Summary
Biolistic transformasjon er en metode som brukes til å generere stabil integrering av DNA inn i genomet til de opportunistiske patogener Cryptococcus neoformans gjennom homolog rekombinasjon. Vi vil demonstrere biolistic transformasjon av en konstruksjon, som har genet som koder acetat kinase kondensert til den fluorescerende tag mCherry inn C. neoformans.
Abstract
Den basidiomycet Cryptococcus neoformans, en invasiv opportunistisk patogen av sentralnervesystemet, er den hyppigste årsaken til sopp hjernehinnebetennelse på verdensbasis som resulterer i mer enn 625 000 dødsfall per år på verdensbasis. Selv elektroporering har blitt utviklet for omdanning av plasmider i Cryptococcus, gir bare biolistic levering av en effektiv måte å omdanne lineært DNA som kan bli integrert inn i genomet ved homolog rekombinasjon.
Acetat har vist seg å være en stor fermenteringsprodukt under cryptococcal infeksjon, men betydningen av dette er ennå ikke kjent. En bakteriell vei består av enzymene xylulose-5-fosfat / fruktose-6-fosfat phosphoketolase (Xfp) og acetat kinase (ACK) er en av tre mulige veier for acetat produksjon i C. neoformans. Her demonstrerer vi biolistic transformasjon av en konstruksjon,som har genet som koder Ack fusjonert til det fluorescerende tag mCherry, inn C. neoformans. Vi deretter bekrefte integrering av ACK -mCherry fusjon inn i ACK locus.
Protocol
MERK: Den generelle ordningen med denne protokollen er skissert i figur 1.
1. C. neoformans Forberedelse
- For hver transformasjon reaksjon, vokser en 2-3 ml O / N kultur av C. neoformans i YPD-medium ved 30 ° C risting ved 250 rpm.
- Sentrifuger O / N kultur i 5 min ved 900 x g ved 10 ° C, og supernatanten kastes.
- Resuspender cellepelleten i hver 300 ul av gjær Pepton Dextrose (YPD) medium.
- Ved hjelp av glassperler, forsiktig spre 300 ul av den vaskede cellesuspensjon på YPD-agar inneholdende 1 M sorbitol.
- La platene til å tørke ved omgivelsestemperatur i 3-4 timer.
2. Gold Mikrobærere Forberedelse
- Suspender 0,25 g 0,6 um gullperler i 1 ml DDH 2 O, til sentrifuge i 1 min ved 900 x g pellet perlene, og fjern supernatanten.
- Resuspender gullperler i 1 ml av 100% etanol. </ Li>
- Fordel perlene inn i fire rør, 250 pl hver, og tilsett 750 ul av 100% etanol.
- Butikk gull perle porsjoner ved 4 ° C.
3. DNA Forberedelse
- Forberede oransje macrocarrier biolistic plater ved å senke dem i 100% etanol ved hjelp av pinsett. Plasser plater i en stor petriskål inneholder Drierite tørke (pass på at Drierite ikke berører skivene).
- Når det er tørt, trykker macrocarrier plater i holderne sølv plate (tidligere tørkes ned med 100% etanol).
- Vortex gull perler (fremstilt som i trinn 2) og 12 pl aliquot til et 1,5 ml mikrosentrifuge-rør, en slange pr transformasjon.
- Legg til hvert rør i rekkefølge: 2 ug DNA (fortrinnsvis 2 ul av 1 ug / ul av DNA), 10 pl 2,5 M CaCl2, og 2 pl 1 mM spermidin fri base.
- Sett opp en negativ kontroll som i trinn 3.4, men uten DNA.
- Vortex hvert rør og inkuberes ved romtemperatur i5 min. Knips forsiktig hvert rør innimellom for å suspendere de bosatte perler i løpet av denne inkubasjon.
- Spin-rør ved 225 xg i 30 sek til pellet DNA-belagt gull perler. Fjern forsiktig supernatanten (ved pipettering eller aspirasjon) og kast.
- Resuspender perler helt i 600 pl 100% etanol ved langsomt å pipettere opp og ned.
- Spinne rør ved 225 xg i 30 sek til pellet perlene uten emballasje. Fjern forsiktig og kast supernatanten.
- Resuspender DNA-belagte gull perler i 8 pl 100% etanol ved langsomt å pipettere opp og ned.
- Pipette DNA-belagt gull perler på midten av biolistic platen i en 1 cm diameter og la tørke.
MERK: En tørket gull sirkel synlig på midten av platen biolistic indikerer at en tilstrekkelig konsentrasjon av gull perler er tilstede.
MERK: macrocarrier plater lastet med DNA-belagt gull perler er nå klar til bruk med genet pistol.
4. Operating Gene Gun
- Slå på vakuumpumpen.
- Slå på helium gass ved å vri knappen mot klokken til et trykk på ca 2200 psi er nådd på trykkmåleren.
- Slå på genpistol ved å vippe den røde bryteren på venstre.
- Vær sikker på at vannstrømmen for vakuum og ventilen er justert slik at vakuumet vil nå 28 inches Hg innen 15 sek.
- Pass på at avstanden mellom bruddet platen og macrocarrier er ca 3/8 tomme.
- Rengjør hele kammeret ved å tørke ned med etanol.
- Senk brudd plater i 100% etanol. La det tørke på en steril overflate (f.eks petriskål).
- Bruk en momentnøkkel for å løsne bruddet plateholderen. Sett en ren brudd plate i holderen. Skru bruddskiveholderen tilbake på plass og trekk til med momentnøkkel ved å slå den en gang til høyre.
MERK: Skjæreplater vil bli erstattet etter hver shoot. - Dukke the mesh skjermer i 100% etanol. La det tørke på en steril overflate (f.eks petriskål).
- Når den er tørr, plasserer en vasket mesh skjermen på den hvite plastmonteringsplate. Plasser macrocarrier plateholderen DNA siden ned i platekammeret. Skru på sølv cap, og plasser monteringsplate i høyeste sporet.
MERK: mesh skjermen vil bli erstattet etter hvert skudd. - Plasser en YPD-agar-plate inneholdende 1 M sorbitol på bunnplaten.
- Lukket kammer dør og går i lås.
- Skyv og hold midtre rød bryter opp for å engasjere vakuum og la vakuum for å nå 28 inches Hg. Når riktig vakuumnivå er nådd, flytter denne bryteren til nedre posisjon. Når du er klar, hold ned den røde bryteren til høyre for å skyte. Når bruddet platen dukker, umiddelbart å løslate brannknappen og skyv den midterste røde bryteren i midtstilling for å lufte kammeret til 0 psi.
- Rense ut ruptur plate rusk og slå av genet pistol. Deretter slår du av Helium gass ved å vri på bryteren med klokken, og til slutt, slå av vakuumpumpen.
5. Plating transformerte celler
- Tillat transformasjonsplatene til å sitte ved romtemperatur i 4 timer for å tillate cellene å komme seg.
- Pipetter 700 mL av YPD inn på plate. Bruk en celle skrape til å forsiktig skrape cellene off av agar og pipette væske inn i en steril 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta dette trinnet for å sikre at alle cellene er blitt utvunnet fra platen.
- Pelletere cellene ved 225 x g i 30 sek. Fjern og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 500 pl YPD.
- Pipetter 100 ul av cellesuspensjonen på midten av YPD + antibiotiske plater og spres ved hjelp av glassperler.
- La inverterte platene ved romtemperatur i 3-4 dager. Som kolonier vises, patch på nytt YPD + antibiotika plater.
6. Genomisk DNA Isolasjon for PCR
MERK: Dette er en modifisert versjon ved hjelp av reagenss fra en DNA rensing kit (se tabell for material).
- Dyrke en 5 ml kultur av hver av de C. neoformans transformanter i YPD-væske ved 30 ° C risting ved 250 rpm O / N.
- Pellet 3 ml celler ved 900 xg, og resuspender i 600 ul lyseringskjerner løsning.
- Legg suspensjonen i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med 200 ul av 0,5 mm syrevaskede glassperler.
- Homogenisere i 45 sekunder i et mini beadbeater ved omgivelsestemperatur, kul røret på is, og gjenta.
- Tillat prøven å slå seg ned på is i 2 minutter, og supernatanten overføres til et nytt 1,5 ml rør. Tilsett 200 ul av proteinutfelling løsning til hvert rør, (100 ul for hver 600 ul av supernatanten gjenvunnet) og vortex kraftig i 20 sek.
- Tillate prøvene å slå seg ned på is i 5 min, og sentrifuger ved 11 000 x g i 3 min.
- Overfør supernatanten til et rent 1,5 ml rør inneholdende 300 ul av RT isopropanol. Bland forsiktig ved inversjon.
- Sentrifugere prøven på 11.000 xg i 2 min, fjern forsiktig supernatanten, og drenere rørene på tørkepapir.
- Tilsett 300 ul av RT 70% etanol til hvert rør, og forsiktig invertere for å vaske pelleten.
- Sentrifuger prøver på 11.000 xg i 2 min, og forsiktig fjerne alt av etanol.
- Renne røret på rene papirhåndklær, og la pellet lufttørke for 10-15 min.
- Legg 50 mL av DNA rehydrering løsning og 1,5 mL av RNase løsning til hver pellet og virvle.
- Sentrifugere prøven 5 s for å fjerne all væske fra lokket.
- Inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 min.
- Rehydrere DNA ved å inkubere prøvene ved 65 ° C i 1 time.
- Kvantifisere DNA spektrofotometrisk ved å måle absorbansen ved 260 nm (A 260 avlesning på 1,0 er ekvivalent med ~ 50 pg / ml dobbelt-trådet DNA), og bruke opptil 200 ng i hver PCR-reaksjon.
7. RNA Isolasjon forRevers transkriptase-PCR.
- Ved hjelp av en RNA rensing kit (se tabell of Materials), følger produsentens instruksjoner for å isolere RNA fra gjærceller ved hjelp av en minibeadbeater.
- Kvantifisere konsentrasjonen av RNA ved å måle absorbansen ved 260 nm (A 260 avlesning på 1,0 er ekvivalent med ~ 40 pg / ml enkelt-trådet RNA).
- Ved hjelp av en RT-PCR kit (se tabell of Materials), følger produsentens instruksjoner for å sette opp RT-PCR reaksjoner med ca 1 mikrogram av RNA. For de resultater som ble oppnådd i denne studien, bruker primere er oppført i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket biolistic transformasjon av C. neoformans kan oppnås ved å følge denne protokoll ordningen (figur 1). Med biolistic transformasjon, er en vellykket shoot av de belagte gull perler angitt med en gullring synlig på tallerkenen etter at DNA er skutt (Figur 2A). Kolonier skal vises i løpet av 4 til 5 dager da til venstre ved romtemperatur etter plating de gjen celler fra YPD + 1M sorbitol plater på selektive medier. Transformasjon av 2 pg av DNA bør resultere i 20 til 30 kolonier (figur 2B). Når kolonier vises, bør de gjenutstrøket på selektive medier for individuelle kolonier.
De individuelle kolonier kan bli dyrket i YPD medium, og både DNA og RNA kan isoleres fra disse celler og analysert ved PCR og RT-PCR for å bekrefte riktig integrasjon og ekspresjon. Ved denne protokollen blir brukt for merket genfusjon, som i dette eksempel, vil primerne må to glødning innenfor det kodende område av genet av interesse (primer 2) og innenfor det 3'-ikke-kodende område av genet av interesse (primer 4) (figur 3A). Med denne konstruksjonen, ble DNA amplifisert fra PCR-reaksjonen sekvensert for en bekreftelse på at den mCherry koden ble fusjonert i ramme til ACK-genet. En positiv bekreftelse PCR vil det være et større PCR-produkt fra DNA isolert fra de transformerte celler i forhold til det DNA som isoleres fra villtypeceller. En annen PCR reaksjonen vil også trenge å bli utført anvendelse av primer-sett (primere 2 og 5), hvor en primer hybridiserer utsiden av konstruksjonen, og i løpet av den omgivende genom (primer 5) for å bekrefte den korrekte rekombinasjon inn i den ønskede locus (primer 7 i tabell 1) (figur 3B). RT-PCR vil bli brukt til å sørge for at både genet av interesse og tag er begge blir uttrykt (Figur 3C). Sekvensering av RT-PCR-fusjonsprodukt indicates at merkelappen er riktig sammensmeltet til genet på RNA-nivå.
Ved denne protokollen blir brukt til å slå ut et gen av interesse, bør primersett for PCR utformes slik at en primer hybridiserer til en genomsekvens utenfor hvor konstruksjonen skal rekombinere i genomet, og den andre primeren hybridiserer enten i den kodende region av genet eller i det selektive markør. En positiv bekreftelse på at konstruksjonen har med hell og fullstendig rekombinert inn i genomet vil være tilstedeværelsen av den riktige størrelse produktet for primersett som hybridiserer innenfor markeringen, men ikke med primersett som hybridiserer til genet av interesse. En annen primer sett bør gjøres som har en primer som hybridiserer utenfor utformet konstruksjon, som brukes sammen med PCR for å bekrefte at rekombinasjon hendelsen fant sted på den riktige locus. I den samme konstruksjon for å opprette en utstansing, er RNA isolert fra både transformerte celler og villtype (WT) celler og RT-PCR er utført for å bekrefte at ingen ekspresjon av genet av interesse blir observert fra de transformerte celler.
Fordi en fluorescerende tag ble smeltet til ACK-genet, en bekreftelse på at rekombinasjon var en suksess i ønsket locus, og at RNA blir translatert til protein er gjennom fluorescerende mikroskopi (figur 4). Ideelt sett har forholdene allerede etablert der det er kjent at proteinet av interesse blir uttrykt. Imidlertid, hvis det fluorescerende signalet er for lav til å observere, er det en mulighet for at vellykket rekombinasjon fremdeles forekommet, men vekstbetingelser må endres i muligheten for at optimale forhold ikke er oppfylt for tilstrekkelig ekspresjon, noe som ville føre til en lav fluorescerende signal. Dette må være bekreftet gjennom andre metoder som en western blot.
"/>
Figur 1. Protokoll ordningen.
Figur 2A. DNA-belagte gull perler med hell skutt inn på en YPD + 1M sorbitol plate. En oransje plasteret sett i sentrum av YPD + 1M sorbitol plate er på grunn av DNA-belagte gull perler, hvilket indikerer riktig gull preparat, samt en vellykket skyte . Figur 2B. Transforming 2 mikrogram av DNA-resultater i 20-30 kolonier per plate. Hvis cellene ble fortynnet som nevnt i protokollen, er ventet ca 20-30 kolonier før plating på selektive medier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3A. Skjematisk av ACK: mCherry:.. Neo konstruksjon og primer utforming Figur 3B PCR benyttes for å bekrefte vellykket homolog rekombinasjon. Felt 1 og 2: PCR-produkter erholdt ved å bruke primerne 2 og 5 (tabell 1) med genomisk DNA fra villtype-C. neoformans H99 (kolonne 1) og ACK: mCherry transformert stamme, (felt 2). Forventede størrelser er 1511 og 5622 bp, henholdsvis. Kolonnene 3 og 4 er de DNA-produkter av C. neoformans H99 (forventet størrelse 1443 bp) og ACK: mCherry (forventet størrelse 5552 bp) stammer, respektivt, ved anvendelse av primere 2 og 4 i tabell 1. Sporene 5 og 6 er de DNA-produkter av C. neoformans H99 (bør ikke gløder) og ACK: mCherry (forventede størrelse 3016 bp) stammer, henholdsvis ved hjelp av primere 1 og 3. Figur 3C RT-PCR bekreftelse av uttrykk for mCherry tag.. De beste baner er cDNA produkter av ACKmCherry fusjon produkt (forventet størrelse 683 bp) forsterket fra C. neoformansH99 og ACK:. MCherry-stammer ved hjelp av primerne 2 og 3 i tabell 1. Den aktin-genet, ble inkludert som en kontroll, og ble amplifisert under de samme betingelser som ACKmCherry (forventet størrelse 567 bp) ved bruk av primerne 6 og 7 i Tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Fluorescens av mCherry tagget Ack. Mikroskopisk analyse av stammer produserer Ack smeltet til en mCherry tag med en eksitasjon optimal på 587 nm og en emisjons optimal på 610 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'- GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actin 1 | 5'- CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Actin 2 | 5'- CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tabell 1. PCR og RT-PCR-primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av utmerkelser fra National Science Foundation (Award # 0920274) og South Carolina Experiment Station Prosjekt SC-1700340. Dette papiret isTechnical bidrag nr 6283 av Clemson University Experiment Station. Forfatterne takker Dr. Lukasz Kozubowski for hans nyttige råd i utviklingen av denne endelige protokollen og Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, og Grace Kisirkoi for deres kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
