Summary
このプロトコルは、マウス多能性幹細胞（PSC）から機能洞結節組織を生成する方法について説明します。 T-BOX3（TBX3）過剰発現プラス心臓ミオシン-重鎖（MYH6）プロモーター抗生物質選択は、高純度のペースメーカー細胞凝集につながる。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）、80％以上のペースメーカー細胞を含む非常に増加鼓動率を示し、ex vivoで心筋をペーシングすることができます。
Abstract
「洞不全症候群」の治療は、人工ペースメーカーに基づいています。これらには、バッテリ障害や感染症などの危険を負担する。さらに、それらは、ホルモン応答性を欠いており、全体的な手順は、コスト集約的である。のPSCから生成された「生物学的ペースメーカーは、「代替になることがあり、まだ胚様体（EB）におけるペースメーカー細胞の典型的な含有量は極めて低い。記載されているプロトコルはMYH6プロモーターベースの抗生物質選択で洞結節デューサTBX3 を経由して 、ネズミのPSCの「前方プログラミング」を兼ね備えています。これは> 80％の生理学的に機能的なペースメーカー細胞の一貫性の心筋細胞凝集体が得られます。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）自発的にマウス心臓から単離したリンパ節の細胞に対応するまだ未達の周波数（400〜500 BPM）に委託し、ex vivoでのマウス心筋をペーシングすることができますされている。記載されているプロトコル高純度洞の使い方結節単一細胞は、in vitro薬物試験のために使用することができる例を生成することができる。さらに、このプロトコルに従って生成iSABsは、心臓組織工学に向けての重要なステップになることがある。
Introduction
用語「洞不全症候群は、「心臓ペースメーカーシステムの劣化につながる複数の疾患をまとめたもの。それは病的な、症候性洞性徐脈、洞房ブロック、洞停止だけでなく、頻脈、徐脈症候群を含む。これにより、「洞不全症候群」は、多くの場合、虚血性心疾患、心筋症または心筋炎などの一般的な心疾患を伴っている。現在、治療のアプローチは、電気的ペースメーカーの移植に基づいている。しかし、このような感染症やバッテリ障害などのリスクの数と共に進む。全体として、合併症の発生率は、人工ペースメーカーを移植した患者では依然として非常に高い。内因性のペースメーカーとは対照的に、また、これらのデバイスは、ホルモン刺激に応答しない。
将来の選択肢はいるのPSCが役立つことができる「生物学的ペースメーカー」の利用可能性に依存してもよい適切な細胞源とそれはまた、インビトロ薬物試験のために非常に有用であるように。しかし、大きな問題は、胚様体（EB）内の洞結節細胞の非常にまれな外観にある-これは通常、〜0.5％1を超えない。
以前は、それが特定の心筋細胞のサブタイプに向かって「前方プログラミング」は、関連する中胚葉、固有事後1（MesP1）及びNK2転写因子、遺伝子座5（Nkx2.5の）2のような明確な早期の心血管系の転写因子の過剰発現を介して実行可能であることが示された、 3。洞房結節（SAN）の通常のサイズおよび機能のために、Tボックス転写因子TBX3ペースメーカー遺伝子プログラムを開始し、SAN 4の分化を制御することが示されている、非常に重要である。これは機能的ペースメーカー細胞の出現を高めながら、コンテンツがまだ全体cardiomyocytic細胞集団内の約40％を超えなかった。
したがって、追加のMYH6プロモーターベースの抗生物質選択ステップ5は、私たちによって導入された。 in vitroでの栽培にネズミの心臓のものと同等のを近似初めてin vitroで非常に増加鼓動の周波数（> 400 BPM）を示す;これは最終的にまだ未観測心筋細胞凝集体（iSABs「「誘導された洞房体」）につながるマウスの心臓6から分離洞結節細胞。イソプレナリン政権下では550 BPMのさえ破っ周波数が達成される。注目すべきは、iSABsは7を解析して大規模な生理的から明らかなように、80％以上の機能的な結節細胞で構成されています。最近では、直接リプログラミング19を使用して、洞結節細胞を生成するには、いくつかのアプローチが、表面が16,17が記述された小分子との14または薬理学的治療マーカー。しかし、これらの方法はいずれも、ペースメーカー細胞のような高純度につながっていないと、マウスに近い周波数を破って、彼iSABsで観察されたように芸術。
さらに、それらの自発的な拍動活性を失った栽培成体マウス脳切片のex vivoモデルにおいて、iSABsそれによって自発的にアクティブ残りとロバスト収縮7に心臓切片ペーシング、スライス組織に組み込むことができる。これらのiSABsを生成するための詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。
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Protocol
起動する前に1.提言
- 彼らは洞結節細胞に適切に区別しないので、マイコプラズマで汚染されたのPSCを使用しないでください。プロトコルを開始する前に、マイコプラズマ汚染のためのテスト。マイコプラズマの迅速、高感度検出のためのPCRキットを使用してこれを行うとmanufacturer`sプロトコルに従う。
- 各ペトリ皿（ステップ2.3.4）、被膜37°Cで1時間冷水魚皮から無菌7ミリリットル0.1％ゼラチンで1 10cm 2の細胞培養皿である。ゼラチンを取り外し、無菌ベンチで滅菌条件下で食器を乾燥させる。
- 哺乳動物発現ベクターを用いてTBX3のI）構成的過剰発現：あなたが分化プロトコルを開始する前に、次の機能を含む二トランスフェクションし、安定したマウスES細胞株クローンを必要としています。 ⅱ）MYH6-プロモーター5の制御下のG418耐性遺伝子。
- 未分化のPSC細胞を共育成されるべきである記載1のように、標準的な条件下で照射されたフィーダー細胞とdは。
2.分化手順
- 二日分化する前に - フィーダー細胞からのPSCを削除します。
- 10mlのリン酸緩衝生理食塩水PBSで細胞を洗浄し、培地を吸引7ミリリットルのコラゲナーゼIV溶液を添加し、37℃で10分間細胞をインキュベートする。 50ミリリットルチューブに無菌の40μmのフィルターを配置します。
- 注意深くPSCコロニーをすすぎ上下に5回のコラゲナーゼ溶液をピペッティングすることによって（フィーダー細胞を除去することを避ける）。
- 8ミリリットルのPBSでフィルターを3回すすぎ、40μmのフィルターに細胞懸濁液を転送します。フィルターの周りに回して、ペトリ皿に逆さまに置きます。フィルターの底に10ミリリットルのPBSをピペットによりPSC細胞コロニーを削除します。
- 300×gで5分間、15mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移す。
- PBSを削除し、1ミリリットルのAccutaseで細胞を懸濁し、I5分間37℃でncubate。
- 10mlのPBSを追加し、300×gでダウンして5回5分間遠心分離し、それをピペッティングして細胞溶液を混ぜる。
- 、PBSを削除10ミリリットル培養培地中で細胞を懸濁し、細胞数を決定する。
- シード75cm 2の濾過フラスコに15000細胞/ cm 2、37℃、5％CO 2で2日間それらを養う。 2日後、フラスコを50〜70％コンフルエントにする必要があります。
- 0日目 - 分化のスタート
- 培地を除去し、10mlのPBSで細胞を洗浄。
- PBSを吸引し、2ミリリットルのAccutaseを追加し、5分間37℃で細胞をインキュベートする。 50ミリリットルチューブに無菌の40μmのフィルターを配置します。
- 、40μmのフィルターに細胞懸濁液を転送、10mlのPBSを追加10mlのPBSを添加して遠心分離を介してフィルタをすすぎ、フロースルー300×gで5分間。
- 10ミリリットルの分化培地中で細胞を懸濁し、細胞数を決定する。
- トンを希釈彼は20,000細胞/ mlの最終濃度に分化培地を有する懸濁液を細胞。
- ピペット20mlの水とのHDの乾燥アウトを回避するために次のペトリ皿の低下（HD）溶液をぶら下げ5ミリリットル。
注：iSABsを含む各24ウェルプレートの場合（セクション2.8.6.4/2.8.7を参照）16ペトリ皿で始まる。 - トレイ50mlの細胞懸濁液までピペット。
- ペトリ皿の蓋の周りに回します。 12チャンネルピペットを用いて、蓋の上に180のHDをそれぞれ含む20μL（400セル/ HD）細胞懸濁液を置きます。
- 慎重に蓋の周りにして、ペトリ皿の上に置きます。
注：蓋の周りに回転の速度が非常に重要です。蓋が遅すぎるか早すぎる周りになっている場合は、細胞懸濁液の表面張力が吊り蓋の上にドロップ保持するのに十分に高くない。メディアの20μlの滴で蓋の周りに回し、初めての練習のためのHDを生産しようとする前に。 - 3で2日間細胞を培養7℃、5％CO 2は、それらが胚様を形成させた。
注：5ペトリ皿のスタックの上に水を充填した場所ペトリ皿1。そうでない場合は、上ペトリ皿にHDは乾燥します。
- 2日目
- 注意深く次ペトリ皿の蓋の周りにして、50mlチューブ2つのペトリ皿（360のEB）に由来のEBを転送する。
- EBを（EBSを遠心しないでください）、チューブの底に沈降させるために10分を待ちます。
- できるだけ媒体として吸引し、10ミリリットルの分化培地中のEBを懸濁さ10cmペトリ皿に懸濁液を移す。
- デイ2-6浮遊培養
- 37℃、5％CO 2で4日間懸濁液中のEBを養う、2日後に培地を変える。
NOTE：EBはしばしば表面に付着（細胞培養皿ではなく）シャーレに塗布されていないにもかかわらず。毎日添付EBSのペトリ皿を制御し、必要に応じてのEBを切り離す穏やかにピペッティングすることによって表面から。オプション：浮遊培養期間中に連続してペトリ皿を振る。シェーカーの速さには注意してください。 EBは、ペトリ皿の国境に真ん中でもフロート内に蓄積しないはずもない。
- 37℃、5％CO 2で4日間懸濁液中のEBを養う、2日後に培地を変える。
- 6日目
- 1ゼラチンコーティングされた10cm 2の細胞培養皿に1ペトリ皿からのEBを転送します。
- デイ7-12
- 細胞は8〜12日後に打つために開始する必要があります。毎日顕微鏡下で細胞の増殖巣を破ってないか確認してください。細胞は、層を形成し始める。
- 毎日培地交換。
注：メディアを変更した後、細胞が回復すると再び暴行を開始するために3-4時間を必要とする。
- 洞結節細胞のデイ12-15選択。
- 細胞は（日12-15前後）打ち始めた三日後に、培地をピペットの細胞に400 / mlのG418を含有する新鮮な分化培地10mlを吸引。
- 細胞層を吸引することなく、慎重に培地を除去します。
- 10mlのPBSを追加し、細胞層を吸引することなく、慎重にPBSを削除します。
- 50mlチューブに細胞を移し、5分間、37℃で細胞をインキュベートし、コラゲナーゼIV溶液10mlを加える。
- 激しくピペッティングにより10倍ダウンサスをミックスし、5分間、37℃で細胞をインキュベートする。小さなクラスターの懸濁液が発生する必要があります。左層の巨大な部分が残っている場合、ステップ2.8.4さらに2回繰り返す。
- 300×gで10分間、PBS 20 mlの遠心分離を追加する。
- PBSを慎重に吸引除去する。
注：iSABsが生成されるようになっている場合、ステップ2.8.7に進みます。 ISAB派生洞結節単一細胞が生成される場合には、ステップ2.9に進んでください。 - 細胞を懸濁12mlの分化培地は、400 / mlのG418を含有するコーティングされたゼラチンの6ウェル24ウェル（/ウェル2ml）中にそれらをシード。
- 単一リンパ節細胞の生成。
- 5ミリリットルのAccutaseのステップ2.8.6から細胞を一時停止し、5分間37℃でインキュベートする。
- 激しくピペッティングにより10倍ダウンサスをミックスし、5分間、37℃で細胞をインキュベートする。
- 300×gで5分間、20 mlのPBSと遠心を追加します。
- 400 / mlのG418を含む12ミリリットル分化培地中の細胞を中断し、24ウェル（2ミリリットル/ウェル）コーティングされたゼラチンの6ウェル上にそれらをシード。
- 解離後の2日目に、培地を吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。ウェル/ 1ミリリットル分化培地を追加します。
- デイ4-8解離した後に、すべての第2 回日中に変更します。解離用iSABsまたはISAB派生洞結節の単セルの後10日目にさらなる分析のために利用可能です。
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Representative Results
記載されているプロトコルは、マウス心臓の鼓動周波数に近い（映画で示されている）のPSCから約450 BPMの叩解周波数でiSABsの生成を可能にする。 図1に示すようにiSABsの解離（ステップ2.8.8）の後に観察された単一細胞が洞結節（スピンドルおよびクモ細胞）の細胞の典型的な形状を示す。これらの細胞機能に必須であることが知られている高発現タンパク質Connexin45（Cx45）、Connexin30.2（Cx30.2）とMYH6（ - C図2A）、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネル4（HCN4）のような洞結節の。医薬品とISAB由来細胞の処理後、細胞は、予想される動作を示す：洞結節におけるような、変チャネル遮断薬ZD7288（ 図3A）、ならびにムスカリン受容体アゴニストであるカルバコール（ 図3B）の両方が有意に減少鼓動を引き起こすISAB DERIVの周波数エド細胞。 βアドレナリン受容体作動薬のイソプレナリンは、上昇した拍動周波数（ 図3C）につながる。
図1：細胞スピンドルの形状及びクモ細胞 ISAB由来のスピンドル（A）の典型的なセルラー形状とスパイダー（B）節細胞。スケールバーは20μm。
図2：洞結節マーカーの発現。 （A）（黄色）HCN4およびCx45（マゼンタ）、洞結節細胞におけるCx45（マゼンタ）、（黄）Cx30.2の（B）式及び（C）MYH6（マゼンタ）の発現。核の対比（ターコイズ）。スケールバーは20μm。
図3：薬理iSABs代表治療前（コントロール）iSABsの周波数を破っとZD7288（A）、カルバコール（B）及びイソプレナリン（C）で処理した後。データは、8つの独立したiSABsを表し、平均±SDとして提示されている。 *** P <0.001
図4：分化プロトコルの概略 。 ISAB世代のための実験的なフローチャートを反映簡体漫画。
映画：解離後の典型的な誘起洞房体（ISAB）のiSABsビーティングの鼓動 。 嘆願SEこのビデオを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
細胞由来の心臓ペースメーカー幹細胞生産能」とは、生物学的ペースメーカー」の意味での適切な心臓リズムの再構成を可能にすることができる。同様に、in vitroでの薬物検査は、それらの利用の恩恵を受ける。 PSCがペースメーカー細胞特性8,9,10,11,12,13心筋細胞を含む哺乳動物の体の任意の細胞型を生じさせることができる。しかし、典型的には、「胚様ボディ」内の細胞集団は、必然的に、信頼性の選択および単離戦略の要件につながる、非常に不均一である - これは、心臓節細胞の非常にまれな細胞型に当てはまる。外因性および内因性の表面に基づいた多数のアプローチは、小分子15,16,17の薬理学的な管理上および18,19が守られてきたダイレクトリプログラミング戦略に、14マーカー。また、非幹細胞ベースのアプローチは、生物学的ペースメーカーをエミュレートすることを目的と完全に機能結節細胞20,21の代わりに、デノボの筋細胞膜の電気生理学の基礎となる生成ターミナルエフェクター分子の操作を介して。
しかし、これらのいずれも必要な高自発収縮頻度と細胞の純度を思い付いた。対照的に、我々のプロトコルは、電気振動がなく、微妙な電気生理学およびカルシウムシグナル伝達特性ならびに内因ペースメーカー細胞7の特徴的な形態学的特徴を示さない細胞をもたらす。この技術は、電子ペーシングデバイスの代替のための重要な前提条件になることがあります。
このプロトコルは、その開発中に最適化されたが、まだ問題が発生することがありますいくつかのステップがあります：ISABの選択のための出発点は、プロトコルの非常に重要です。細胞の鼓動は、細胞を分化におけるαMHC-発現のための指標である。 MYH6-expressionはEXと一緒に行くG418耐性遺伝子のPRESSION。早すぎる選択を開始すると、潜在的に心筋細胞に分化するだろう、したがって、洞結節細胞の全体的な収量が減少します細胞の多くを消灯します。もう一つの重要なステップは、細胞層（ステップ2.8）の解離である。この理由は、細胞は強固な細胞外マトリックスを形成し、強い力が細胞層を解離する必要があることである。必要であれば、ステップ2.8.4は、細胞の小さなクラスターを細胞層から開発しているまで繰り返されるべきである。それは非常に低い効率であることが判明したので、 例えばトリプシンによって細胞層の直接の解離を避けてください。
将来の臨床応用のために、以下の障害がまだ対処する必要がある。今後の細胞治療に向けたし、in vitroの薬物検査で重要なステップになることがあり、人間iSABsの世代へのアプローチの転移を。また、技術がまだ安定した遺伝MODIFIに基づいていますしたがって、PSCのとの陽イオンは、それが患者に適用する前に変更する必要があります。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 | |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 | |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 | |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 | |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 | |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 | |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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