De protokoll beskriver två in vitro utvecklingstoxicitets testsystem (UKK och UKN1) bygger på mänskliga embryonala stamceller och transkriptom studier. De testsystem förutse fosterskadande effekter fara människa, och kan bidra till att minska djurstudier, kostnader och den tid som krävs för kemisk säkerhetstester.
Effektiva protokoll för att skilja mänskliga pluripotenta stamceller till olika vävnader i kombination med omik teknik öppnat nya horisonter för testning in vitro toxicitet potentiella läkemedel. Att ge en solid vetenskaplig grund för sådana analyser är det viktigt att få kvantitativ information om tidsförloppet för utveckling och om de underliggande regleringsmekanismer av systembiologiska metoder. Två analyser har därför ställts in här för dessa krav. I UKK testsystem, är mänskliga embryonala stamceller (hESC) (eller andra pluripotenta celler) kvar att spontant differentierar under 14 dagar i embryoidkroppar, för att möjliggöra generering av celler hos alla tre groddblad. Detta system rekapitulerar de viktigaste stegen i människans tidiga embryonal utveckling, och det kan förutsäga humanspecifik tidig embryonal toxicitet / teratogenicitet, om celler exponeras för kemikalier under differentieringen. Det UKN1 testsystem bygger på hESC differentiering till en population av neuroektodermal progenitorceller (NEP) celler under 6 dagar. Detta system rekapitulerar tidigt neurala utveckling och förutspår tidigt utvecklingsneurotoxiska och epigenetiska förändringar utlöses av kemikalier. Båda systemen, i kombination med transkriptom microarray studier, är lämpliga för att identifiera toxicitet biomarkörer. Dessutom kan de användas i kombination för att generera indata för systembiologi analys. Dessa testsystem har fördelar jämfört med de traditionella toxikologiska studier som kräver stora mängder av djur. De testsystem kan bidra till en minskning av kostnaderna för läkemedelsutveckling och utvärdering kemikaliesäkerhet. Deras kombination belyser speciellt på föreningar som kan påverka nervsystemets utveckling specifikt.
Förmågan hos humana embryonala stamceller (hESC) att differentiera till olika typer av celler öppnat en ny era av testning in vitro toxicitet 1, sjukdom modellering och regenerativ medicin 2. Stamcellerna begåvats med förmågan att självreplikera, för att hålla sin pluripotent tillstånd, och att differentiera till specialiserade celler 3,4. Egenskaperna hos hESC (förmåga att differentiera till alla större celltyper) återfinns också i andra humana pluripotenta stamceller, såsom mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) eller celler som genereras av kärnöverföring 5. Till exempel har många olika hESC linjer differentierats till neuroner 6, njurceller 7, neurallist celler 8 cardiomyocytes 9-12, eller hepatocyter som celler 13,14. Dessutom hESC kan spontant differentiera till celler från alla tre germinallager 15-18 i embryoidkroppar (EBS) 19,20. EArly embryonal utveckling regleras genom differentiell expression av olika gener relaterade till de olika groddblad som har fångats på mRNA-nivå genom transkriptomik använder microarray-teknik 15. Dessa ansträngningar resulterade i upprättandet av organspecifika toxikologiska modeller baserade på hESC / hiPSC och transkriptomik analys (för en översikt se 21,22). Dessa modeller har fördelar jämfört med den traditionella användningen av försöksdjur för toxikologiska studier, som prekliniska studier med försöksdjur är inte alltid är prediktiva för människors säkerhet. Läkemedels inducerade toxicitet påträffas hos patienter är ofta relaterade till metabola eller signaleringsprocesser som skiljer sig mellan människor och försöksdjur. Skillnaden arter har hindrat tillförlitlig tidig upptäckt av fosterskadande effekter hos människor, och till exempel läkemedel såsom talidomid 23,24 och dietylstilbestrol 25,26 drogs tillbaka från marknaden på grund av fosterskada. Thalidomide har inte visat någon utvecklingstoxicitet hos råttor eller möss. Miljö kemikalier, såsom metylkvicksilver 27 resulterade i prenatal utvecklingstoxicitet med avseende på nervsystemet i olika arter, men mänskliga yttringar har varit svårt att modellera i djur. För att lösa problemet med artspecificiteten frågor, forskare som arbetar under olika projekt baserade på stamceller som ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. är engagerade i utvecklingen av olika modeller för embryonal toxicitet, neuro kardiotoxicitet, levertoxicitet och nefrotoxicitet använder mänskliga gifter misstänks påverka människan. Enligt det europeiska konsortiet projektet "embryonala stamceller baserad roman alternativa testmetoder (ESNATS) fem testsystem har etablerats. Ett testsystem den så kallade UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsystem delvis fångar människans tidiga embryots utveckling. I detta sYSTEM mänskliga embryonala H9-celler differentieras i tre germinallager (ektoderm, endoderm och mesoderm) 15 och GRODDBLAD specifika signaturer har fångats av transkriptomik profil att använda Affymetrix microarray-plattform. Olika utvecklings toxikanter som talidomid 28, valproinsyra, metylkvicksilver 16,17, eller cytosinarabinosid 15 har testats i detta system, och det toxiska specifik gen signaturer har erhållits. I ett andra test-system, det så kallade UKN1 (U niversity K Önsta n ^) testsystem 1 är H9-celler differentierade för att neuroektodermala progenitorceller (NEP) och 6 dagar. Detta bevisas av högt uttryck av neurala genmarkörer såsom Pax6 och OTX2. Under differentiering för 6 dagar, har NEP-celler exponerats för utvecklingsstörningar neuro-toxiska ämnen, såsom VPA, metylkvicksilver. Gift-specifika avreglerade transkriptomik profiler har varit obtained samt genom att använda Affymetrix microarray plattformen 16,29.
Den nya visionen för toxikologi av 21-talet räknar man med att testsystem inte bara ge fenotypiska beskrivningar som histopatologi in vivo, eller transkriptom förändringar i slutet av långsiktiga gift inkubationer. Det tyder snarare att analyser ger mekanistiska uppgifter 3, och att denna information kan kopplas till så kallade negativa resultatvägar (AOP) som ger en vetenskaplig motivering för farliga effekter 30. Att lämna sådan information, de testsystem som används måste vara mycket kvalitetsgranskade 31, såsom exempelvis dokumenteras genom robusta standardrutiner. Dessutom, tidsberoende förändringar måste kartläggas med hög upplösning. Detta kräver testsystem med synkroniserade ändringar 32. De UKN1 och UKK testsystem som beskrivs här har optimerats för dessa krav.
Traditionella metoder för toxikologiska tester innebär omfattande djurstudier vilket gör att testa kostsamt och tidskrävande. Dessutom, på grund av skillnader mellan arterna de prekliniska djursäkerhetsstudier är inte alltid gäller att förutsäga toxiska effekter av potentiella läkemedel som är relevanta för människor. Även icke-mänskliga primater är mest förutsägbara, fortfarande stark etisk och socioekonomiska krav snabbt höja med det moderna samhället för att utveckla känsliga och robust in …
The authors have nothing to disclose.
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
DMSO | Sigma | D-2650 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
EDTA | Roth | 8043.2 | |
FBS | PAA | A15-101 | |
FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
PBS | Biochrom AG | L1825 | |
Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
List of Kits | |||
RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
List of equipment. | |||
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
List of softwares | |||
Prism 4 | |||
Affymetrix GCOS | |||
Partek Genomic Suite 6.25 | |||
Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |