Rotte model af fotokemisk-induceret posterior iskæmisk opticusneuropati

Summary

Målet med denne protokol er at fotokemisk fremkalde iskæmisk skade på bageste synsnerven hos rotter. Denne model er afgørende for undersøgelser af patofysiologien af ​​posterior iskæmisk optisk neuropati, og terapeutiske metoder til denne og andre optiske neuropatier, såvel som af andre CNS-iskæmiske sygdomme.

Abstract

Posterior iskæmisk opticusneuropati (PION) er en sight-ødelæggende sygdom i klinisk praksis. Imidlertid har sin patogenese og naturhistorie forblev dårligt forstået. For nylig udviklede vi en pålidelig, reproducerbar dyremodel for PION og testet behandling virkningen af nogle neurotrofiske faktorer i denne model ^1. Formålet med denne video er at vise vores fotokemisk induceret model af posterior iskæmisk opticusneuropati, og evaluere dens virkninger med retrograd mærkning af retinale ganglieceller. Efter kirurgisk eksponering af den bageste synsnerven, et fotosensibiliserende farvestof, erythrosin B, injiceres intravenøst, og en laserstråle fokuseres på synsnerven overflade. Fotokemisk interaktion af erythrosin B og laseren under bestråling skader det vaskulære endotel, hvilket fik mikrovaskulær okklusion medieret af blodplader trombose og edematous komprimering. Den resulterende iskæmisk beskadigelse giver en gradvis, men pronounced retinal ganglion celle skovdød som følge af et tab af axonal input - en fjernbetjening, skade-induceret og klinisk relevant resultat. Således tilvejebringer denne model en hidtil ukendt platform at undersøge patofysiologiske løbet af PION, og kan optimeres yderligere til afprøvning terapeutiske tilgange til optiske neuropatier samt andre CNS iskæmiske sygdomme.

Introduction

Hos patienter over 50 år gamle, optisk iskæmisk neuropati (ION) er den mest udbredte form for akut optisk neuropati ^2. Tilstanden kan vise sig som en af to undertyper ifølge kilden til de specifikt berørte blodforsyning og klinisk præsentation: anterior (AION) eller posterior (PION) ^3. Mens patogenesen og forløb af AION er blevet undersøgt grundigt ^4-7, har PION forblev dårligt forstået på grund af sin lave forekomst, variable præsentation, dårligt definerede diagnostiske kriterier og mangel på en dyremodel. Desuden har ingen behandlinger vist sig effektivt at forebygge eller reversere synstab fra AION eller PION. Derfor er en reproducerbar og pålidelig dyremodel for PION er af stor værdi at studere sygdomsprocessen in vivo og afprøve nye terapeutiske regimener til neurobeskyttelse og Axon regenerering.

Fotokemisk induceret iskæmisk skade mikrovaskulaturen resulterer i vasogENIC ødem og trombose effektivt skaber regional vævsiskæmi ^8-12. Efter injektion i det vaskulære cirkulation, den lysfølsomme farvestof erythrosin B producerer reaktive singlet molekylært oxygen ved aktivering af laserbestråling af target fartøjer. Singlet oxygen direkte peroxidizes det vaskulære endotel, stimulering af blodplader adhærens / aggregering og fører til okklusiv thrombedannelse. Iskæmisk skade spredes til tilstødende områder og yderligere forværret af mikrovaskulære kompression grundet vasogent ødem. Det overordnede mål med denne protokol er at fotokemisk fremkalde iskæmi i retrobulbær synsnerve at spejle skader forårsaget af PION.

Så vidt vi ved, er dette den første model af iskæmisk beskadigelse i den bageste synsnerve ^1. Da denne model producerer iskæmi samtidig undgå fysiske traumer, de fysiologiske processer af posterior iskæmisk opticusneuropati er bedre efterlignes og studerede. Også, tilbyder denne model en roman platform til screening af kandidat terapeutiske midler til optiske neuropatier og andre CNS-iskæmisk sygdom. Her er en detaljeret protokol for femorale vene kateterisation, synsnerven eksponering, intravenøs injektion af erythrosin B og laserbestråling i en rotte PION beskrevne model.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of California San Diego og University of Miami institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC) og udføres i overensstemmelse med den ARVO Redegørelse for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Visual Research. Alle reagenser og instrumenter, der anvendes i kirurgiske procedurer er sterile.

1. bedøve og Forbered rotte for Kirurgi

1. Før proceduren, rotter bedøvet med en intraperitoneal injektion af ketamin (60 mg / kg) og xylazin (8 mg / kg) i forhold til legemsvægten. Tilstrækkelig dybde af anæstesi bør bestemmes af et negativt svar til tå knivspids stimulus.
2. Når bedøvet, trække tungen frem til at forebygge asfyksi og anvende smørende salve til begge øjne for at forhindre udtørring af hornhinder under operationen.
3. Barbere de kirurgiske steder ved hjælp af en hårklipperen og tør området tre gange med 10% providon-jod rengøringsmiddel og 70% ethanol.
4. Drape tHan dyr inden for et sterilt område. Sterile handsker og kirurgiske instrumenter anvendes under overlevelse kirurgi. Re-sterilisere spidserne af instrumenter ved hjælp af en varm perle sterilisator mellem dyr.

2. Kirurgisk Approach

1. PION induktion
   1. Femorale vene kateterisation
      1. Forbered og rengør operationsstedet. Barbere den rigtige inderlåret ved hjælp af en hårklipperen og tør området tre gange hver med 10% providon-jod rengøringsmiddel og 70% ethanol.
      2. Forbered slangen. Skær en 40cm længde polyethylenrør (PE 10) steriliseret i 70% ethanol. Skyl slangen med saltvand og tilslut den til en 1 ml sprøjte indeholdende en forud målt opløsning af 2% erythrosin B farvestof (1 gl / mg, hvilket giver en dosis på 20 mg / kg legemsvægt). Monter sprøjten i en mund- switch kontrolleret infusionspumpe indstillet til en hastighed på 600 ul / min.
      3. Ved hjælp af en nr 15 klinge, lave et lille vandret snit påbunden af ​​højre lår. Klip og sprede membranen inde og rengøre området med sterile vatpinde.
      4. Adskil musklen med pincet indtil gren af ​​femorale vene er synlig. En kappe omgiver arterien, vene og nerve. Klem og trække dette kappe opad med pincet (fin-tip Dumont tang), og skære et lille snit (2-4 mm er normalt tilstrækkeligt) nær bunden af ​​trekantformede wedge med Vännäs foråret saks. Udvid snittet som nødvendigt.
      5. Adskil venen og arterien med en stump mikrokirurgisk hook parallelt med retningen af ​​venen. Pas på ikke at beskadige de fine membran og vene grene. Derefter forsigtigt løfte venen og adskille den fra det underliggende bindevæv.
      6. Anskaf en nål nylon sutur og placere den ved siden af ​​den femorale vene. Brug af mikro-kirurgiske krog, ophøje venen og videregive de fine spids pincet under distale område. Få den ene ende af suturen og trække den undervene. Ligere den distale vene stramt. Passere en anden sutur på en lignende måde under proximale vene og gøre en løs knude.
      7. Lav et lille snit i venen nær den distale ligatur med Vännäs foråret saks. Udvid hullet efter behov med de fine spids pincet. Noget blod kan lække gennem udskæringen. Rens kirurgiske område med koldt, sterilt BSS og sterile vatpinde.
      8. Holding venevæggen på kanten af ​​snittet, selvkaterisation skibet med den forberedte saltvand-skyllet slange ved hjælp af en nål holder. Spænd proximale knude omkring venen og slange. Derefter forankre slangen ved at binde den til den distale sutur.
      9. Kontroller kvaliteten af ​​kateterisation ved at trykke på mund- switch at indsprøjte saltvand, <1 ml er passende. Sørg for, at slangen er uhindret og har ingen utætheder. Midlertidigt lukke snittet med suturer at beskytte kateterisation og væv.
   2. Eksponering af synsnerven
      1. Prepare operationsstedet ved at tørre præ-barberet området over venstre øje tre gange hver med 10% providon-iod rengøringsmiddel, og 70% ethanol.
      2. Lave et snit langs huden 2-3 mm bag øjet med en No. 15 blad. Klem og løft bindevæv med savtakkede pincet, og lave et lille snit med Vännäs foråret saks. Denne lille snit er generelt ca. 5 mm i længden, men kan være længere for at give større eksponering for en kirurg under uddannelse. Fortsæt med at ligeud dissekere gennem bindevæv langs overlegne rand af orbital ben, idet man undgår at forstyrre blodkar. Rens kirurgiske område med vatpinde.
      3. Dissekere nedad gennem bindehinden, indtil den øvre rectusmuskel er synlig. Knib og dissekere gennem musklen; musklen vil blive frigjort fra dybt inde i kredsløb. Nu kan omgivende væv anvendes til at hjælpe i tilbagetrækning og elevation af øjet for at lette visualiseringen.
      4. ReTract flappen af ​​hud og bindevæv sideværts og nedad, og hold på plads med en sutur og hæmostat. Dette vil rotere øjet fremad og udad med henblik på at afsløre fedtholdige kappe, der omgiver synsnerven.
      5. Derefter skubbes forsigtigt et par skarpe pincet og udvide parallelt med den optiske nerve at adskille bindevæv omkring hylsteret. Rør ikke ved synsnerven med de skarpe spidsen af ​​pincet.
      6. En 5 mm længde af synsnerven og omgivende kappe skulle nu være synlig. Et netværk af mikrokar på kappeoverfladen omkranser synsnerven. Disse vil blive rettet i laserbestråling.
   3. Intravenøs injektion af erythrosin B og laserbestråling
      1. Bær orangefarvede sikkerhedsbriller på alle tidspunkter, mens du betjener laser bestråling apparat til at beskytte dig selv fra det grønne laserlys. Tænd laseren, åbne lukkeren og juster peak og gennemsnitlig powers af laseren som nødvendigt. Luk lukkeren.
      2. Placer rotte i laser bestrålingsmåleren. For at sikre korrekt placering stråle, er en svag sigter frembragt ved rumligt filtrering laseren gennem en 100 um diameter hul boret i den lukkede lukker bladet. Re-udsætte synsnerven med et par fine spids pincet, og placer sigter strålen på intraorbital synsnerven mellem 3 mm og 4 mm bag synsnerven.
      3. Injicer opløsning af 2% erythrosin B via aktivering af infusionspumpen. Det kan cirkulere i et par sekunder, mens kirurgen tilføjer en lille dråbe BSS at fugte overfladen af ​​synsnerven.
      4. Kontrollere positionen for den sigter bjælken og klik derefter på mund- kontakten at initiere bestråling. En orange-farvede sikkerhed filter, som tilsættes til den optiske vej af mikroskopet, vil straks udløst efterfulgt af åbningen af ​​lukkeren efter en 1 sek forsinkelse.
      5. Bestråle synsnerven til 90 sek med en maksimal effekt på 135mW og gennemsnitlig effekt af 18mW produceret af en bjælke chopper roterer ved 250 Hz med et normeret forbrug på 15% (dette minimerer termiske effekter). Gul fluorescens, visualiseret som lyse orange gennem sikkerhedsventilen filter, vil blive udsendt fra den øvre overflade af synsnerven og er tilstrækkelige til at sikre, at strålen bestråler nerve symmetrisk.
      6. Efter bestrålingen, vil den orange-farvede sikkerhed filter åbnes automatisk. Microhemorrhage kan observeres i nogle tilfælde.
      7. Lindre trækkraft på de ekstra okulære muskler og returnere øjet til en neutral position. Lukke snittet med afbrudte suturer. Derefter trække kateteret og binde off lårvenen stramt for at forebygge lækage; lukke med afbrudte suturer. Påfør antibiotisk salve til begge indsnit. Kontroller fundus at kontrollere den vaskulære integritet centrale nethindeåre og arterie.
2. Retrograd Mærkningaf retina-ganglieceller (RGC'er.) Bemærk: For at vurdere RGC overlevelse, retrograd mærkning med Fluorogold (FG) skal være afsluttet en uge før PION. Metoden er beskrevet i detaljer i JOVE protokol 819 ^13.
   1. Kort sagt: bedøver dyret med ketamin (60 mg / kg) og xylazin (8 mg / kg) og barbering hovedet.
   2. Kirurgisk krat incisionssted og gøre en midtlinjeincision i hele hovedet for at blotlægge kraniet.
   3. Bor bilaterale huller gennem kraniet (Ø 2x2 mm) 0,5 mm fra både det sagittale og tværgående suturer.
   4. Aspirere forsigtigt cerebral indhold, der ligger i den dorsale overflade af den overlegne colliculus (SC) anvendelse af en vakuumpumpe. Derefter placere et lille stykke gelskum gennemvædet med 4% FG på overfladen af ​​SC.
   5. Luk snittet med suturer og omsorg for dyret ved hjælp af standard postoperativ pleje.
3. Postoperativ pleje og Eutanasi
   1. Efter operationen, placere dyr i en separat ren bur oven på en recirkulerende vand opvarmet pude, indtil dyret udvindes.
   2. Post-kirurgiske analgetika (buprenorphin HCI, 0,01 mg / kg) administreres to gange om dagen i tre på hinanden følgende dage for at minimere ubehag.
   3. Rotte bør holdes adskilt, og observeret, indtil de er i stand til at opretholde brystleje og genvinde tilstrækkelig bevidsthed.
   4. Tegn på opsving og et godt helbred overvåges dagligt i mindst 5 dage efter operationen, eller indtil sutur fjernelse og tilstrækkelig heling af operationsstedet, alt efter hvad der indtræffer senest.
   5. Aflive dyrene ved perfusion med 4% PFA på videnskabeligt passende tidspunkter efter operationen ifølge efterforskningsmæssige interesse.

Representative Results

Den resulterende iskæmisk læsion induceret af denne teknik giver en gradvis, men markant død retina-ganglieceller efter Axon iskæmisk skade. Dette er en klinisk relevant resultat svarer til det observerede i den menneskelige sygdom. FG retrograd mærkning anvendes til at kvantificere RGC overlevelse efter PION. Samme metode anvendes til at validere en vellykket gennemførelse model samt at vurdere virkningerne af forskellige behandlingsregimer. Figur 1 viser repræsentative konfokale billeder af FG-positive celler i retinale flade mounts fra kontrol (figur 1A), sham-behandlede (laser kun / nej erythrosin B, figur 1B), og 2 uger efter PION-behandlede (Figur 1C) dyr. Sammenlignet med kontroldyr, er færre FG-positive celler til stede i dyr 2 uger efter PION induktion. Observeres ingen signifikant forskel mellem antallet af RGC'er i kontrol og sham-behandlede (laser kun / ingen erythrosin B) dyr. This angiver, at PION-induceret RGC tab fremkaldes ved kombinationen af ​​erythrosin B og laserbestråling, i stedet for termisk energi fra laseren alene.

Figur 1. Retinal ganglion celle (RGC) overlevelse efter posterior iskæmisk opticusneuropati (PION). Retina-ganglieceller retrogradt mærket med Fluorogold blev afbildet i retinale flade mounts (AC). To uger efter PION, er et tilsvarende antal RGC'er observeret i kontrol (A) og sham-behandlede (B, laser kun / ingen erythrosin B) øjne. Imidlertid er antallet af Fluorogold-mærkede RGC'er markant reduceret i fastsættelsen af PION (C). Skala bar = 100 um. Klik her for at se et større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless