Abstract
Telomerer dysfunksjon-indusert tap av genomet integritet og tilhørende DNA skade signale og sjekkpunkt svar er veletablerte sjåfører som forårsaker vev degenerasjon under aldring. Kreft, med insidensrater sterkt økende med alder, er preget av korte telomere lengder og høy telomerase aktivitet. Å studere rollene telomere dysfunksjon og telomerase reaktivering i aldring og kreft, viser protokollen hvordan å generere to murine induserbar telomerase knock-in alleler 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible tert-Østrogen reseptor (mTERT-ER) og Lox propp-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollen beskriver prosedyrer for å indusere telomerer dysfunksjon og aktivere telomerase aktivitet i mTERT-ER og LSL-mTERT mus in vivo. De representative data viser at reaktivering av telomerase aktivitet kan bøte vev degenerative fenotyper indusert av telomerer dysfunksjon. I order å bestemme virkningen av telomerase reaktive på tumorgenese, genererte vi prostatatumormodell G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L og thymus T-cellelymfom modell G4 Atm - / - mTERT ER / ER . De representative data viser at telomerase reaktive på bakgrunn av genomisk ustabilitet indusert av telomerer dysfunksjon i stor grad kan forbedre tumorigenesis. Protokollen beskriver også fremgangsmåten som benyttes for å isolere neurale stamceller (NSC) fra mTERT-ER og LSL-mTERT mus og aktivere telomerase-aktivitet i NSCs in vitro. De representative data viser at reaktivering av telomerase kan forbedre selvfornyelse evne og nevrogenesen in vitro. Til slutt beskriver protokollen prosedyrene for å utføre telomere FISH (Fluorescens In Situ Hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Faste og Parafinefinn Embedded) hjernevev og metafase kromosomer dyrkede celler.
Introduction
Telomerase er et enzym som er ansvarlig for å opprettholde telomerer. Dette er repeterende sekvenser i endene av kromosomene som beskytter deres integritet. De viktigste komponentene i telomerase holoenzyme er en reverstranskriptase katalytisk subenhet (tert) og en RNA subenhet (TERC) som fungerer som mal for å legge til telomeric gjentar 1,2. Mens generelt trykkes i differensierte somatiske celler, utviser telomerase robust aktivitet og spiller viktige roller i kjønnsceller, kreftceller og stamceller.
mTERC og mTERT knockout mus gir stor in vivo modellsystemer for å studere funksjoner av telomerase i både stamceller og kreft. Den mTERC og mTERT knockout mus (G1) viste ingen åpen fenotyper grunn av den lange reserve av telomerer i mus tre. Men serielt intercrossing mTERC og mTERT knockout mus til sent generasjon (G5-G6) resulterte iprogressiv erosjon av telomerer og til slutt provosert alvorlig degenerasjon av svært proliferative vev 4. Late generasjon (G5-G6) mTERC - / - mus er infertile på grunn av høy forekomst av apoptose i testikkel og bakterie celle uttømming. G5-G6 mTERC - / - mus også vise degenerative fenotyper i svært proliferative vev inkludert benmargen, tarm og hud på grunn av høy forekomst av apoptose og defekt selvfornyelse evne i vev stilk / progenitor cellekamre 4. Blodkreft stamceller i benmargen av sen generasjon mTERC - / - mus utstillings tap av proliferativ potensial, kompromittert selvfornyelse evne, økt apoptose og, til slutt funksjonell utmattelse 5,6. På samme måte ble gradvis økt apoptotiske legemer i tarm krypter observert i hver suksessiv generering av G1-G6 mTERC - / - mus 7,8. THan skadelig virkning av dysfunksjonelle telomerer synes ikke å være begrenset til høye omsetnings vev ettersom både proliferasjon av voksne neurale stamceller in vitro og in vivo nevrogenesen ble alvorlig nedsatt i slutten av generasjonen (G4-G5) mTERC - / - mus 9 . Rollen til telomerase i stamceller er videre støttet av funnene i en sjelden menneskelig genetisk lidelse dyskeratosis congenita (DKC), som på noen måter ligner tidlig aldring 10,11. DKC er forårsaket av mutasjoner i TERC, tert, og gener som koder dyskerin, en kjerne telomerase subenhet, og andre dyskerin tilhørende proteiner 12. I gjennomsnitt, telomerer i DKC pasienter er kortere enn 99% av alders matchet kontroller. Den store sykelighet av sykdommen skyldes aplastisk anemi, som er forårsaket av defekt vedlikehold av hematopoetiske stamceller. Andre aspekter av sykdommen som for eksempel oral leukoplaki, spiker dystrofi, mentale retardatipå, testiklene atrofi og lungekomplikasjoner alle foreslår svekket funksjoner av vev stamceller og stamceller 10, funn i nært samsvar med de i slutten av generasjonen av telomerase knockout mus. DKC pasienter er utsatt for myelodysplastisk syndrom og har en økt forekomst av maligne slimhinne svulster. Dermed mangel av telomerase i humane pasienter rekapitulerer defekter i stamcelle funksjoner og tumor predisposisjon som er observert i slutten generasjon telomerase knockout mus.
Korte telomerer og høy telomerase aktivitet er kjennetegnene ved kreft. Som normale eller premaligne celler deler, lav eller fraværende telomerase aktivitet fører til eventuell erosjon av telomerer og aktivering av cellulære sjekkpunkter som ligner de provosert av DNA dobbel-strandet-pauser (DSB sin) 13. Som klassisk DSB, har telomere dysfunksjon vist å indusere p53 og tilhørende cellulære responser, så som begynnende alderdom og / eller apoptosis 14,15. Ved mutasjonsinaktivering av p53, er celle sykling og celle overlevelse forbedret i celler med telomere dysfunksjon, som gir en pro-kreftfremkallende mutasjons mekanisme preget av translokasjoner og regionale presiseringer og slettinger 16,17. Samtidig fort telomere dysfunksjon og tilhørende utbredt kromosomal ustabilitet (selv i p53 null-celler) ser ut til å begrense fulle ondartet progresjon av slike kreftformer. For eksempel, sent generasjon G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - mus viste signifikant redusert lymfom forekomsten sammenlignet med Ink4a / Arf null mus på grunn av telomerer avgang. I en annen studie, mer avanserte adenomatøse lesjoner i G4 mTERT - / - APC min mus ble sterkt undertrykt i sammenligning med APC min mus på grunn av betydelig vekst og apoptose 18,19. Denobservasjon at telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet hemmer tumorprogresjon ber spekulasjoner om at aktiveringen av telomerase kan mulig ondartet progresjon delvis av quelling genomisk instabilitet til et nivå som er kompatibelt med kreft cellelevedyktigheten og / eller nøytraliserende p53-avhengig eller sjekkpunkt-uavhengig mekanismer.
For å undersøke om telomerase reaktive kan stoppe eller reversere aldring av stamceller, og om telomerase reaktive kan fremme tumorigenesis mot et bakteppe av genomisk ustabilitet, genererte vi to induserbare murine telomerase alleler. Den første er 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible tert-Østrogen reseptor (mTERT-ER) fusjon knock-in allel. I fravær av 4-OHT, mus homozygote for mTERT-ER (utpekt mTERT ER / ER) er telomerase aktivitet mangelfull og opprettholde samme cytogenetiske og cellulære fenotyper som konvensjonell mTERT eller mTERC knockout modell. Ved 4-OHT behandling, kan tert-ER protein aktivitet gjenopprettes til nivåer kan sammenlignes med den innfødte TERT protein 20, 21. Den andre allelet er en roman induserbar TERT knock-in-allelet som inneholder en intronic loxP-Stopper-loxP kassett (LSL- mTERT); upon Cre-mediert eksisjon av LSL, mTERT er re-uttrykt under endogen uttrykk kontrollmekanismer 22.
Protocol
MERK: Alle trinnene i denne protokollen er godkjent av UT MD Anderson Cancer Center.
1. generasjon av mTERT-ER Allele
- Innføre knock-in målretting vektor inneholdende ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) oppstrøms og i ramme med den mTERT genomisk sekvens (ekson 1 til intron 2) og en LOX - PGK - Neo - Lox-fragment (figur 1A) i mus ES-celler med elektroporering.
- Kultur ES-cellene i neomycin for 6-10 dager. Pick neomycin-resistente kloner og ekspandere i 48 brønners plater. Pakk den genomisk DNA ved hjelp av et kommersielt kit og bekrefte knock-in allel av sørlige blot.
- Injisere to ES linjer med over 95% normale Karyotyper inn C57BL / 6 blastocysts med en micromanipulation kit under en invertert mikroskop. Implantere de blastocysts inn i livmoren av surrogatmødre 23. Mate høy grad mannlige kimærer (70-90%) til C57BL / 6 fehanner.
- Bekreft genotyping av heterozygote mTERT-ERneo dyr ved sørlige blot.
- Mate de heterozygote mTERT-ERneo dyr og EIIa-Grobunn dyr å slette NeoR kassett. Mate de heterozygote dyr til C57BL / 6 dyr i minst tre ganger, og ytterligere inter-rasen heterozygote mTERT-er dyr å generere homozygositet.
2. generasjon av LSL-mTERT Allele
- Introduser knock-in målretting vektor som inneholder en loxP - trippel Stopper - Neo - loxP fragment og mTERT genomisk sekvens (mellom exon 1 og intron 2, figur 1B) inn muse ES-celler med elektroporering 23.
- Kultur ES-cellene i neomycin for 6-10 dager. Pick neomycin-resistente kloner og ekspandere i 48 brønners plater. Pakk den genomisk DNA ved hjelp av et kommersielt kit og bekrefte knock-in allel av sørlige blot 23.
- Inject to ES linjer med over 95% normale Karyotyper inn C57BL / 6 blastocysts med en micromanipulation kit under en invertert mikroskop. Implantere de blastocysts inn i livmoren av surrogatmødre 23. Mate høy grad mannlige kimærer (70-90%) til C57BL / 6 tisper.
- Bekreft genotyping av heterozygote LSL-mTERT dyr ved sørlige blot.
- Mate de heterozygote dyr til C57BL / 6 dyr i minst tre ganger, og videre inter-rasen heterozygote LSL-mTERT dyr å generere homozygositet.
3. reaktive av Telomerase i mTERT-ER og LSL-mTERT Mus In Vivo
For mTERT-ER
- Steriliser alle kirurgiske verktøy før injeksjon.
- Bedøve musene med isofluran kammeret (4% for induksjons, 2% for å opprettholde) i 50% (vol / vol) oksygen / 50% (v / v) dinitrogen monoksyd gassblanding. Eller bedøve mus ved en ketamin-xylazine blanding (100 mg / kg kroppsvekt + 10 mg / kg kroppsvekt).
- Etter at dyp anestesi er nådd, fjernes dyret bedøvet fra induksjonskammeret, og holde hodet inne i røret forbundet med isofluran kammeret (2%).
- Knip foten pads til musene for å sikre at dyret er dypt bedøvet. Sette salve på begge øynene for å hindre øynene tørker ut. Tørk ryggen av musene med povidon-jodløsning.
- Injiser sakte-frigjørende 4-OHT pellet med presisjon trochar (10 g) under huden på ryggen og presse pelleten hele veien til midtlinjen mellom to skuldre.
- Tett snittet med såret klippet applier og overvåke mus for utvinning fra anestesi. Fjern binders 10 dager senere. Suppleringsvarme er ikke nødvendig fordi prosedyren er fullført innen kort tid.
- Periode av behandling med 4-OHT pellet bør være optimalisert i henhold til formålet med undersøkelsen.
For LSL-mTERT
<ol>4. Isolering av neuralstamceller og reaktive av Telomerase In Vitro
- Musene blir avlivet med karbondioksid, og hjernene fjernet. Følg protokollen av kommersielt tilgjengelige nervevev dissosiasjon kit som per produsent.
- Resuspender lyofilisert pulver i hetteglasset merket Løsning 4 med 1 ml cellekulturmedium for løsnings 4. Ikke vortex. Denne løsningen bør deretter alikvotert og lagret ved -20 ° C for senere bruk.
- Pre-Heat blandingen ved 37 ° C i 15 minutter før bruk.
- Gjør Enzyme Mix 1: Løsning 1 (50 mL) og Løsning 2 (1900 mL). Gjør Enzyme Mix 2: Løsning 3 (20 mL) og Løsning 4 (10 pl).
- Forbered 1950 mL enzym mix 1 for opp til 400 mg vev og virvle. Forvarm blandingen ved 37 ° C i15 minutter før bruk.
- Ta ut en-dagers mus hjerner, og holde forhjernene ved å fjerne olfactory pærer og lillehjernen. Hold forhjernen vev i en ml kald kultur medium siden fjerning og butikk i 4 ° C. Sørg for å behandle nervevev innen 1 time.
- Bestemme vekten av vev for å sørge for at 400 mg grense per fordøyelsen ikke overskrides. Plasser hjernen på lokket av en 35 mm diameter petriskål, og knuse hjernen ved hjelp av en skalpell.
- Anvendelse av en 1 ml pipette, tilsett 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) og pipettes stykker tilbake til et 15 ml rør. Skyll med HBSS (w / o Ca / Mg). Sentrifuger ved 300 x g i 2 minutter ved romtemperatur og suge supernatanten forsiktig.
- Legg 1,950 mL av forvarmet enzymblandingen 1 (løsning 1 og 2) per opp til 400 mg vev. Inkuber i 15 ml rør i 15 minutter ved 37 ° C, blandes ved å snu røret eller risting hvert 5. min.
- Forbered 30 pl enzym mix 2 per vevsprøve ved å legge til 20 & #956; l Løsning 3 til 10 mL av løsning 4. Deretter legger til prøven. Invertere forsiktig for å blande. Ikke vortex.
- Distansere vev mekanisk med en bred-tipped, brann-polert Pasteur pipette ved å pipettere opp og ned 10 ganger sakte. Unngå å danne luftbobler.
- Inkuber ved 37 ° C i 10 minutter, røret ble snudd hver 3 min.
- Gjenta steg 4,11 og steg 4,12 hvis vev er større enn 200 mg.
- Anvende cellesuspensjonen til en 70 um celle sil, plassert på et 50 ml rør. Påfør 10 ml PBS gjennom celle sil. Kast cellefilter og sentrifuger cellesuspensjon ved 300 g i 20 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten helt.
- Resuspender cellene med stamcellemedium til det nødvendige volum for ytterligere anvendelser.
- For å aktivere telomerase i LSL-mTERT NSCs, behandle cellene med 100 mikrometer 4-OHT i to dager. For å aktivere telomerase i mTERT-ER NSCs, holde cellene i dyrkingsmedium med 100 mikrometer 4-OHT.
5. telomere FISH
- Forbered metafase kromosomer fra dyrkede celler.
- For FFPE (Formalin Faste og Parafin Embedded) vevssnitt, deparaffinize i xylen og rehydrere i etanol serie i 5 minutter hver (100%, 90%, 70%, 50% etanol) og PBS i 5 min.
- Post-fix i metanol: eddiksyre (3: 1) for 1-2 timer. Dehydrerer i kald etanol serie i 5 min hver (70%, 90%, 100% etanol) og lufttørk. Vask i 1 x PBS ved 37 ° C i 5 min.
- Denaturere kromosomer i 4% formaldehyd ved 37 ° C i 2 min. Dehydrerer i kaldt etanol serie 5 min hver (70%, 90%, 100% etanol) og lufttørke.
- Anvende 12 og 25 ul av PNA-hybridisering blandingen til hvert objektglass. (Hybridisering blanding: 70% formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / mL tRNA, 0,5 ng / mL telomere eller cent prober)
- Forsegle dekkglass med gummi sement. Post-denaturering kromosom forbereder og vevssnitt ved 80 ° C for 4 mi. Hybridiser ved værelsestemperatur eller 37 ° C i 2-4 timer i fuktig kammer.
- Vask ved romtemperatur med vaskebuffer 2 x 15 min. (Vaskebuffer: 70% formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Vask ved romtemperatur 3 x 5 min med PBST. Counter-beis lysbilder med DAPI eller langt-rød fluorescens for mikroskopisk undersøkelse.
Representative Results
Strategier for å generere murine mTERT-ER og LSL-mTERT knock-in alleler ble beskrevet i figur 1A og 1B. Nærmere bestemt en loxP - trippel Stopper - Neo - loxP fragment ble satt inn mellom exon 1 og exon 2 av mTERT locus å generere LSL-mTERT allel. For å generere mTERT-ER-allel, ble ERT2-LBD domene i ramme med den mTERT-genet satt inn i N-enden av ekson 1. Vi viste at når telomerase ble transient reaktivert i telomere dysfunksjon mus ved å behandle dem med 4-OHT pellets for fire uker, degenerative fenotype kunne bedres i flere organer som hjernen (figur 2A) og testikler (figur 2B). For å bestemme virkningen av telomerase reaktivering på celler dyrket in vitro, har vi isolert neurale stamceller (NSC) fra slutten av generasjon G4 LSL-mTERT og G4 mTERT-er Mus. Vi har vist at når telomerase ble reaktivert i telomere dysfunksjonell NSCs, ble selvfornyelse evne NSCs sterkt øket (figur 3A), og in vitro nevrogenesen ble også betydelig forbedret (figur 3B). For å fastslå effekten av telomerase reaktive på tumorigenesis i sammenheng med telomere dysfunksjon, vi genererte PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostata svulst modell) og ATM - / - mTERT ER / ER (thymus T-cellelymfom modell) sent generasjon kohorter. Når telomerase ble reaktivert ved tamoxifen i disse mus med injeksjon (figur 4A) eller 4-OHT pellets i 8 uker (figur 4B), ble tumorgenese i stor grad forbedret både i prostatatumormodell (figur 4A) og thymus T-cellelymfom modellen (
Figur 1: (A) mTERT-ER knock-in strategi. TV, målretting vektor; WT, villtype-allel; KI, knock-in allel; LA, venstre arm; RA, høyre arm; E1, ekson 1; E2, exon 2; neo, PGK promoter-drevet neomycin resistente genet; ER, modifisert østrogenreseptor (ERT2) ligandbindende domene; DT, dyphteria toksingenet. (B) LSL-mTERT knock-in strategi. TV, målretting vektor; WT, villtype-allel; KI, knock-in allel; LA, venstre arm; RA, høyre arm; E1, ekson 1; E2, exon 2; neo, PGK promoter-drevet neomycin resistente genet; STOPPER, tre repetitive transkripsjonsstoppsekvenser; DT, dyphteria toksingenet.
Figur 2: Representative data å vise telomerase reaktive ameliorates degenerative fenotyper av organer Representative bilder av hjernen (til venstre). og testikler (høyre) av G0 og G4 mTERT-ER mus behandlet med placebo eller 4-OHT i 4 uker. Skala barer indikere 50 mikrometer. Re-print med tillatelse fra 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Representative data å vise telomerase reaktive forbedrer selvfornyelse og neurogenesis av nevrale stamceller in vitro (A) Representative bilder av nevrale stamcelles isolert fra G4 LSL-mTERT (øvre panel) og G4 mTERT-ER (nedre panel) vokser i stamcelle medium behandlet med bærer eller 4-OHT. (B) Representative bilder av in vitro neurogenesis (Tuj1 +) av nevrale stamceller isolert fra G4 mTERT-ER dyrket i differensiering medium (med 1% FBS) behandlet med kjøretøy eller 4-OHT. Skala barer indikerer 100 mikrometer.
Figur 4:. Representative data å vise telomerase reaktive forbedrer tumorigenesis mot et bakteppe av genomisk ustabilitet (A) Representative bilder av prostatakreft dissekert fra G0 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L behandlet med tamoxifen. Re-skrive ut med tillatelse fra 22. (B) Representative bilder av thymus T-cellelymfom dissekert fra G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlet med kjøretøy, og G4 Atm - / - mTERT ER / ER behandlet med 4- OHT i 8 uker. Skala barer indikere en cm.
Figur 5: Representative bilder av telomeric og centromeric FISH på FFPE mus hjernevev og meta (innfelt). Rødt indikerer DNA, grønn indikerer telomerer flekker, og cyan indikerer centromere farging. Skala barer indikere en mm.
Discussion
Her rapporterer vi generering av to induserbare murine telomerase alleler og hvordan å aktivere telomerase in vivo og in vitro. Den avgjørende skritt for å reaktivere mTERT-ER aktivitet er å holde en kontinuerlig konsentrasjon av tamoxifen, så vi velger å bruke fire-OHT tid-release pellets produsert av innovativ forskning of America. Pellets holde slippe 4OHT på en steady state blodnivå av en ng / ml for opp til 60 dager. I en tidligere studie, viste vi at reaktivere telomerase aktivitet med denne strategien var i stand til å forbedre de degenerative fenotyper som stamcelle utmattelse, svekket vev skader svar og organsvikt i flere organer som ble indusert av telomerer dysfunksjon i G4 mTERT ER / ER mus 20.
Annet enn å studere funksjonen av telomerase i aldring, kan disse to induserbare telomerase alleler også brukes til å studere kreft. Tidligere studier toknytte av disse allelene for å undersøke hvilken rolle telomerer avgang og telomerase reaktivering i utformingen av genomer og påvirker biologien til T-celle thymic lymfom 21 og prostatakreft 22. Disse to studiene viste at telomerer dysfunksjon i slutten generasjon G4 Atm - / - mTERT ER / ER og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L mus gir en mekanisme fyre oppkjøpet av tidlige mutagene hendelser for startfasen, men hindre progresjon av fullt ondartede svulster. Når telomerase ble reaktivert i sammenheng med telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet, DNA-skadekontrollpunkter og utbredt kromosomal ustabilitet ble undertrykket, som tillater den fulle utviklingen av ondartede svulster med nye biologiske egenskaper som ben-metastase av prostatakreft 21 og hjerne infiltrasjon av thymusc lymfom 21. Lignende fenomener ble også observert i andre krefttyper, inkludert tykktarmskreft og kreft i bukspyttkjertelen (personlig kommunikasjon med legene. Haoqiang Ying, Adam Boutin og Ronald DePinho).
Fordi TERT-ER-protein lett kan veksles mellom på og av tilstander, avhengig av om dyrene blir behandlet med tamoxifen eller kjøretøy, kan tumormodeller generert av mTERT-ER-allelet anvendes for å teste anti-telomerase terapi. I forrige undersøkelse, svulster generert i G4 Atm - / - mTERT ER / ER dyr ble løslatt fra 4-OHT; på telomerase utarming, svulster slutt krympet på grunn av gjeninnføringen av telomere dysfunksjon-indusert sjekkpunkter 21. Men noen av tumorene ervervet resistens i respons til telomerase utryddelse ved å aktivere en alternativ Forlengelse av Telomerer (ALT) mekanisme. Ytterligere karakterisering av disse ALT + resistente svulster viste at tHei har avvikende transkripsjon av gener involvert i mitokondrie biologi og oksidativt forsvar inkludert en master regulator av mitokondrie syntese og oksidativt forsvar PGC-1β. Knockdown av PGC-1β eller SOD2 (en annen regulator av oksidative forsvar) betydelig eliminerer ALT + kreftceller mens holde telomerase + kreftceller forblir relativt intakt 21.
En begrensning av disse to knock-in alleler er at de bare har råd til reaktivering av telomerase på endogent nivå, fordi de er i mors locus av telomerase genet. I de fleste humane cancere, er telomerase faktisk overuttrykt på et mye høyere nivå. For å øke nivået av telomerase, en modifikasjon vi kan vurdere er å sette inn mTERT-ER konstruere med en sterkere promoter som PGK (fosfoglyceratkinase) promoter inn Rosa26 locus.
I konklusjonen, disse to nye induserbare murine telomerase alleler gir enestående genetic verktøy for å studere funksjoner av telomerase i aldring og vev homeostase samt tumorprogresjon, spesielt under bakgrunn av forhånds ervervet telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet. Den mTERT-ER-allel kan også brukes til å studere anti-telomerase terapi ved å krysse inn i andre tumor utsatt musemodeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
| Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
| isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
| isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
| ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
| 4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
| Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
| wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
| clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| HBSS | Life technologies | 14025092 | |
| PBS | Life technologies | 10010023 | |
| xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
| methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
| acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
| ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
| formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
| PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
| PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
| 20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
| Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
| rubber cement | Walmart | Elmer's | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Bass, A. J., et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet. 43, 964-968 (2011).
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Blasco, M. A., et al. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. 91, 25-34 (1997).
- Lee, H. W., et al. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature. 392, 569-574 (1998).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447, 725-729 (2007).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing. Nature. 421, 643-648 (2003).
- Rudolph, K. L., et al. Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice. Cell. 96, 701-712 (1999).
- Wong, K. K., et al. Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation. Nat Genet. 26, 85-88 (2000).
- Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131, 4059-4070 (2004).
- Savage, S. A., Alter, B. P.
- Armanios, M.
- Vulliamy, T., et al. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature. 413, 432-435 (2001).
- Harley, C. B., Harley, S. W.
- Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).
- Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions. Cell. 92, 401-413 (1998).
- Chin, L., et al. p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis. Cell. 97, 527-538 (1999).
- Artandi, S. E., et al. Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice. Nature. 406, 641-645 (2000).
- Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans. Nat Genet. 28, 155-159 (2001).
- Greenberg, R. A., et al. Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse. Cell. 97, 515-525 (1999).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice. Nature. 469, 102-106 (2011).
- Hu, J., et al. Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer. Cell. 148, 651-663 (2012).
- Ding, Z., et al. Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases. Cell. 148, 896-907 (2012).
- Nagy, A. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).
