Summary
本协议描述了如何制作从小鼠多能干细胞（PSC）功能性鼻窦淋巴组织。 T-BOX3（TBX3）表达以及心肌肌球蛋白重链（MYH6）启动抗生素的选择导致了高纯度的起搏细胞聚集。这些“诱导窦房结-机构”（“iSABs”）含有80％以上的起搏细胞，显示高度增加跳动的速度，并能步伐心肌体外 。
Abstract
“病窦综合征”的治疗是根据人工心脏起搏器。这些熊的危害，如电池故障和感染。此外，它们缺乏激素响应性和总体过程是成本密集型的。从生成的PSCs“生物起搏器”有可能成为一种替代方法，还起搏细胞的胚状体的典型含量（EBS）是非常低的。所描述的协议将通过窦房结诱导TBX3与MYH6，促进基于抗生素选择“前进编程”鼠产品分成合同。这就产生心肌聚集一致> 80％生理功能起搏细胞。这些“诱导窦房结-体”（“iSABs”）被自发收缩在对应于节点的细胞从小鼠心脏中分离但未得频率（400-500 BPM），并能踱步鼠心肌体外 。使用所描述的协议的高纯度窦可以生成节点单个细胞，其例如可以用于在体外药物测试。此外，根据该协议所产生的iSABs可能成为朝向心脏组织工程的关键步骤。
Introduction
术语“病态窦房结综合征”总结了多种疾病导致的心脏起搏器系统的恶化。它包括病理，对症窦性心动过缓，窦房传导阻滞，窦性停搏以及心动过速，心动过缓综合征。由此，一个“病态窦房结综合征”常伴一般心脏疾病如缺血性心脏疾病，心肌病或心肌炎。目前，治疗方法是基于电起搏器的植入。然而，这伴随着一个数字，如感染和电池故障的风险。总体而言，并发症的发生率还是非常高的患者已经植入人工心脏起搏器。此外，相对于内源性心脏起搏器，这些设备不响应激素刺激。
未来的另一种可能依赖于哪些产品分成合同可能成为的“生物起搏器”的可用性作为合适的细胞来源，这也将是用于体外药物测试非常有价值的。然而，一个主要的问题出在胚体（EBS）中非常罕见的外观窦结细胞-这通常不超过约0.5％1。
此前，它表明“向前编程”朝特定心肌亚型是通过不同的早期心血管转录因子如中胚层特异性-后1（MesP1）和NK2转录因子相关的，轨迹5（的Nkx2.5）2的过表达是可行的， 3。对于正常尺寸和窦房结（SAN）的功能，在T-box转录因子TBX3是至关重要的，这已被证明以引发起搏器基因程序，并控制在SAN 4的分化。而这种增强的功能性起搏细胞的外观，内容依然没有整个cardiomyocytic细胞群中超过〜40％。
因此，一个额外的MYH6，促进基于抗生素选择步骤5中我们进行了介绍。这最终导致尚未未观察到心肌细胞聚集体（“诱导窦房机构;”iSABs“），其在体外表现出高度增加的跳动的频率（> 400 BPM），首次近似那些鼠心脏的和可比较的体外培养窦结细胞从鼠心脏6隔离。在异丙肾上腺素管理甚至殴打的550 BPM频率来实现。值得注意的是，iSABs包括超过80％的功能节点细胞从粗放生理得到印证分析7。最近，一些方法来使用直接重新编程19产生窦淋巴结细胞，表面标记14或药物治疗与小分子16,17进行了描述。然而，这些方法导致起搏细胞的这种高纯度和跳动频率接近鼠他艺术在iSABs观察。
此外，在已失去了他们的自发活动的跳动种植成年小鼠脑室片的体外模型中，iSABs能够集成到切片组织，因此剩余的自发主动和有力起搏心脏切片收缩7。这些iSABs的生成一个详细的协议，本文介绍。
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Protocol
1.建议开始之前
- 不要使用被污染的产品分成合同与支原体，因为他们不会分化成正常窦房结细胞。启动协议之前，测试支原体污染。用PCR试剂盒进行快速，灵敏地检测支原体做到这一点，并按照manufacturer`s协议。
- 对于每个培养皿（步骤2.3.4），涂层1 10cm 2的细胞培养皿用无菌7毫升0.1％明胶从冷水鱼皮1小时，在37℃。除去明胶，并让在无菌条件下将培养皿干燥在无菌台上。
- 在你开始分化协议，你需要一个双稳定转染的小鼠胚胎干细胞系克隆包含以下特点：一）构TBX3使用哺乳动物表达载体过表达。 ⅱ）MYH6启动子5的控制下的G418抗性基因。
- 未分化细胞的物业服务公司应共同培育ð与标准条件如所述1下照射饲养细胞。
2.分化过程
- 两天之前分化 - 从饲养层细胞中取出产品分成合同。
- 吸出介质，用10毫升的磷酸盐缓冲盐水PBS中洗涤细胞，添加7毫升胶原酶IV溶液，并在37℃下孵育细胞10分钟。放置在50ml管中的无菌40μm的过滤器。
- 仔细冲洗PSC殖民地（避免去除饲养层细胞）吹打胶原酶溶液向上和向下的5倍。
- 细胞悬液转移到一个40微米的过滤器，冲洗过滤器三次用8ml PBS中。转身过滤器，并将其放置在培养皿倒挂。吹打10毫升PBS中至过滤器的底部取出的PSC细胞集落。
- 细胞悬液转移到15毫升管离心5分钟，在300×g下。
- 取出PBS，悬浮细胞1毫升的Accutase和我ncubate在37℃下5分钟。
- 加入10毫升的PBS，吹打它向上和向下的5倍，离心5分钟，在300×g下混合的细胞溶液。
- 除去PBS，悬浮细胞在10ml培养基中并测定细胞数。
- 种子15000细胞/ cm 2上的75cm 2的过滤器烧瓶中，并加以培养2天，在37℃，5％CO 2。 2天后将烧瓶应50-70％汇合。
- 0天 - 开始分化
- 除去培养基并用10ml的PBS洗涤细胞。
- 吸出PBS，加2ml的Accutase孵育将细胞在37℃下5分钟。放置在50ml管中的无菌40μm的过滤器。
- 加入10毫升的PBS，将细胞悬浮液转移到40微米的过滤器，通过加入10ml PBS中，离心冲洗过滤器流过5分钟，在300×g下。
- 悬浮细胞在10ml的分化培养基，并确定细胞数。
- 淡化吨他的细胞悬液与分化培养基中至20000个细胞/ ml的终浓度。
- 吸管20ml水和5ml挂在一个二次培养皿，以避免干燥出加氢脱硫的压降（HD）的溶液中。
注：对于每个24以及含板iSABs（见2.8.6.4/2.8.7）启动16个培养皿。 - 吸取最多至50ml细胞悬浮液中的托盘。
- 转身培养皿的盖子。将180日立数据系统每片含20微升（400个细胞/ HD）细胞悬液到使用12道移液器的盖子。
- 小心地将周围的盖子，将它放到培养皿中。
注：扭转盖子的速度是很重要的。如果盖子被打开围绕太慢或太快，将细胞悬浮液的表面张力不够高，保留悬滴在盖。在试图产生日立数据系统首次练习扭转盖子用中的20微升滴。 - 在3培养细胞2天7°C，5％CO 2，让他们形成EB。
注：将一个培养皿盛满水的一叠5培养皿的顶部。否则，HD在上培养皿就会枯竭。
- 第2天
- 小心地将周围的二次培养皿的盖子，并从2培养皿（360 EBS）衍生的胚转移至50ml管。
- 等待10分钟，让胚定居在试管底部（不要离心EBS）。
- 吸出尽可能多的介质成为可能，暂停在10ml分化培养基中的胚，悬浮液转移到10cm的培养皿中。
- 一天2-6悬浮培养
- 培养在悬浮液4天的EB中，在37℃，5％CO 2，2天后改变介质。
注意：即使在陪替氏培养皿不涂（而不是一个细胞培养皿）的胚往往附加到表面。控制培养皿每天附着胚，并在必要时分离的胚从表面通过温和移液。可选：在悬浮培养期间不断摇晃培养皿。小心振动筛的速度。 EBS的既不应积累在中间，也没有浮到的培养皿边界。
- 培养在悬浮液4天的EB中，在37℃，5％CO 2，2天后改变介质。
- 6天
- 从一个培养皿转移EBS的一个明胶涂10厘米2细胞培养皿。
- 7-12日
- 细胞应该开始后8-12天打。检查每天在显微镜下跳动的细胞灶。细胞开始形成的层。
- 改变媒体每天。
注意：在改变培养基后，将细胞需要3-4小时，以恢复和重新开始跳动。
- 12-15日选择窦淋巴结细胞。
- 所述细胞已经开始跳动（约12-15天）后三天，吸新鲜分化培养基含有400微克/毫升G418的细胞的培养基和吸管10毫升
- 小心取出介质不吸细胞层。
- 加入10毫升的PBS，并小心地取出PBS不吸细胞层。
- 加入10毫升胶原酶IV溶液，将细胞转移到50毫升管中并孵育所述细胞在37℃下5分钟。
- 大力通过移液器上下吹吸10次混合的悬浮液，并培育的细胞在37℃下5分钟。应该发生的小簇暂停。如果仍有离开层的庞大零件，然后重复步骤2.8.4两次以上。
- 加入20毫升的PBS和离心机在300×g下10分钟。
- 小心吸出PBS。
注：如果iSABs要生成继续步骤2.8.7。如果ISAB衍生窦结单细胞是要产生继续步骤2.9。 - 悬浮细胞于12ml分化培养基中含有400微克/毫升G418和种子它们上6个孔的明胶包被的24孔（2毫升/孔）。
- 代单结电池。
- 暂停从步骤2.8.6在5毫升的Accutase细胞孵育在37℃下5分钟。
- 大力通过移液器上下吹吸10次混合的悬浮液，并培育的细胞在37℃下5分钟。
- 加入20毫升的PBS，离心5分钟，在300×g下。
- 暂停含有400微克/毫升G418的细胞于12ml分化培养基和种子它们上6个孔一个明胶包被的24孔（2毫升/孔）。
- 第2天解离后，吸出培养基，用PBS洗涤细胞三次。加入1毫升的分化培养基/孔。
- 4-8天解离后，改中，每2 次一天。上解离使用iSABs或ISAB衍生窦后第10天的节点的单细胞可用于进一步的分析。
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Representative Results
所描述的协议允许代iSABs与大约450 BPM的产品分成合同（在电影中所示），一个跳动频率附近是对小鼠心脏跳动频率。 iSABs的解离（步骤2.8.8）后所观察到的单个细胞显示窦房结（主轴和蜘蛛细胞）的细胞的典型形状如图1，这些细胞是已知的高表达的蛋白质是该功能所必需像超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4（HCN4），连接蛋白（Cx45的），Connexin30.2（Cx30.2）和MYH6（ - C图2A）窦房结的。治疗ISAB来源的细胞与药物后，将细胞显示预期的行为：像在窦房结，滑稽通道阻滞剂ZD7288（ 图3A）以及毒蕈碱受体激动剂卡巴胆碱（ 图3B），都可以导致一个显著降低打浆ISAB DERIV频率编细胞。将β肾上腺素受体 激动剂异丙肾上腺素导致升高的跳动频率（ 图3C）。
图1：主轴和蜘蛛细胞 ISAB衍生主轴（A）和蜘蛛（B）的结电池的典型的蜂窝形状的蜂窝形状 。比例尺为20μm。
图2：窦房结标志物的表达。 （A）HCN4（黄色）和Cx45的（洋红色），（B）在窦房结细胞Cx45的（品红色）和Cx30.2（黄色）的表达和（C）MYH6（品红色）的表达。中核（turquois）复染。比例尺为20μm。
图3：iSABs代表的药理治疗前（对照）跳动iSABs的频率和ZD7288（A），卡巴胆碱（B）和异丙肾上腺素（C）的处理之后。数据代表八个独立iSABs并表示为平均值±标准差。 *** P <0.001
图4：示意图分化协议 。简化卡通反射实验流程图为ISAB生成。
电影：解离后殴打的典型致窦房体（ISAB）的iSABs殴打抗辩SE点击此处观看该视频。
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Discussion
的能力产生干细胞来源的心脏起搏细胞可允许适当心律重建中的“生物起搏器”的感觉。同样，在体外药物测试将受益于他们的可用性。的PSCs可以引起哺乳动物体包括与起搏器电池特性8,9,10,11,12,13心肌的任何细胞类型。然而，通常为“胚体”内的细胞群体是高度异质的，这不可避免地导致了可靠的选择和分离的策略的要求 - 这尤其适用于心脏结细胞的非常罕见的细胞类型。基于外源性和内源性表面多种方法标志物14，在小分子15,16,17药理管理和直接重新编程的策略18,19已经接踵而至。此外，非干细胞为基础的方法，旨在模拟生物起搏器通过操作终端效应分子功能齐全的节点细胞20,21底层肌膜电，而不是从头生成。
然而，这些都不想出了所需的高自发性收缩频率和细胞纯度。与此相反，我们的协议导致细胞不仅表现出的电振荡，也微妙电生理和钙信号特性以及内源性起搏细胞7的鲜明的形态特征。这种技术有可能成为替代电子起搏设备的重要前提。
虽然该协议的发展过程中进行了优化，但仍有一些步骤，可能会导致问题：起点为ISAB的选择是至关重要的协议的。细胞的跳动为αMHC-表达在分化细胞的指标。 MYH6-表达伴随着前PRESSION的G418抗性基因。太早开始选择将熄灭很多这可能会分化为心肌细胞，因此将减少窦结细胞的总产率的细胞。另一个关键步骤是细胞层（步骤2.8）的离解。这样做的原因是，这些细胞形成一个强有力的细胞外基质和强大的力是必要的，以解离的细胞层。如果需要的话，步骤2.8.4应重复直到小簇细胞已经从细胞层的发展。避免细胞层由如胰蛋白酶直接解离，因为它被证明是非常低效率的。
对于未来的临床应用中，以下的障碍仍需要解决：所述的方法来产生人类iSABs的可能成为朝向未来细胞治疗和体外药物检验的一个关键步骤的转移。此外，该技术仍是基于稳定的遗传modifi的PSCs和因此的阳离子将需要被修改，才可以被应用到病人。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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