Introduction
القيطم المورق هو يستخدم على نطاق واسع، كائن نموذج قوي لدراسة تطوير 1. وذلك لأن البيض القيطم هي كبيرة بشكل غير عادي (حوالي 1،2-1،4 مم، بالمقارنة مع نظرائهم الثدييات يجري حوالي 0.1 مم) وفيرة. البيض يحتوي على توليفها أمهات وتخزينها المكونات، التي تكفي لدفع عجلة التنمية الجنينية حتى منتصف الأريمة الانتقالية (MBT، والتي تحدث في مرحلة 8-8.5 مع 4،000-8،000 خلايا). ويرافق MBT التي كتبها تفعيل الجينوم اقحي، التي تنتج ثم المنتجات الجينات الجنينية التي توجه مزيد من التطوير.
العديد من الدراسات تهدف الى تحديد العوامل الأمهات هامة للتنمية. العديد من الدراسات تعتمد على حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد (oligos) بما في ذلك أليغنوكليوتيد] morpholino إلى الأجنة المخصبة، والذي تدهور حالة البروتينات الأمهات يمكن ملاحظة في مرحلة المعيدة 2-4. بدلا من ذلك، يتم حقن من mRNAs لم المخصبةbryos يزعج وظائف الجينات أو لتتبع مصائر البروتينات overexpressed. ومع ذلك، فإن الحقن في الأجنة مرحلة خلية واحدة عادة لا يؤثر على مستويات التعبير من البروتينات الأمهات في المراحل الجنينية المبكرة جدا قبل MBT.
أنشئت Heasman وايلي طريقة نقل المضيف للتغلب على هذه المسألة 5. في طريقتهم، يتم حقن البويضات defolliculated يدويا مع oligos العقاقير ونقلها إلى الإناث المضيف 6. وdownregulated البروتينات قبل الإخصاب بحيث الأدوار من البروتينات downregulated في التطور الجنيني المبكر يمكن فحصها. أدت هذه الطريقة استنزاف الأمهات إلى التعرف على العديد من الأدوار التنموية الفريدة من البروتينات الأمهات، كما استعرضت في 7.
في هذا التقرير، إلا أننا التفاصيل أسلوبنا وضعت مؤخرا، والذي يتحقق استنزاف الأمهات أو overexpression من مرنا قبل الإخصاب دون defolliculation اليدوي ونقل المضيف8. يتطلب دليل defolliculation الكثير من الوقت ونقل المضيف كثيرا ما يحتاج تقنيات ماهرا وترخيص محدد لجراحة الحيوان، مما يعوق كثرة استخدام أسلوب استنزاف الأمهات. يتم استبدال Defolliculation ونقل المضيف عن طريق defolliculation الأنزيمية 9،10 وداخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية (الحقن المجهري) 11-13 على التوالي. الحقن المجهري للبيض كانت في الأصل تستخدم لإنتاج الضفادع المعدلة وراثيا 12. وقد تم زرع الحيوانات المنوية والأجنة نوى أيضا إلى البويضات في المختبر البرمائيات نضجت 11،14،15. هنا، وتبين لنا طريقة لدينا خطوة بخطوة لحقن الحيوانات المنوية في المختبر لالبويضات الناضجة التي كانت قبل حقن مع oligos العقاقير أو مرنا.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب مع الضفادع من متطلبات وزارة الداخلية UK التالية.
1. إعداد القيطم المورق البويضات
- تقريبا قبل أسبوع من جمع البويضة، وضخ الضفادع الإناث مع 150 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) لمرحلة ما قبل فتيلة باستخدام 1 مل حقنة بإبرة معقمة 27 G. ويتم حقن تحت الجلد في ظهري الليمفاوية الكيس.
ملاحظة: إنه الأمثل لاستخدام الضفادع التي لم تضع بيضها لفترة طويلة (على الأقل أكثر من عام ونصف العام) أو التي وضعت البيض أبدا من قبل. - متجر الضفادع مسبقا معبي في خزان مياه وضعت في 18 درجة مئوية في غرفة ضوء رقابة (07:00 حتي 19:00: على، 07:00 حتي 07:00: إيقاف).
- في يوم جمع البويضة، وإعداد 1 L من 1X تعديل بارت الحل (MBS) من الأسهم 10X MBS عن طريق تمييع مع الماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O)، وإضافة البنسلين والستربتومايسين في تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / ملكل (MBS + PS). يتكون الأسهم 10X MBS من 880 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 24 ملي NaHCO 3، 8.2 ملي MgSO 4 .7H 2 O، 3.3 ملي كا (NO 3) 2 .4H 2 O، 4.1 ملي CaCl 2 .6H 2 O، و 100 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5.
- تخدير الضفدع تستعد مسبقا عن طريق الحقن تحت الجلد من 120 ملغ (في 400 ميكرولتر) من تريكين methanesulfonate (MS222). الحفاظ على ضفدع حقن في خزان صغير مع الماء.
- بعد 10 دقيقة، والتحقق من الضفدع تخدير بتحويلها عبر منذ بنجاح الضفادع تخدير لا تستجيب لذلك. إذا التخدير غير مكتمل، إضافة الجليد في خزان والانتظار لمدة 10 دقيقة أخرى.
- التقاط الضفدع من خزان صغير ووضعه في الاستلقاء على ظهري رطبة يمسح.
- باستخدام ملقط ومقص جراحي صغيرة، قرصة الجلد وجعل شق صغير (2 سم) في الجزء السفلي من البطن، والجانبي إلى خط الوسط. جعل شق آخر في الجانب الآخر.
- بعد قطع الجلد، ورفع واي طبقة العضلاتملقط عشر وجعل شق في طبقة العضلات.
- مراقبة المبيض بعد قطع طبقة العضلات وسحب المبيض الخروج من شقوق باستخدام ملقط.
- نقل استخراج المبيض إلى أنبوب 50 مل مع MBS الحل.
ملاحظة: في محاولة لجمع أكبر قدر ممكن من المبيض كل من الشقوق. - ذبح الضفدع الإناث استنزاف، تليها تجميد للتخلص المناسب لاحق.
- شطف المبيض استخراج عدة مرات مع MBS + PS حتى يتم غسلها الدم بعيدا. ثم، ونقل المبيض إلى 9 سم طبق بتري تحتوي MBS + PS
ملاحظة: التحقق من نوعية البويضات تحت المجهر تشريح في هذه المرحلة. إذا البويضات هي نوعية سيئة على ما يبدو، مثل البويضات مع تصبغ متفاوتة في النصف الحيوان (الشكل 1A)، لا معالجة أبعد من ذلك وبدلا من ذلك الحصول على المبيض الجديد. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون البويضات نصفي الكرة الأرضية الحيوان المصطبغة على قدم المساواة وتكون تقريبا الحجم على حد سواء. - ندف المبيض إلى قطع صغيرة(1-2 سم 2) وجمع 5 مل من البويضات في أنبوب جديد 50 مل.
- شطف 5 مل من المبيض تمزق عدة مرات مع MBS + PS وإضافة MBS + PS إلى 15 مل.
- إضافة 7 وحدات للانزيم لdefolliculation إلى تعليق المبيض (انظر قائمة المواد).
ملاحظة: إعادة تشكيل انزيم مجفف بالتجميد مع 10 مل من DDH 2 O (28 وحدة / مل). ضع قارورة لمدة 30 دقيقة على الجليد مع يحوم طيف في بعض الأحيان. قسامة 250 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. - احتضان قطعة المبيض مع انزيم لمدة 1 ساعة مع طيف والهز على شاكر (السرعة 15 لفة / دقيقة، أي ما يعادل حوالي 0.014 x ج).
ملاحظة: لإزالة كاملة تقريبا من خلايا بصيلات، 2 ساعة إلى 2 ساعة 15 دقيقة الحضانة مع الحاجة الإنزيم بشكل طبيعي. وهناك حاجة أطول الحضانة لبويضة نقل النووي التجربة 16. - بعد 1 ساعة الحضانة، والتقاط عدد قليل من البويضات المعالجة (10-20 البويضات) ونقل إلى 6 سم طبق بتري تحتوي MBS + PS تحقق من EXTEالإقليم الشمالي من defolliculation تحت المجهر تشريح. إذا يتم فصل البويضات من بعضها البعض وdefolliculated جزئيا على الأقل (الشكل 1B)، الشروع فورا في رد فعل المحطة التالية (الخطوة 18). إذا لا تزال تحيط البويضات بشكل كبير من قبل خلايا بصيلات، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية كحد أقصى.
- إضافة الكثير من MBS + PS لوقف رد الفعل وتجاهل طاف. تكرار الغسيل لمدة 10 مرة.
ملاحظة: إضافة MBS + PS بصب على جدار أنبوب 50 مل، ولكن ليس مباشرة إلى البويضات. بعد تعليق في MBS + PS، البويضات غير الناضجة صغيرة تميل إلى تعويم في الجزء العلوي من غسل العازلة وتجاهل مثل هذه البويضات صغيرة عائمة. - بعد يغسل، ونقل إلى 9 سم طبق بتري تحتوي MBS + PS
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، والحفاظ على البويضات في 16-18 ° C إلى أقصى حد ممكن. ويمكن القيام بذلك عن طريق الحفاظ على طبق التي تحتوي على البويضات في مرحلة التحكم في درجة حرارته. - تحديد مرحلة السادس البويضات وفقا لتصنيف دومونتللاستخدامات لاحقة ونقل إلى 9 سم طبق بتري جديدة تحتوي على MBS + PS نقل البويضة يمكن أن يتم باستخدام ماصة الزجاج مع حجم غيض المناسب (أكبر من حجم البويضة).
ملاحظة: يجب أن يكون البويضات نوعية جيدة من نصف الكرة الحيوان المصطبغة بالتساوي مع تباين واضح بين نصف الكرة الحيوانية والنباتية في نصف الكرة الأرضية، وتكون متساوية الحجم تقريبا (الشكل 1C). المرحلة السادسة البويضات تمثل نمت بشكل كامل البويضات التي يمكن أن تستجيب لهرمون البروجسترون (قطر البويضة حوالي 1،2-1،4 مم).
2. حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد] أو مرنا في البويضات
ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات في هذا المقطع في 16-18 ° C على خشبة المسرح المجهر مجهزة المياه المنتشرة التحكم في درجة حرارته أو على مربع من البلاستيك مليئة الجليد.
- نقل 200-300 البويضات المحدد إلى 9 سم طبق بتري جديدة مليئة MBS + PS، والتي سوف يتم تنفيذها حقن مكروي.
ملاحظة: في مجموعة شرق افريقياح الشرط، وتستخدم 200-300 البويضات بشكل طبيعي. في المجموع، وتستخدم ما يقرب من 1،000 البويضات في تجربة واحدة. - لإعداد حقن oligos العقاقير أو مرنا، إخراج المكبس معدنيه microinjector.
- ملء الزجاج الشعرية مع الزيوت المعدنية باستخدام حقنة وتضاف الشعرية زجاجية مملوءة النفط إلى المكبس المعدني microinjector.
ملاحظة: يتم سحبها والزجاج الشعرية التي كتبها مجتذب micropipette. وتحفظ هذه الإبر في مربع دون الإضرار النصائح. - قطع رأس الإبرة باستخدام مقص جراحي صغير تحت المجهر من قبل تهدف كما غيض القطر الصغير للحقن ممكن.
ملاحظة: طرف الإبرة يمكن شحذ باستخدام قهوة أو ممص مكروى beveler الجزئي. لشطبة الإبرة بزاوية 25 درجة يحسن القدرة على اختراق جدار البويضة. - وضع شريط صغير من بارافيلم على مرحلة مجهر تشريح والاستغناء انخفاض 3 ميكرولتر من العقاقير بنسبة ضئيلة أو حل مرنا.
- نقل منظمة الشفافية الدوليةp من إبرة الحقن في قطرات صغيرة من حل وملء الإبرة مع الحل ليتم حقنه.
ملاحظة: إذا غيض من إبرة الحقن هو صغير جدا، يجب أن تظهر فقاعات الهواء في طرف المكبس المعدني. ثم، وجعل تلميح أكبر على إبرة الحقن حتى لا يحدث هذا. - بمناسبة إبرة حقن حوالي 0.5 ملم بعيدا عن الحافة. وتستخدم هذه العلامة كمؤشر على عمق الحقن.
- إدراج غيض من الإبرة إلى بويضة على طول الحدود الاستوائية التي تهدف إلى نقطة المركز من البويضة (حويصلة تحت جرثومي) في حين عقد بلطف الجانب الآخر من بويضة إلى نقطة حقن مع ملقط لمنع حركة بويضة غير مرغوب فيها أثناء الحقن .
ملاحظة: العثور على منطقة خالية من خلايا بصيلات (الشكل 1B) وادخال الإبرة من تلك البقعة منذ حتى إبرة دقيقة لا يمكن في كثير من الأحيان تخترق طبقة من خلايا بصيلات. - إخراج 4.6 نانوغرام / 4.6 NL أو 9.2 نانوغرام / 9.2 NL من المطهراتoligos ense، أو حجم مناسب من مرنا (250 خريج إلى 13.8 نانوغرام) باستخدام مفتاح القدم. يتم وصف تفاصيل إعداد العقاقير بنسبة ضئيلة في 7.
- نقل البويضات حقن في طبق بيتري 6 سم مليئة MBS + PS تستكمل مع 0.1٪ BSA (سيت الحضانة المتوسطة، تعقيم الحل باستخدام فلتر 0.45 ميكرون المسام).
- احتضان البويضات في 16 ° C أو 18 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.
ملاحظة: المصبوبة البويضات يمكن أن تخضع لفي المختبر نضوج عدة ساعات بعد الحقن، وفي هذه الحالة حقن 4.6 نانوغرام oligos العقاقير هو الأفضل. والقاعدة العامة هي أن أقصر فترة حضانة المرض هي، وأفضل التطور الجنيني اللاحقة.
3. في المختبر النضج (IVM) من البويضات
- في مساء يوم من التجربة نضوج البويضة، جلب حل الأسهم البروجسترون (30 ملم في الإيثانول) من -80 ° C الثلاجة وإذابة الرواسب في غرفة تيمperature مع دوامة في بعض الأحيان.
ملاحظة: يتم ترك الأسهم البروجسترون عادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. - إضافة 5 ميكرولتر من الأسهم البروجسترون في 50 مل من MBS + PS (النضج المتوسط، وتركيز النهائي من هرمون البروجسترون في 3 ميكرومتر) ويهز على شاكر لمدة 30 دقيقة لتوزيع البروجسترون في الحل على حد سواء.
- إعداد المغلفة الاغاروز 6 سم أطباق لفي المختبر العلاج النضج.
- إضافة 1 غرام من الاغاروز إلى 50 مل من 1X MBS بدون المغنيسيوم والكالسيوم.
- حل الاغاروز عن طريق تسخين في الميكروويف.
- صب كمية صغيرة من الحل الاغاروز إلى 6 سم أطباق لتغطية الجزء السفلي من الأطباق.
- انتظر على الأقل لمدة 30 دقيقة حتى تجمد.
- صب 5-8 مل من النضج المتوسط إلى أطباق الاغاروز المغلفة ونقل 200-300 البويضات في كل 6 سم أطباق.
ملاحظة: في محاولة لنقل البويضات مع الحد الأدنى من بويضة الحضانة المتوسطة. - احتضان لمدة 16 ساعة على 16 ° C.
ملاحظة: على سبيل المثال، بدء العلاج الساعة 5 مساء وتنتهي في الساعة 9 صباحا في اليوم التالي.
4. داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية (الحقن المجهري)
- الحيوانات المنوية المجمدة إعداد الأوراق المالية
ملاحظة: يجب أن يتم إعداد الحيوانات المنوية التالية قبل بدء التجربة نضوج البويضة، ويتم الاحتفاظ الأسهم الحيوانات المنوية المجمدة في -80 درجة مئوية لمدة ICSI.- جمع الخصيتين من الضفادع الذكور باتباع الخطوات 1،4-1،11، باستثناء لسحب الدهون والخصية الخروج من شقوق باستخدام ملقط وإزالة الخصيتين من الدهون.
- غسل الخصيتين في 1X مارك لتعديل قارعو الأجراس (MMR، 100 مم كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 1 ملم MgSO 4، 2 مم CaCl 2، 5 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4).
- إزالة الدهونالأوعية الدموية د من قبل المتداول الخصيتين غسلها على المناديل الورقية النظيفة ومن ثم عن طريق إزالة ما تبقى الأوعية الدموية باستخدام ملقط.
- وضع كل الخصية في طبق بتري تحتوي على 3.5 سم 1 مل من 1X MMR.
- قطع طولي مع مقص غرامة، والمسيل للدموع الى قطع صغيرة مع ملقط حتى لا تظل قطع كبيرة.
- ماصة صعودا وهبوطا باستخدام 1 مل البلاستيك طرف الذي يتم قطع نهاية، وتحميل 1 مل من محلول الخصية سحقت في الخالط الزجاج.
- التجانس لهم من قبل 2-3 السكتات الدماغية وثم صب الحل على مرشح المسام 50 ميكرومتر تعلق على الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي 15 مل. السماح الحل للذهاب من خلال مرشح.
- كرر الخطوة 4.1.7 عن طريق إعادة التعليق المتبقية قطع الخصية في 1 مل من 1X MMR. وأخيرا، وغسل الخالط بضع مرات مع 1X MMR وتمريرها من خلال مرشح.
- كرر الخطوات من 4.1.5 إلى 4.1.8 للخصية وتجمع اثنين الخصيتين أخرى إلى واحد 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
- تدور الخلايا في 800 x ج في 46؛ C لمدة 20 دقيقة.
- تجاهل وطاف resuspend الخلايا مكعبات في 2 مل من 1X MMR. ثم، ونقل في أنبوب جديد.
ملاحظة: تأكد من عدم وجود خلايا الدم مرئية موجودة. - إعداد خطوة التدرج في 14 مل فائقة الوضوح أنبوب الطرد المركزي. الطبقة السفلية: 4 مل من 30٪ iodixanol. الطبقة السفلية الثانية: 1 مل من 20٪ iodixanol. الثالثة الطبقة السفلية: 5 مل من 12٪ iodixanol. الطبقة العليا: الخصية الخلايا في 2 مل من 1X MMR. تراكب التدرجات بلطف شديد مع ماصة طرف 1 مل (تراكب ببطء على عدم تعكير صفو مرحلة القاع).
ملاحظة: طبقة واحدة فقط من 30٪ iodixanol يجب أن تعمل أيضا لعزل الحيوانات المنوية فقط. - تدور في الدوار SW40 باستخدام نابذة فائقة السرعة في 10،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (التباطؤ دون انقطاع).
- بلطف إزالة أنبوب من نابذة فائقة السرعة. تأكيد واجهة بين كل طبقة من التدرج وبيليه في القاع.
- جمع جزء الحيوانات المنوية من بيليه.
- Resuspend وPEL الحيوانات المنويةدعونا في 1X MMR لغسل خارج iodixanol. تدور في 800 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: إذا كان الكثير من الحيوانات المنوية لا تزال في تعليق بعد زيادة ونقصان، وإعادة تدور طاف في 3،220 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وبركة الحيوانات المنوية مكعبات. - تجاهل طاف و resuspend بيليه الحيوانات المنوية في 1 مل من 1X العازلة تحضير النووية (NPB، 250 ملي السكروز، 0.5 ملي سبيرمدين trihydrochloride، 0.2 ملي السبرمين tetrahydrochloride، 1 ملم EDTA، 15 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.7) 13. ثم، ونقل إلى أنبوب إيبندورف.
- إضافة 50 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل ديجيتونين في 1X NPB (مسحوق و resuspend ديجيتونين في DMSO في 50 ملغ / مل وتجميد aliquots في -80 ° C. الاستعمال قبل، يخفف من 50 ملغ / مل قسامة إلى 10 ملغ / مل مع 1X NPB. غير المستخدمة 10 ملغ / مل ديجيتونين يمكن تجميد وتخزينها في -20 ° C وإعادة استخدامها) إلى 1 مل من محلول الحيوانات المنوية.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تحقق معدل permeabilization التي كتبها دابي تلطيخ (0.3 ميكروغرام / مل دابي كما الاتحاد الدولي للسباحةتركيز لتر). إذا تم permeabilized أقل من 95٪ من الخلايا، واحتضان لفترة أطول قليلا.
ملاحظة: في بعض الأحيان إذا يتم تحضين عدد كبير جدا من الخلايا المنوية في نفس الوقت (وخاصة عندما يتم جمع الحيوانات المنوية من الخصيتين متعددة)، فمن الصعب permeabilize، وفي هذه الحالة قد يكون من الضروري إضافة كمية صغيرة إضافية من ديجيتونين. على سبيل المثال، يتم إضافة 20 ميكرولتر إضافية من ديجيتونين إذا لم يتم permeabilized 20٪ من الحيوانات المنوية. - وقف permeabilization بإضافة 10٪ BSA إلى 3٪ تركيز النهائي.
- تدور الخلايا في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حاول قليلا عن سرعة الطرد المركزي ممكن من خلال البدء مع 100 x ج لمدة 5 دقائق. إن لم يكن كافيا، وزيادة سرعة و / أو الوقت. - غسل الخلايا مع 0.3٪ BSA في 1X NPB وأجهزة الطرد المركزي في نفس السرعة كخطوة 4.1.22. غضون ذلك، وإعداد التخزين العازلة الحيوانات المنوية (SSB، 2 مل من 2X NPB، 120 ميكرولتر من 10٪ BSA، 1.2 مل تعقيمها الجلسرين، 680 ميكرولتر من H 2 O).
- إضافة 500 ميكرولتر من SSB إلى الحيوانات المنويةبيليه. ماصة عدة مرات صعودا وهبوطا ل resuspend مع طرف قطع حتى لا تتلف الخلايا.
- السماح للتوازن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات مع خفض الحافة.
- تمييع بضع ميكرولتر 10 مرات في 1X MMR أو في برنامج تلفزيوني 1X لحساب الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- تجميد كما aliquots في 30،000 الحيوانات المنوية / ميكرولتر (أو أعلى) مباشرة في -80 ° C وتخزينها في -80 درجة مئوية في مأخوذة تستخدم مرة واحدة.
- ICSI لفي المختبر نضجت البويضات
ملاحظة: جميع العمليات التي تنطوي على البويضات وينبغي أن يتم في 16-18 درجة مئوية.- إعداد ماصة الزجاج لنقل البويضات الناضجة.
ملاحظة: ماصة الزجاج يجب أن تكون واسعة بما يكفي لاستيعاب البويضات بدون ضغط. - بعد ستة عشر ساعة تتحرك البويضات إلى المتوسطة التي تحتوي على البروجسترون، نضجت نقل البويضات في طبق المغلفة الاغاروز 6 سم مليئة MBS + PS للغسيل.
ملاحظة: الأهم من ذلك، مالبويضات atured يجب أن تعامل بعناية فائقة. معاملة خشنة من البويضات قد تتسبب في تنشيط عفوية قبل حقن الحيوانات المنوية. - عدد البويضات الناضجة من خلال التأكد من ظهور بقع بيضاء، وهو ما يعني انهيار حويصلة جرثومي (الشكل 2). إذا كان معدل نضوج أقل من 80٪، فمن غير المحتمل أن الحصول على عدد كاف من الباقين على قيد الحياة الأجنة لمزيد من التحليلات.
ملاحظة: يتم مقشر باقي خلايا بصيلات قبالة بعد نضوج البويضة (الشكل 2). - نقل البويضات من MBS الغسيل إلى 6 سم طبق المغلفة الاغاروز جديدة مليئة حقن المتوسطة (إعداد 500 مل: 30 غراما من Ficoll (6٪)، و 20 مل من 10X MMR و 500 ميكرولتر من الأسهم 1،000x PS).
- احتضان على الأقل لمدة 30 دقيقة قبل البدء في الحقن المجهري.
- إعداد microinjector كما هو موضح في الخطوات 2،2-2،4.
ملاحظة: حجم غيض من إبرة الحقن يتم الاحتفاظ صغيرة قدر الإمكان باتباع الإجراء هو موضح في الخطوة 2.6. قطرمن الإبرة هو 20-40 ميكرومتر. لشطبة طرف الإبرة كما هو موضح في الخطوة 2.4 قد يسمح للحقن كفاءة. - جلب قسامة الحيوانات المنوية وتمييع تعليق الحيوانات المنوية في الحيوانات المنوية التخفيف العازلة (SDB، 250 ملي السكروز، 75 ملي بوكل، 0.5 ملي سبيرمدين، 0.2 ملي السبرمين، 200 ميكرومتر HEPES 7.5 درجة الحموضة).
ملاحظة: يمكن أن تختلف التخفيف اعتمادا على حجم الإبرة وهلم جرا. تمييع 120 مرة من 30،000 الحيوانات المنوية / الأسهم ميكرولتر باعتبارها محاولة أولية وضبط أكثر إذا لزم الأمر. - وضع شريط صغير من بارافيلم على مسرح المجهر تشريح. مزيج حل حقن الحيوانات المنوية قبل pipetting والاستغناء عدد قليل من قطرة ميكرولتر من الحل الحيوانات المنوية.
- تمتص تعليق الحيوانات المنوية المخفف في إبرة، وضخ 4.6 NL إلى 10 قطرات المتعاقبة التي تحتوي على 0.3 ميكروغرام / مل دابي على شريحة المجهر، والعد بسرعة عدد الحيوانات المنوية تسليمها في حقن على المجهر الفلورسنت.
ملاحظة: الهدف 1-2 الحيوانات المنوية في الحقن. إذا لزم الأمر، وتمييع الحل حقن الحيوانات المنوية أكثروالتحقق من عدد الحيوانات المنوية في الحقن مرة أخرى حتى تحقيق التركيز المطلوب. - إخراج الحل حقن اختبار وملء حل جديد حقن الحيوانات المنوية مع التركيز المناسب.
- ضخ 4.6 NL من الحل الحيوانات المنوية إلى 100 البويضات الناضجة.
ملاحظة: من المهم لحقن مستمر الحل. أولا تحديد الوقت اللازم لإخراج 4.6 NL (عادة 1-2 ثانية). كرر العملية التالية. حقن في بويضة، انتظر بضع ثوان، وإزالة إبرة وهمية حقن في حل الحقن، والانتظار لبضع ثوان، وضخ في بويضة. هذه الحقن المستمر كما يمنع حجب طرف الإبرة. بدلا من ذلك، فإن هذه الطريقة باستخدام مضخة يمكن أن تستخدم 13. - بعد ما يقرب من 100 الحقن، وإخراج الحل الحيوانات المنوية المتبقية وإعادة ملء الحل الحيوانات المنوية (استخدام الحل الحيوانات المنوية نفسه، ولكن ماصة صعودا وهبوطا قبل الاستغناء).
ملاحظة: إذا لم الإبرة تمتص حل الحيوانات المنوية بشكل جيد، وقطع غيض من الحاجةجنيه. إذا كان هذا لا يحسن الوضع، وإعداد إبرة جديدة. - تكرار عملية الحقن حتى يتم حقن جميع البويضات.
ملاحظة: إذا كانت جودة بويضة جيدة وحقن ناجحة، ويعتبر انكماش البويضات حقن في غضون 20 دقيقة من الوقت الحقن. - تحريك أطباق حقن إلى 16 درجة مئوية أو 18 ° C الحاضنة.
- 4-5 ساعة بعد الحقن، والتحقق من معدل الانقسام الأجنة ICSI.
ملاحظة: الأخاديد الشق من تلك الأجنة قد لا تكون واضحة مثل تلك الأجنة المخصبة العادية. تظهر بعض الأجنة أيضا انقسامات غير طبيعية، والتي قد تكون ناجمة عن عدة حقن الحيوانات المنوية. - نقل المشقوق الأجنة بما في ذلك الأجنة المشقوق بشكل غير طبيعي لحضانة المتوسطة (إعداد 500 مل: 20 غراما من Ficoll (4٪)، و 5 مل من 10X MMR و 500 ميكرولتر من الأسهم 1،000x PS).
- احتضان الأجنة إما في 16 ° C أو 18 ° C حاضنة بين عشية وضحاها.
- صباح اليوم التالي، ونقل امبريالسراج إلى 0.1X MMR والاعتماد على قيد الحياة الأجنة.
- في المتوسط، يمكن أن حوالي 10٪ من البويضات حقن الحيوانات المنوية تطوير لمرحلة الشرغوف السباحة (الشكل 3A).
- إعداد ماصة الزجاج لنقل البويضات الناضجة.
Representative Results
تم فحص التطور الجنيني للأجنة باستخدام الحقن المجهري في المختبر نضجت البويضات (الشكل 3A). معدلات نضوج البويضات GV إلى مرحلة صناعة المعلومات هي متغيرة وتعتمد إلى حد كبير على نوعية البويضة. في تجارب جيدة، ما يقرب من 100٪ من البويضات GV الاستجابة لهرمون البروجسترون، وتظهر علامات نضوج البويضة، ليصبح البيض أخيرا في مرحلة صناعة المعلومات. وتعرض جميع البويضات نضجت إلى الحقن المجهري وحوالي 25٪ من البيض حقن المشقوق (الشكل 3A، ن = 13 من أجل السيطرة سارعت البويضات حقن بنسبة ضئيلة و n = 7 لا لحقن البويضات بنسبة ضئيلة). ما يقرب من 60٪ أو 80٪ من الأجنة المشقوق، التي تنتج من السيطرة البويضات حقن بنسبة ضئيلة أو غير حقن بويضة، على التوالي، وصل إلى مرحلة الأريمة / المعيدة. بين أجنة الأريمة / المعيدة، كان ما يقرب من نصف الأجنة في عينات حقن بنسبة ضئيلة من نوعية جيدة (تقريبا أي علامات على الانقسام الشاذ وموت الخلايا المبرمج) في حين كانت 82٪ من الأجنة الأريمة / المعيدة ذات نوعية جيدة في نعينات حقنه في (الشكل 3A). وأخيرا، وصلت 41٪ و 11٪ من الأجنة المشقوق في عينات حقن بنسبة ضئيلة استجابة العضلات والمراحل الشرغوف السباحة، على التوالي، في حين أن 60٪ و 29٪ من الأجنة المشقوق في عينات غير حقن فعلت (الشكل 3A). هذه الأجنة ICSI هي خليط من الأجنة العادية وغير العادية (الشكل 3B). بعض منهم الخضوع التحول وتطوير لتنضج الضفادع 8. وتشير هذه النتائج إلى أن حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد إلى البويضات GV، تليها IVM والحقن المجهري، ويسمح كفاءة التطور الجنيني المبكر. على الرغم من أن حقن oligos العقاقير نفسه يقلل التطور الجنيني، فإننا لا نزال قادرين على الحصول على ما يكفي من الأجنة لأغراض عديدة التجريبية مثل فحص معدلات النمو، RT-PCR، وصمة عار الغربية وهلم جرا.
تين لدى عودتهم 1: الأمثلة النموذجية لالقيطم المورق البويضات ذات نوعية جيدة أو سيئة النوعية لفي التجارب المختبرية النضج. (A) مثال على البويضات نوعية سيئة. على سبيل المثال، لا يتم استخدام البويضات يظهر تصبغ غير مكتمل لتجارب لاحقة. كل القيطم المورق البويضة حوالي 1،2-1،4 ملم في القطر. (ب) بويضة defolliculated جزئيا. وتغطي النصف الأيمن من بويضة من قبل خلايا بصيلات، والتي يمكن تمييزها من خلال وجود الأوعية الدموية. سهم يبين منطقة خالية من خلايا بصيلات وحيث يتم حقن إبرة الحقن. (C) مثال من البويضات ذات نوعية جيدة، والتي هي متساوية الحجم وتظهر نصفي الكرة الأرضية الحيوان المصطبغة بالتساوي مع تباين واضح بين نصف الكرة الحيوانية والنباتية في نصف الكرة الأرضية.
2496 / 52496fig2highres.jpg "/>
الشكل 2: القيطم المورق البويضات قبل وبعد النضج بعد نضوج البويضة، تظهر بقع بيضاء واضحة في الجزء العلوي من نصفي الكرة الأرضية الحيوانية وخلايا بصيلات ومقشر قبالة. كل بويضة القيطم المورق حوالي 1 ملم في القطر.
الشكل 3: تطوير الأجنة ICSI، التي تنتج من البويضات في المختبر نضجت. تتلخص (A) وضع الأجنة ICSI إلى كل مرحلة. تم حقن البويضات مع التحكم سارعت أليغنوكليوتيد] العقاقير (مراقبة حقن بنسبة ضئيلة) أو بدون حقن (غير حقن)، تليها IVM والحقن المجهري. يظهر رقم المقابلة من الأجنة في كل مرحلة فوق القضبان. يعني هو مبين ± SEM. N = 4-13 تجارب مستقلة / و مختلفةemales. (ب) أمثلة على قيد الحياة الأجنة ICSI. تم إنتاج هذه الأجنة مرحلة tailbud في تجربة واحدة، التي استخدمت فيها حوالي 200 البويضات كمادة البداية.
Discussion
نحن هنا بالتفصيل طريقة جديدة لاستنزاف العوامل الأمهات أو بإفراط عن عوامل خارجية قبل الإخصاب. يتطلب هذا النظام اثنين من إبر دقيقة جدا، ولكن بدلا من ذلك يتخطى عملية جراحية من الضفادع، وتستخدم في طريقة نقل المضيف 7،17. فمن الأمثل لإزالة خطوة عملية جراحية ضفدع من حيث رعاية الحيوان. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يجب أن تأخذ بعين الاعتبار لجودة الضفادع المضيف الأنثى لنقل التجارب، وهذا يعني أننا يمكن التخلص من عامل بيولوجي واحد أن يؤثر على نجاح التجارب. لذلك في هذا النظام نوعية البويضات التي تم الحصول عليها من الضفادع PMSG معبي هي عامل رئيسي البيولوجي التي هي مفتاح للتجارب الناجحة. نوعية البويضات يمكن الحكم بعد جمع defolliculation المبيض أو بعد. إذا لوحظ أي خلل في هذه المراحل، فمن الأمثل لجمع المبيض آخر من الضفادع جديد. نقطة أخرى عندما يمكنك التحقق من جودة البويضة هي بعد نضوج البويضة. إذا كانت أقل من 80٪ من progesteronتظهر البويضات المعالجة الإلكترونية علامات النضج، قد لا تكون قادرة على الحصول على عدد كاف من الأجنة لمزيد من التحليلات. استخدام defolliculation الأنزيمية بدلا من defolliculation اليدوي هو أيضا ميزة أخرى لاستخدام هذا النظام للحد من العمالة المطلوبة لdefolliculation. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن defolliculation اليدوي قد يعطي تطور أفضل من العلاج الأنزيمية.
كما هو مبين في الشكل (3)، ما يقرب من 10٪ من البويضات في المختبر نضجت يمكن أن تصل إلى مرحلة الشرغوف السباحة. يتم جمع هذه البيانات من 13 تجارب مستقلة بما في ذلك تلك التي أعلن عنها في 8 و التجارب الجديدة الحقن. يحتاج أسلوب نقل المضيف 75-150 البويضات في كل معاملة للحصول على بيانات ذات مغزى منذ 30-60٪ من البويضات نقل يمكن أن تصل إلى المرحلة العصيبة 17. أسلوبنا يبدأ عادة مع 200-300 البويضات في كل مجموعة التجريبية منذ ما يقرب من 40-60٪ من الأجنة المشقوق يمكن أن تصل إلىمرحلة استجابة العضلات. وتشير هذه البيانات إلى أن كلتا الطريقتين تدعم معدل التنموي معقول. لقد حصلنا حتى الآن 10 الضفادع على قيد الحياة من السيطرة حقن مرنا والسيطرة العقاقير البويضات حقن بنسبة ضئيلة باستخدام هذه التقنية، مشيرا إلى أن هذا النهج يدعم التنمية من خلال التحول.
ويقدم لنا بويضة طريقة التلاعب-ICSI فرصة لاختبار دور العوامل الأمهات أثناء التطور الجنيني المبكر جدا، بعد وقت قصير من الإخصاب. وبالإضافة إلى ذلك، overexpression من العوامل الكروماتين المغيرة قبل الإخصاب قد تجعل من الممكن لإعادة الكروماتين الأم قبل الإخصاب لفهم الدول لونين الأمهات اللازمة لنمو. ويجوز لهذه الاستراتيجية أيضا تعمل بشكل جيد مع الحالية وتحرير الأنظمة الجينات مثل النسخ، مثل المنشط المستجيب نوكلياز (TALEN) 18،19 وكريسبر / CAS9 20،21 منذ يمكن التعبير عنها حتى قبل الإخصاب هذه. لذا، نهجنا الجديد لديه potentiالقاعدة لاستخدامها في العديد من التطبيقات في المستقبل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | MSD Animal Health | Vm 01708/4309 | PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) | Sigma | A5040 | For anesthesia |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | For oocyte defolliculation. Store at -20 °C. |
| Drummond Nanoject | Drummond Scientific Company | 3-000-205/206 | For microinjection |
| glass capillary | Alpha laboratories | 7” Drummond #3-000-203-G/XL | For microinjection |
| Micropipette Puller | SUTTER Instrument | Model D-97 | For microinjection |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | For in vitro maturation and ICSI |
| 14 ml ultra-clear centrifuge tube | Beckman Coulter United Kingdom Ltd | 344060 | For sperm purification |
| OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) | Sigma | D1556 | For sperm purification |
| Digitonin | Sigma | D141 | Cell permeabilization reagent |
| Shaker | Hybaid | HB-SHK-1 | For oocyte defolliculation |
| Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) | ZEISS | Semi SV6 | For oocyte collection and microinjection |
| 50 μm pore filter | CellTrics | 04-0042-2317 | For sperm purification |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100XP | For sperm purification |
| 50 ml centrifuge tube | Cellstar Greiner Bio-One | 227261 or 210261 | Oocyte collection and defolliculation reaction |
| 15 ml centrifuge tube | FALCON | 352097 | For sperm purification |
| 90 mm Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20/C | |
| Easy-Grip Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Easy-Grip Cell Culture Dish, 35 x 15 mm | FALCON | 351008 |
References
- Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
- Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
- Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
- Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
- Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
- Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
- Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
- Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
- Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
- Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
- Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
- Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
- Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
- Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
- Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
