dos telómeros foi observado como as células foram expandidas em número alargado de passagens. Por outro lado, a imortalização de sucesso é associada com um aumento da actividade de telomerase (Figura 5)

Figura 1:.. Ilustrações de passos críticos para a dissociação de tecido muscular humana primária (a) Pesagem da placa de cultura de vazio, antes da colocação do tecido e (B) após a colocação do tecido (C) bisturis estéreis são usados ​​para picar o tecidos, até que (D) o tecido queauto é reduzido a uma pasta. A colagenase e dispase são adicionados e o tecido é digerido durante 45-90 min, em seguida, a digestão é filtrada através de um filtro de malha de nylon para eliminar detritos (E, F). (G, H) exemplos de células recentemente dissociados plaqueadas imediatamente após dissociação (L ) ou 3 horas depois de dissociação, quando as células primárias começar a resolver (H).

Figura 2:. Fluxo de trabalho dos processos envolvidos na coloração de mioblastos humano antes da purificação através de fluorescência classificador de células activadas Os passos críticos para a coloração de células humanas antes da análise FACS são realçados. Exemplos de parcelas de FACS são também mostrados. O controlo negativo (painel da esquerda) é usada para estabelecer o portão de triagem. Nos painéis da direita, células positivas que expressam CD56 são fechadas ea percentage de células positivas é mostrado. Esta estratégia pode ser utilizada para purificar células miogénicas, quer antes ou após a imortalização procedimento imortalização.

Figura 3: Esquema do vírus para produção de mioblastos de imortalização. Fluxo de trabalho da produção retrovírus utilizado para imortalizar mioblastos. Uma construção de plasmídeo contendo a cassete de CDK4 ou hTERT-TK floxed em uma espinha dorsal pBabe (esquerda) é transfectado para a ecotrópico Phoenix (PE) A linha celular de empacotamento durante a noite (8-12 horas) utilizando PolyJet. O sobrenadante é então transferido depois da filtração para a linha celular de empacotamento anfotrópico Phoenix (PA317). O sobrenadante destas células pode ser utilizado directamente ou as células podem ser seleccionadas com higromicina ou a neomicina ou para gerar uma linha celular estável para uso futuro. Alíquotas da filtrado sobrenadante pode ser armazenada a -80 ° C para uso posterior (com uma perda de 50% de eficiência). Lixívia é usada para limpar cada consumível usados ​​em todos os pontos do processo.

Figura 4:. Esquemática do reversível imortalização de mioblastos de fluxo de trabalho do processo de imortalização (em cima): As células primárias são primeiro transfectadas com CDK4. Após selecção de neomicina, os mioblastos são transfectadas com uma cassete de hTERT floxed contendo dois marcadores de selecção; HSV-TK e higromicina. Se desejar em um momento posterior, a cassete hTERT pode ser "floxed" por expressar Cre recombinase e selecionando para a excisão com ganciclovir. Isso permite que o "re-mortalization" dos mioblastos e o re-início de encurtamento dos telômeros. Se os telômeros são 20 kb de comprimento, este ainda permite centenas de duplicações, e evita t ele complicação da sobre-expressão de hTERT. Finalmente, os clones isogénicas da população imortalizada pode ser isolado. O myogenicity das células recém-imortalizadas pode ser representada utilizando marcadores específicos de células musculares, como por desmina (painel inferior esquerdo, as células em meio de crescimento corados com anti-desmina, clone D33, verde). Este clone é tão miogênica que células diferenciadas são vistas mesmo se as células são mantidas em condições de proliferação. Quando as células se diferenciam em meio de diferenciação (com 2% de soro de cavalo, meio e painéis à direita) miotubo formação torna-se muito grande. Quase todas as células marcadas com o anticorpo MF20 a cadeia embrionário miosina pesada (verde) e myotubes ter vários núcleos de coloração DAPI (azul, todas as imagens). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Verificação do processo de imortalização. (A) curvas de crescimento de clones de isogénicas de mioblastos primários, população imortal (mioblastos de hTERT-CDK4) e clone re-mortalized (mioblasto floxed hTERT-CDK4) são mostrados como exemplos. Não houve diferenças nas taxas de crescimento eram detectáveis ​​antes de as células alcançar a senescência. Encurtamento dos telómeros foi monitorado como uma função de duplicações da população e o comprimento dos telómeros foi medida por TRF. (B) mioblastos TRF mostrados são exemplos de pontos de tempo iniciais e finais de replicação em mioblastos (5 pontos de tempo a partir de DP 13 e 75), após a re-mortalized excisão de hTERT (3 pontos de tempo a partir de PD 62-152) e mioblastos imortalizadas (PD 75 e 200). (C) Infecção de hTERT bem sucedido se traduz num aumento da actividade da telomerase. A actividade de telomerase foi avaliado por ddTRAP (ddTRAP leitura, à direita; quantificação do doseamento, esquerda) ¹⁵ em células antes e após HTEInfecção RT. hTERT excisão aboliu a actividade da telomerase para o limiar inicial visto em mioblastos. Os resultados são apresentados como produtos de telomerase total gerado por equivalente celular (fundo corrigida). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Vídeos 1 e 2. Miotubos foram gerados a partir de células antes e após o processo de imortalização. As células foram cultivadas até à confluência em meio de crescimento e ligado aos meios de diferenciação durante 10 dias. Em ambos os vídeos, as contrações funcionais de um ou mais myotubes são detectáveis. Gravação do espasmos espontâneosfoi feito usando uma lente de 20X. Não foram observadas diferenças entre as células imortalizadas e não imortalizadas.

Discussion

Células como um recurso útil

O isolamento e cultura de populações de células miogênicas é extremamente útil quando estabelece fenótipos da doença ou em modelos in vitro de doença. O procedimento de isolamento de células miogénica descrito aqui permite o isolamento de fibroblastos a partir de mioblastos e amostras do músculo esquelético, o que pode, em seguida, ser propagadas, diferenciados, ou imediatamente analisadas. Estrutura e função de mioblastos pode ser avaliada através de exame microscópico, a avaliação da sobrevivência celular, a avaliação da fusão celular, ou por meio de estudos moleculares de RNA ou expressão da proteína. Além disso, os mioblastos podem ser diferenciados em myotubes que compartilham muitas características de fibras musculares imaturas, o que permite a avaliação direta da função de mioblastos no contexto do desenvolvimento muscular e recuperação após dano tecidual. Apesar de todos estes fenótipos tendem a ser bastante reprodutível em passagens precoces de células miogénicas, o comportamento de muitos m primáriolinhas celulares yogenic pode ser alterada ao longo de muitas passagens. Como resultado, é por vezes desejável para imortalizar uma dada linha celular miogénica (como descrito aqui), o que pode facilitar o estabelecimento de facilidade de cultura e a geração de resultados reproduzíveis durante um longo período de tempo.

Seleção de populações de células específicas

Este protocolo descreve o isolamento de células miogénicas do tecido muscular esquelético de FACS utilizando, como um esquema de purificação. A estratégia proposta de selecção de células incluem a utilização de iodeto de propídio (um indicador de células mortas) e CD56 (um marcador de células miogénicas), para diferenciar as células miogénicas vivo de células mortas, detritos e células não miogénicas. As células presentes na população CD56 positivo incluirá progenitores miogênicos capazes de miotubos formando, enquanto a população CD56 negativo irá incluir células não miogênicas, incluindo fibroblastos e células possivelmente adipog�icas. Cada uma destas fracções podeindependentemente ser cultivadas para produzir culturas de células de fibroblastos ou os mioblastos, e o potencial para estabelecer culturas de células de fibroblastos paralelas pode ser útil para células ou bancário ADN exercícios independentes ou condições de controlo, tal como ensaios adicionais para serem realizados em culturas de células miogénicas. Existem várias opções para a selecção de culturas de células fibroblásticas e mioblásticas específicos de tecido muscular digerido, nos casos em que é indesejável separação por FACS ou não disponível, que são descritos noutro local ^16,17. Um método alternativo para separar as células fibroblásticas mioblásticas e envolve a utilização de propriedades de adesão diferencial entre estes dois tipos de células para enriquecer passagens sucessivas de células para um dado tipo de célula. Como fibroblastos aderir ao plástico muito mais facilmente do que os mioblastos, permitindo que as suspensões celulares a incubar em plástico durante cerca de 1 h ao estabelecer ou passagem das células e depois do plaqueamento se o sobrenadante sobre um prato diferente irá result na remoção de muitos fibroblastos a partir da suspensão de células ^18.

Utilidade Os fibroblastos Mioblastos vs.

As biópsias musculares de pacientes são normalmente utilizados para a purificação de células primárias de músculo, no entanto mioblastos doentes não podem proliferar de forma eficaz e apenas pode submeter-se a um pequeno número de divisões in vitro, exigindo, assim, a imortalização de células para alcançar o elevado número de divisões necessárias. Tendo em conta que ambos os fibroblastos e mioblastos pode ser isolado a partir de biópsias musculares, ambas as frações celulares devem ser guardados a partir de amostras de pacientes, como ambos podem ser úteis e oferecem muita versatilidade para aplicações a jusante. Por exemplo, os fibroblastos podem ser utilizados para a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs), que são muito promissoras para gerar números ilimitados de células e o potencial de ser induzidas para se diferenciarem em várias linhagens celulares. Estas características são desejáveis ​​para as células obtidas a partir de pacientes com doenças raras, que podem potencialmente ser corrigidos in vitro ou utilizados em exames de drogas experimentais em busca de compostos terapêuticos. Mioblastos imortalizadas também pode ser utilizada no rastreio de drogas à base. Os fibroblastos também pode ser eficazmente convertida para um destino miogénica por infecção com um vírus expressando MyoD ^19-21. Este método tem sido testado de forma eficaz usando fibroblastos extraídos a partir de pacientes com doenças musculares e confirmou que os fibroblastos que expressam MyoD pode efectivamente formar miotubos que expressam proteínas musculares maduras. Assim, ambos os tipos de células podem ser eficazmente utilizados em várias aplicações a jusante e fornecer material de valor inestimável para estudos de diagnóstico e terapêuticos.

Impacto da Imortalidade

A imortalização de células diplóides normais, permite preparar uma linha celular humana estável que pode ser totalmente caracterizado e estudada por muitos laboratórios diferentes. As culturas primárias a partir independenteisolamentos pode variar e a sua capacidade proliferativa geral pode ser variável quando o dano é introduzido no processo de dissociação, ou por overdigestion, o que pode distorcer o comportamento de uma cultura. A imortalização de células, utilizando a expressão da subunidade catalítica da telomerase (hTERT) tem a vantagem de manter um fenótipo celular estável e células permanecem diplóide. Há relatos em ratos que telomerase podem modular a via Wnt ^22. Não observamos este fenómeno em células humanas. No entanto, para evitar esta complicação potencial, a cassete de hTERT foi flanqueada com locais lox, de modo que ele pode ser removido após ter sido alongado telómeros. Telômeros longos conferir centenas de divisões extras, geralmente suficiente para realizar a maioria dos experimentos.

Porque expansão celular contínua sempre proporciona uma vantagem seletiva para o crescimento rápido, o fenótipo celular ocasionalmente pode se tornar tendenciosa devido ao crescimento excessivo dos mais rapidamente dividindoAs células, em vez de os melhores células de diferenciação. Embora isso ainda não foi provado ser um problema significativo utilizando o método descrito, pode ser remediada por descongelamento de células que tenham sido congeladas cedo na história da cultura ou por selecção clonal das células que exibem o fenótipo desejado.

Por fim, enquanto a expansão das células miogénicas para próximos números ilimitados tem vantagens para o rastreio de drogas e possível modelação da doença, as técnicas actuais também têm desvantagens intrínsecas que impedem a utilização destas células como veículos terapêuticos em terapia baseada em célula, ou ferramentas de diagnóstico como primários. Tanto a extenso em cultura in vitro e imortalização passos alterar o fenótipo de células de músculo em relação ao seu estado nativo. É importante ressaltar que essas células são expandidas em um ambiente que é muito diferente do meio natural das células satélites primário dentro de seu nicho. Portanto, as células imortalizadas exigir testes de segurança intensa e possivelmente desenvolvimento de novas técnicas para poderem ser re-introduzida no músculo do paciente humano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010