Medicine

מודל עכברוש של אחורי איסכמי אופטי נוירופתיה המושרית photochemically

Published: November 29, 2015 doi: 10.3791/52402

Yan Wang^1,3,4, Dale P. Brown¹, Brant D. Watson², Jeffrey L. Goldberg^1,3

¹Bascom Palmer Eye Institute, University of Miami Miller School of Medicine, ²Departments of Neurology and Biomedical Engineering, University of Miami Miller School of Medicine, ³Shiley Eye Center, University of California, ⁴Department of Ophthalmology and Vision Science, Fudan University

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לגרום לפגיעת איסכמית photochemically לעצב הראייה האחורי בחולדה. מודל זה הוא קריטי ללימודים של הפתופיזיולוגיה של נוירופתיה אופטית איסכמית אחורית, וגישות טיפוליות לזה ונוירופתיה אופטית אחרת, כמו גם במחלות של מערכת העצבים המרכזית איסכמי אחרות.

Abstract

נוירופתיה האחורית איסכמי האופטי (פיון) היא מחלה הרסני ראייה בפרקטיקה קלינית. עם זאת, פתוגנזה שלה וההיסטוריה הטבעית נשארו הבינו היטב. לאחרונה, פיתחנו מודל אמין, לשחזור בבעלי חיים של פיון ובדק את השפעת הטיפול של גורמי neurotrophic מסוימים במודל זה ^1. המטרה של הווידאו הזה היא להדגים המודל המושרה photochemically של נוירופתיה אופטית איסכמית אחורית, ולהעריך את השפעותיו עם תיוג מדרדר של תאי הגנגליון ברשתית. בעקבות חשיפה כירורגית של העצב האופטי האחורי, צבע photosensitizing, erythrosin B, מוזרק לוריד ועל פני השטח עצב הראייה קרן לייזר ממוקדת. האינטראקציה פוטו של erythrosin B והליזר בניזקי קרינת האנדותל של כלי הדם, מה שגרמו לחסימת כלי דם בתיווכו של פקקת טסיות דם ודחיסת בצקים. פגיעת איסכמית וכתוצאה מכך תשואות הדרגתית אך pronouncאד dieback תא הגנגליון ברשתית, בשל אובדן קלט אקסונים - מרוחק, הנגרמת על-פגיעה ותוצאה רלוונטית מבחינה קלינית. לפיכך, מודל זה מספק פלטפורמה חדשנית ללמוד קורס pathophysiologic של פיון, ויכול להיות מותאם יותר לבדיקת גישות טיפוליות לנוירופתיה אופטית כמו גם מחלות של מערכת העצבים המרכזית איסכמי אחרות.

Introduction

בחולים מעל גיל 50 שנים, נוירופתיה אופטית איסכמית (ION) הוא הסוג הנפוץ ביותר של אופטית החריף נוירופתיה ^2. המצב יכול להציג כאחד משני תת-סוגים לפי מקור אספקה ספציפית מושפעת דם והצגה קלינית: קדמי (AION) או אחורי (פיון) ^3. בעוד פתוגנזה וכמובן של AION נחקרו רב ^4-7, פיון שנשאר הבין היטב בשל השכיחות נמוכה, ההצגה משתנה, הקריטריונים שלה לא מוגדר אבחון וחוסר במודל חיה. יתר על כן, אין טיפולים הוכחו כדי למנוע או להפוך אובדן ראייה מAION או פיון ביעילות. לכן, מודל חיה לשחזור ואמין של פיון הוא בעל ערך רב ללמוד את תהליך המחלה in vivo ולבדוק משטרים טיפוליים חדשים לneuroprotection והתחדשות האקסון.

Photochemically מושרה פגיעת איסכמית לנימי הדם הזעירה וכתוצאה מכך vasogבצקת enic ופקקת ביעילות יוצרים איסכמיה רקמות אזוריות ^8-12. לאחר הזרקה למחזור הדם בכלי הדם, erythrosin צבע B רגיש מייצר חמצן תגובתי גופייה מולקולרית על הפעלה על ידי הקרנת לייזר של כלי יעד. חמצן הגופייה ישירות peroxidizes האנדותל של כלי הדם, מגרה את דבקות / הצטברות טסיות דם ומוביל להיווצרות אוטמת פקיק. נזק איסכמי הוא להתפשט לאזורים השכנים והחמיר עוד יותר על ידי דחיסת כלי דם עקב בצקת vasogenic. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לגרום לphotochemically איסכמיה בעצב הראייה retrobulbar לשקף את הנזק שנגרם על ידי פיון.

למיטב ידיעתנו, זהו המודל הראשון של פגיעת איסכמית בעצב הראייה האחורית ^1. כמודל זה מייצר איסכמיה תוך הימנעות טראומה פיזית, התהליכים הפיסיולוגיים של נוירופתיה אופטי איסכמית אחורית הם טובים יותר חיקו ולמדו. כמו כן, מודל זה מציע פלטפורמה חדשנית להקרנה של תרופות מועמד לנוירופתיה אופטית ומחלה איסכמית של מערכת העצבים המרכזית אחרת. כאן, פרוטוקול מפורט לצנתור הירך וריד, חשיפת עצב ראייה, הזרקה תוך ורידית של Erythrosin B וקרינת לייזר במודל פיון עכברוש מתואר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נהלי כל החיה אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו ואוניברסיטת מיאמי טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדות שימוש (IACUC) ובוצעו בהתאם להצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי. כל ריאגנטים והמכשירים המשמשים בניתוחים עקרים.

1. להרדים והכן את העכברוש לכירורגיה

לפני ההליך, חולדות מורדמים עם זריקת intraperitoneal של קטמין (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (8 מ"ג / קילוגרם) לפי משקל גוף. עומק נאות של הרדמה צריך להיקבע על ידי תגובה שלילית לגירוי קמצוץ הבוהן.
ברגע שהרדים, למשוך את הלשון קדימה כדי למנוע חנק ולהחיל סיכה משחה לשתי העיניים כדי למנוע התייבשות של הקרניות במהלך ניתוח.
לגלח את האתרים כירורגית באמצעות גוזז שיער ולנגב את האזור שלוש פעמים עם 10% תמיסת ניקוי providone-יוד ו -70% אתנול.
לא וילוןהוא החיה בתוך שדה סטרילי. כפפות סטריליות ומכשירי ניתוח משמשים במהלך ניתוח הישרדות. לעקר מחדש הטיפים של מכשירים באמצעות מעקר חרוז חם בין בעלי החיים.

2. גישה ניתוחית

אינדוקציה פיון
1. צנתור וריד הירך
  1. להכין ולנקות את האתר כירורגית. לגלח את הירך הפנימית הנכונה באמצעות גוזז שיער ולנגב את האזור שלוש פעמים כל אחד עם 10% תמיסת ניקוי providone-יוד ו -70% אתנול.
  2. הכן את צינורות. לחתוך באורך 40 ס"מ של צינורות פוליאתילן (PE 10) עיקור באתנול 70%. לשטוף את צינורות עם מי מלח ולחבר אותו למזרק 1 מיליליטר המכיל פתרון נמדד מראש של 2% erythrosin B צבע (μl 1 / מ"ג, מניב מינון של 20 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). הר המזרק לתוך משאבת עירוי רגל-מתג מבוקר נקבעה לשיעור של 600 μl / דקה.
  3. באמצעות סכין מס '15, לעשות חתך אופקי קטן בהבסיס של ירך ימין. לגזור ולהפיץ את הקרום בתוך ולנקות את האזור עם צמר גפן סטרילי.
  4. הפרד את השריר עם מלקחיים עד הסניף של וריד הירך הוא גלוי. נדן מקיף את העורק, וריד והעצב. לצבוט ולמשוך נדן זה כלפי מעלה עם מלקחיים (מלקחיים עדינים-קצה דומון), ולחתוך חתך קטן (2-4 מ"מ הוא בדרך כלל מספיק) ליד הבסיס של הטריז בצורת המשולש עם מספריים באביב Vannas. להרחיב את החתך לפי צורך.
  5. הפרד את הווריד ועורק עם מקביל וו בוטה מיקרו-כירורגית לכיוון של הווריד. היזהר שלא לפגוע בסניפי הקרום ווריד העדינים. ואז, בעדינות להרים את הווריד ולהפריד אותו מרקמות חיבור הבסיסיות.
  6. להשיג תפר ניילון מחטים ולמקם אותו בסמוך לוריד הירך. השימוש במייקרו-כירורגית הוו, לרומם את הרוח ולהעביר את המלקחיים העדין-קצה מתחת לאזור דיסטלי. תפוס את הקצה אחד של התפר ולמשוך אותו מתחת לוָרִיד. לקשור את וריד דיסטלי בחוזקה. לעבור תפר שני באופן דומה תחת הווריד הפרוקסימלי ולעשות קשר רופף.
  7. לעשות חתך קטן בווריד ליד קשירת דיסטלי עם מספריים באביב Vannas. להרחיב את החור במידת הצורך עם המלקחיים בסדר-קצה. דם מסוים עשוי לדלוף דרך החתך. נקה את אזור הניתוח עם BSS הקר, סטרילי וצמר גפן סטרילי.
  8. מחזיק קיר הווריד בקצה החתך, קטטר הכלי עם צינורות-סמוק המלוחים מוכנים באמצעות בעל מחט. להדק את הקשר הפרוקסימלי מסביב לווריד והצינורות. לאחר מכן, לעגן את צינורות על ידי קשירתו לתפר דיסטלי.
  9. בדוק את האיכות של הצנתור על ידי לחיצה על מתג הרגל להזריק מלוח, <1 מיליליטר הוא נאות. ודא צינורות הוא בלא הפרעה ואין דליפות. באופן זמני לסגור את החתך עם תפרים כדי להגן על הצנתור ורקמות.
2. חשיפה של עצב הראייה
  1. הכנהדואר האתר כירורגית ידי ניגוב אזור קדם-מגולח מעל עין שמאל שלוש פעמים כל אחד עם 10% תמיסת ניקוי providone-יוד ו -70% אתנול.
  2. עושה חתך לאורך מ"מ עור 2-3 מאחורי העין עם להב מס '15. לצבוט ולהרים את רקמת חיבור עם מלקחיים משוננים, ולעשות חתך קטן עם מספריים באביב Vannas. חתך קטן זה בדרך כלל כ -5 מ"מ אורך, אבל יכול להיות ארוך יותר כדי לספק חשיפה גדולה יותר למנתח בהכשרה. תמשיך לנתח בצורה בוטה ברקמת החיבור לאורך השפה מעולה של העצם מסלולית, לטפל כדי למנוע שיבוש כלי דם. נקה את אזור הניתוח עם צמר גפן.
  3. לנתח כלפי מטה דרך הלחמית עד שריר rectus מעולה גלוי. לצבוט ולנתח דרך השריר; השריר ישוחרר ממעמקי המסלול. עכשיו, יכולות להיות מנוצלת רקמות הסובבות כדי לסייע בנסיגה והעלאה של העין על מנת להקל על הדמיה.
  4. מִחָדָשׁבדרכי את קפל עור ורקמות חיבור רוחבי וכלפי מטה, ולהחזיק במקום עם תפר וhemostat. זה יהיה לסובב את העין קדימה והחוצה כדי לחשוף את הנדן המכיל שומן שמקיף את עצב הראייה.
  5. בזהירות להכניס זוג מלקחיים חדים ולהרחיב במקביל לעצב הראייה להפריד את רקמות חיבור המקיפות את הנדן. אל תיגע בעצב הראייה עם הטיפים החדים של המלקחיים.
  6. אורך 5 מ"מ של עצב הראייה ונדן סביב צריך עכשיו להיות גלוי. רשת של microvessels על פני השטח הנדן מקיפה את עצב הראייה. אלה יהיו ממוקדים במהלך הקרנת לייזר.
3. הזרקה תוך ורידית של Erythrosin B וקרינת לייזר
  1. יש להרכיב משקפיים בטיחות בצבע כתומים בכל העת בעת הפעלת מכשיר הקרנת הלייזר כדי להגן על עצמך מאור הלייזר הירוק. הפעל את הלייזר, לפתוח את התריס ולהתאים את השיא וpowe הממוצעRS של הלייזר במידת צורך. סגור את התריס.
  2. מקם את העכברוש במנגנון קרינת לייזר. כדי להבטיח מיקום נכון קרן, קרן מכוונת חלשה מופקת על ידי מרחבית סינון הלייזר דרך חור בקוטר 100 מיקרומטר נקדח בלהב התריס הסגור. -לחשוף מחדש את עצב הראייה עם זוג מלקחיים טיפ נאה, ולמקם את הקרן מכוונת על עצב הראייה intraorbital בין 3 מ"מ ו 4 מ"מ מאחורי ראש עצב הראייה.
  3. להזריק את הפתרון של 2% erythrosin B באמצעות הפעלה של משאבת העירוי. זה יכול לזרום לכמה שניות בזמן שהמנתח מוסיף טיפה קטנה של BSS כדי ללחלח את פני השטח של עצב הראייה.
  4. ודא את המיקום של הקרן במטרה ולאחר מכן לחץ על הרגל-המתג ליזום הקרנה. מסנן בטיחות בצבע כתום, שהוסיף לנתיב האופטי של מיקרוסקופ, יהיה מייד אחרי שחולל פתיחת התריס לאחר עיכוב 1 שניות.
  5. מכשיר את עצב הראייה ל9שניות 0 עם כוח שיא של 135mW והספק ממוצע של 18mW מיוצר על ידי מסוק קרן מסתובב ברץ 250 עם מחזור של 15% (זה ממזער אפקטים תרמיים). צהובה הקרינה, דמיין כתום בהיר דרך מסנן הבטיחות, תהיה נפלטת מפני השטח מעולה של עצב הראייה ודי בכך כדי להבטיח שהקרן irradiates העצב סימטרית.
  6. לאחר ההקרנה, מסנן הבטיחות בצבע הכתום ייפתח באופן אוטומטי. Microhemorrhage ניתן לצפות בחלק ממקרים.
  7. להקל על המתיחה על שרירי העין נוספים ולהחזיר את העין למצב ניטראלי. לסגור את החתך עם תפרים שהופסקו. אז למשוך את הקטטר ולקשור את עורק הירך בחוזקה כדי למנוע דליפה; לסגור עם תפרים שהופסקו. החל משחה אנטיביוטית לשני החתכים. בדוק את קרקעית העין כדי לוודא את תקינות כלי הדם של וריד הרשתית המרכזי והעורק.
תיוג מדרדרשל תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) הערה:. על מנת להעריך הישרדות RGC, תיוג מדרדר עם fluorogold (FG) אמורים להסתיים שבוע לפני פיון. השיטה מתוארת בפירוט בפרוטוקול יופיטר 819 ^13.
1. בקצרה: להרדים את החיה עם קטמין (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (8 מ"ג / קילוגרם) ולגלח את הראש.
2. ניתוח לשפשף את אתר החתך ולעשות חתך קו האמצע על הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
3. לקדוח חורים דו-צדדיים דרך הגולגולת (מ"מ 2x2 O) 0.5 מ"מ משני תפרי sagittal ורוחביים.
4. בזהירות לשאוב את תוכן המוחין שנמצאת מעל פני השטח הגבי של colliculus מעולה (SC) באמצעות משאבת ואקום. ואז, במקום פיסה קטנה של gelfoam הספוגה עם FG 4% על פני השטח של SC.
5. לסגור את החתך עם תפרים ולטפל בבעלי החיים באמצעות טיפול לאחר ניתוח סטנדרטי.
טיפול שלאחר ניתוח והמתת חסד
1. לאחר ניתוח, להציב חיה בכלוב נקי נפרד על גבי משטח מים הסירקולציה המחודשת המחומם עד שהחיה הוא התאוששה.
2. משככי כאבים לאחר ניתוח (עצירות HCl, 0.01 מ"ג / קילוגרם) צריכים להינתן פעמיים ביום במשך שלושה ימים רצופים כדי למזער אי נוחות.
3. עכברוש צריך להישמר בנפרד ונצפה עד שהם הצליחו לשמור על כיבו sternal ולהחזיר את התודעה מספיק.
4. סימני התאוששות ובריאות טובה מנוטרים יומיים במשך לפחות 5 ימים לאחר הניתוח, או עד להסרת תפרים וריפוי נאות של האתר כירורגית, מוקדם מבין השניים אחרונות.
5. להרדים בעלי החיים על ידי זלוף עם PFA 4% בנקודות זמן מדעי מתאימות לאחר הניתוח על פי עניין חקירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פגיעת איסכמית וכתוצאה מכך נגרמת על ידי טכניקה זו מניבה מוות הדרגתי אך בולט של תאי הגנגליון ברשתית לאחר פציעת האקסון איסכמי. זוהי תוצאה רלוונטית קליני דומה לזה שנצפה במחלות של בני האדם. תיוג מדרדר FG משמש לכמת הישרדות RGC לאחר פיון. באותה השיטה מועסקת כדי לאמת יצירת מודל מוצלחת, כמו גם להעריך את ההשפעות של משטרים טיפוליים שונים. איור 1 מציג תמונות נציג confocal של תאי FG-חיוביים בmounts השטוח רשתית משליטה (איור 1 א), שטופל בדמה (לייזר / לא erythrosin B, איור 1), ו -2 שבועות טופלו פוסט-פיון רק בעלי החיים (איור 1 ג). בהשוואה לבעלי חיים שליטה, תאי FG-חיובי פחות נוכחים בבעלי חיים 2 שבועות אחרי גיוס פיון. אין הבדל משמעותי בין מספר RGCs בשליטה וטופל דמה (לייזר רק / לא erythrosin B) בעלי החיים שנצפה. תיים מצביע על כך שהפסד RGC מושרה פיון הוא שהושרו על ידי השילוב של erythrosin B וקרינת לייזר, במקום אנרגיית תרמית מהליזר לבד.

איור 1

1. תא הגנגליון ברשתית (RGC) הישרדות איור לאחר תאי הגנגליון ברשתית נוירופתיה אופטי איסכמית אחורית (פיון). כותרתו retrogradely עם Fluorogold היו צילמו בmounts הרשתית השטוח (AC). שבועיים לאחר פיון, מספר דומה של RGCs הוא ציין בשליטה (א) וטופל בדמה (B, לייזר רק / לא erythrosin B) עיניים. עם זאת, מספר RGCs שכותרת fluorogold מצטמצם במידה ניכרת בהגדרה של פיון (C). בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בVersio גדולn של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה Eleut הרננדז לגידול בעלי חיים, גייב Gaidosh למומחיות מיקרוסקופיה, וKhue טראן וZhenyang זאו לעריכת וידאו. מחקר זה מומן על ידי העין הלאומית מעניק R01-EY022129 לEY022589 JLG ומענקי P30 לUCSD וEY014801 אל UM; איגוד הלב האמריקאי, קרן ג'יימס ואסתר המלך, קרן התכנית חילופי סטודנטים לתואר השלישי של אוניברסיטת פודאן בית הספר למוסמכים (מס '2,010,033), ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת העיוורון, Inc.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBAR^TM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless