Abstract
在感染和炎症，循环单核细胞离开血流并迁移入组织，在那里它们分化成巨噬细胞。巨噬细胞表达表面Toll样受体（TLR），其识别通过进化保守在宽范围的微生物的分子模式。 TLR的发挥其通常与基因表达的改变相关巨噬细胞活化中发挥中心作用。巨噬细胞是在许多疾病的关键，并已成为用于治疗的有吸引力的目标。在下面的协议中，我们描述了一种方法来分离使用啤酒巯基醋酸盐培养基小鼠腹腔巨噬细胞。后者将提升单核细胞迁移进入腹膜，因此这将提高巨噬细胞的产量提高了10倍。几个研究已经进行了使用骨髓，脾脏或腹膜巨噬细胞。然而，巨噬细胞被证明是在分离更成熟，更稳定在它们的功能性和表型。因此，巨噬细胞小鼠腹腔分离提出了一个重要的细胞群，可以在不同的免疫和代谢的研究服务。一旦分离，巨噬细胞刺激不同TLR配体，因此基因的表达进行评价。
Introduction
网状内皮细胞吞噬系统是由细胞的各种组织和器官如骨髓，血液，肝脏和脾脏。巨噬细胞广泛分布在身体周围，在那里他们尤其参与先天免疫和适应性免疫应答，以控制和明确的感染。除了 其在宿主防御作用，巨噬细胞也发挥在伤口愈合和在维持组织稳态1,2-重要作用。此外，巨噬细胞不仅是重要的免疫功能，而且还积极参与铁稳态3。在人体中，铁的约80％存在于血红蛋白的红细胞内，其中，当衰老被巨噬细胞吞噬4。每日，这些巨噬细胞回收的红细胞来源的铁25毫克，并提供其传输到等离子体5。此外，感染和炎症期间，促炎症的巨噬细胞隔离血清铁，减少铁availabiliTY病原体，同时在全身和地方各级6-8。同时，研究表明，巨噬细胞和肝细胞为主名为生产铁调素抗菌肽被认为是铁代谢9，10主调节器。铁调素主要是增加了炎症刺激，是在慢性炎症11-13部分负责铁封存在巨噬细胞。在巨噬细胞铁调素的表达不是很好理解，我们研究Toll样受体在本条中的作用（Toll样受体）。该TLR是巨噬细胞主要发现，在它们的活化中发挥中心作用。另外，在肝脏中的LPS诱导的铁调素表达依赖于TLR4 13。因此，要执行我们的研究中，我们使用了基于小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法。
巨噬细胞系中的巨噬细胞螺柱广泛使用IES;尽管如此延长培养可以挑起基因损失和在这些细胞系中降低免疫功能。因此，从腹腔巨噬细胞的分离是至关重要的。
小鼠腹腔提供了一个理想的地点收获巨噬细胞13-15。孤立的小鼠腹腔巨噬细胞是便于对他们的免疫功能的几项研究。然而，在腹膜的巨噬细胞的数量不足以进行了广泛的研究，并估计每鼠约1×10 6巨噬细胞。因此，为了提高巨噬细胞的输出，无菌引发剂，例如巯基乙酸注射入细胞收获前的腹腔。巯基乙酸注射后，每只小鼠巨噬细胞的产率提高了10倍。尽管提高巨噬细胞产率，Brewer的巯基醋酸盐培养基充当诱导炎性反应，从而导致在招募的巨噬细胞，这马刺激性年，但没有必要影响基因的表达。因此，对照组包括未处理的巨噬细胞必须包括在每个实验。在我们的手中，并没有在未经处理的巯基乙酸检测铁调素表达其强烈的炎症刺激引起腹腔巨噬细胞。此外，研究表明，Brewer的巯基乙募集大量的巨噬细胞，但不激活它们16。另一方面，啤酒巯基乙引起的巨噬细胞显示增加溶酶体酶，但在杀死摄取微生物17的降低。然而，当与非引起的巨噬细胞16相比，吞噬能力不受影响。
一旦在菜培养的腹膜巨噬细胞成为粘附的，因此允许从其他类型的细胞从腹腔中分离的它们的分离。接着，分离的巨噬细胞进行攻击用不同的TLR激动剂。最后，表达从培养的细胞中提取，并使用定量逆转录酶 - 聚合酶链式反应（QRT-PCR）的基因表达进行了分析。
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Protocol
所有的程序都按照加拿大议会动物护理指南批准德中心杜RECHERCHE中心医院DE L'蒙特利尔大学的体制动物护理委员会（CRCHUM）之后进行。
1.分离鉴定，培养小鼠腹腔巨噬细胞，并
- 准备3.8％的啤酒中巯基乙酸盐。要做到这一点，暂停38克硫乙醇酸盐培养基1000毫升蒸馏水。带来溶液煮沸以完全溶解培养基。通过在121℃高压灭菌15分钟进行消毒。存储长达3个月在黑暗中，在室温18。
注：丢弃如果混浊发展其指示细菌污染。该溶液可以保存长达一年在黑暗中，如果保持无菌。 - 使用连接到23政针1毫升注射器，注射1毫升3.8％巯基乙酸布鲁尔介质进入腹腔每个亩腔本身并等待3天。使用新的注射器和针头每个鼠标。
- 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（100毫克/千克）麻醉小鼠，并用颈脱位安乐死的小鼠。通过检查呼吸频率确认正确的麻醉。通常快速呼吸表明，鼠标不深度麻醉。
- 洗每只小鼠用70％乙醇的腹部。使用剪刀，沿着腹膜的底部中线进行横向切割。
- 使用镊子，拉回来的腹部皮肤暴露腹膜透明皮肤。使用连接到20G针5毫升注射器，注入5毫升冷的DPBS到腹膜各小鼠的空腔。
- 对腹腔进行轻柔的按摩，然后小心吸液不进行打孔的任何器官。取出针和分配的腹膜液到50ml锥形离心管中。
- 离心，在400×g离心在冷冻离心机10分钟。细胞必须在整个过程中留下来的冷。弃上清，悬浮细胞沉淀在RPMI培养基1640
- 使用血细胞计数器，计数细胞并调整至细胞密度为1×10 6个细胞/ ml。
- 通过流式细胞表征分离的细胞的表型流式细胞仪使用每鼠和antibodie 1×10 6细胞对F4 / 80（对巨噬细胞的表面抗原表达的）。
2.细胞治疗
- 直接，分离后，加入1×10 6细胞到每个孔中。离开的小鼠腹腔巨噬细胞，在37℃进行1至2小时，他们中培养粘附到6孔板中。轻轻洗涤3次，用温PBS除去非粘附细胞。
- 随后，培养的细胞在900微升无血清DMEM 24小时在下面TLR配体的存在下：（Pam3CSK4-TLR1 / 2（0.5毫克/毫升）;聚（I：C）-TLR3（10毫克/毫升） ; LPS-TLR4（100纳克/毫升）;鞭毛-TLR5（100纳克/毫升）; FSL1-TLR6 / 2（100纳克/毫升）; ssRNA40-TLR7（1微克/毫升）; ODN1826-TLR9（1μM）。
注：准备为每个配体的10倍原液。中加入100μl后者向每个孔，由此进行10倍稀释。
3. RNA分离
- 通过移液管加入1ml TRIzol试剂至各孔，并通过细胞裂解物多次在6孔板直接删除所有介质和裂解细胞。孵育均化样品进行5至10分钟，在RT下，以允许核蛋白复合物的完全分离。
- 转移到裂解1.5毫升无RNA酶的DNA酶和无离心管。加入每1ml的TRIzol0.2毫升氯仿。摇管用手剧烈持续15秒，并培育它们在RT 5至10分钟。离心机在12000×g离心15分钟，在4℃。观察分离成较低红相（苯酚 - 氯仿）的混合物中，相间和无色上层水相。的RNA仍然只在水相中。
- 陈德良sfer仔细上层水相转移到新的管中，而不会干扰相间。通过用0.5ml异丙醇混合沉淀从它的RNA。孵育的样品在室温下10分钟，并离心以12,000 xg离心在4℃下10分钟。将RNA沉淀物形成白色沉淀在管的侧面和底部。
- 去除上清液。用1ml 75％的乙醇洗涤一次RNA沉淀。混合通过涡旋和离心样品在7500×g离心5分钟，在4℃。简要地干燥的RNA（空气干燥10分钟）。 RNA溶解于0.1ml DEPC（无RNA酶的水），并孵育10分钟，在55℃。
- 使用分光光度计定量RNA。为此，稀释样品于DEPC水100倍，并读取在260纳米的波长。那么RNA浓度将是：外径260×40毫微克/ UL×稀释因素。
- 均衡的RNA浓度和合成cDNA按使用RT-PCR系统用于第一链cDNA合成试剂盒制造商的指示。如每制造商的说明，测量基因mRNA水平实时PCR（45次）的实时DNA检测系统。正常化基因表达水平有两个看家基因，例如β-actin和GAPDH。
注：规范化RNA浓度为500微克/毫升，并使用0.5微克cDNA合成。
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Representative Results
我们首先特点分离小鼠腹腔巨噬细胞用流式细胞仪。要做到这一点，我们使用（F4 / 80）的抗体特异性识别只由巨噬细胞表达的标志物。这种特征是必需的，以确定分离的巨噬细胞的百分比和区分它们在分离过程得到的细胞之间。如图（ 图1），细胞的百分比表达抗原的F4 / 80被一致地为95％以上。接着，为了研究巨噬细胞中的基因表达，所述分离细胞用几种TLR配体：Pam3CSK4（TLR1 / 2），LPS（TLR4）和FSL1（TLR6 / 2）。随后，铁调素（HAMP），我们感兴趣的基因，的表达水平通过RT-PCR测定。所示（ 图2），TLR1 / 2，TLR4和TLR6 / 2配体均能够刺激的hepcidin的mRNA在小鼠巨噬细胞19。总之，这些结果表明，该协议成功的有用LY隔离小鼠腹腔巨噬细胞和精确地进行调查的基因表达的分子调控。
图1.表征细胞从腹腔回收的巨噬细胞。富集分离的是通过使用F4 / 80抗体阻断非特异性染色与CD16 / CD32抗体后流式细胞术分析证实，并一致地为95％以上。
图2. TLR配体诱导铁调素表达在小鼠腹腔巨噬细胞后小鼠腹腔巨噬细胞的分离和刺激TLR1 / 2，TLR4和TLR6 / 2配体，铁调素mRNA表达水平通过定量逆转录酶-聚合酶链式反应分析。数据表示为平均值±SEM;ND（未检出）; * P <0.05与控制（Ctrl键）。结果代表独立进行的3类似的实验。
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Discussion
巨噬细胞是生存的关键，并提供了一个诱人的目标来操纵宿主免疫学的目标。 Toll样受体和其他识别分子的发现进行了巨噬细胞免疫学争论的中心。巨噬细胞对多种刺激，包括细胞因子，损伤相关分子模式分子（DAMPS）20和与病原体（的PAMP）21组相关联的分子响应。这些不同的刺激响应代表的巨噬细胞的活化过程中，与通常与突然改变有关的基因表达22。
在非炎症条件下，多数的巨噬细胞的存在于在体内的战略位置。它们可以在所有组织和如在血液循环单核细胞中找到。因此，巨噬细胞是存在于最容易受到位点微生物的侵袭。
宿主防御被描述为一个i-nflammatory响应于消除与传统巨噬细胞活化相关的细胞内病原体。巨噬细胞的经典激活由微生物产物诱导的诸如在Th1型细胞因子环境脂多糖这将导致促炎性M1巨噬细胞中的极化。炎症导致的组织损伤的持久性和必要的主机的生存抗炎机制的发展。因此，Th2细胞因子允许再引入抗炎M2巨噬细胞极化的抑制和调节M1响应，并且也促进组织修复。在本文中描述的协议，巯基乙注射在腹腔刺激经典炎症级联，导致M1巨噬细胞的募集。
迄今为止，一些研究已经进行了使用骨髓，脾脏或腹膜巨噬细胞。这些巨噬细胞代表heterogeneOU的人群有不同的活动。根据它们的形态和表面分子的特性，研究已经证实，腹腔巨噬细胞比骨髓和脾衍生的巨噬细胞23更成熟。与脾和腹膜衍生巨噬细胞，骨髓来源的巨噬细胞存在于pahgocytosis和增殖了非凡的能力，可以从巨噬细胞祖细胞20,24,25完全区分。此外，骨髓巨噬细胞的分离呈现均匀收率，使用寿命长。另一方面，这些巨噬细胞没有充分表征，其在实验研究中使用呈现由于并发症到它们的表型的反复无常和功能26。不像骨髓来源的巨噬细胞，脾巨噬细胞腹膜似乎更在功能和表型稳定的23。
小鼠腹腔巨噬细胞Ç因此，隔离一个服务于不同的免疫学研究和基因表达分析。此外，鼠标腹腔，得到一个理想的站点收割定居巨噬细胞27。然而，被诱发数目就是中等，而周围每只小鼠1×10 6个噬估计。因此，为增加巨噬细胞的收获，引发剂，如巯基乙酸盐中细胞分离28前3天注入腹腔。此代理将诱发的炎性反应，并相应地提高巨噬细胞的作物。
它的当务之急慢慢抽出腹腔液不进行打孔任何机关进行轻柔按摩腹腔。拉出最大可能的量需要收集的最大细胞数量。万一血液污染，裂解缓冲液可以使用在该过程结束时丢弃的红血细胞。所述引发巨噬细胞然后可以特征在于流式细胞仪利用抗体针对抗原所特有的巨噬细胞作为F4 / 80年。
在整个过程中，确保所有试剂内毒素和无饲养无特定病原体条件下，所有的动物永久。无病原菌条件下执行此过程是至关重要的，因为巨噬细胞刺激之前，即将到来的实验将显著改变的结果分析。
一旦分离，腹膜的巨噬细胞可以通过多种研究，包括炎性细胞因子，吞噬作用，细胞信号，基因表达，趋化性和毒理学29的使用。例如，刺激不同TLR配体后，我们在引起巨噬细胞研究的铁代谢命名的hepcidin的关键调节的分子调控。细胞治疗后24小时，提取总RNA用TRIzol试剂，并使用定量RT-PCR检测基因表达进行了分析。
_content“>由于我们正在研究的TLR的激活和基因表达，使用无血清DMEM的建议。无血清培养基减少污染物的程度和消除传染剂的任何潜在来源。尽管RNA分离似乎是一个简单的过程，核糖核酸酶和DNA污染，必须避免以防止RNA降解，实现准确的定量RT-PCR结果。以检测DNA污染的最好办法是将包括一个“负RT'控制用于在RT-PCR实验的每个RNA样品。如果PCR产物是从RNA样品，这不是反转录，然后将产物从污染的DNA扩增产生的。万一DNA污染，使用DNA酶处理是可能的。然而，DNA酶必须完全之前，RT-PCR灭活，以便它不会降低新合成的DNA。
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Acknowledgments
这项工作是由加拿大自然科学和工程研究理事会资助项目（NSERC，不授予298515-2011）。 AL是一个博士的接收者从自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会，和MS奖学金从健康研究的加拿大学院资助项目（CIHR，不授予。MOP123246）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
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