RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Introduction

前立腺は、主に平滑筋¹で構成される線維筋間質に囲まれた腺房に配置された分泌上皮で構成される異種の組織です。基底細胞、分泌細胞、神経内分泌細胞、トランジット増幅細胞と幹細胞の^2：上皮の区画は、5つの異なるが、組織的な細胞型で構成されています。管腔の上皮細胞から生じる前立腺癌（PCA）では、腺癌の成長は、間質コンパートメント³の明白な進行性の低下の原因となります。これらの理由のために、組織標本は、PCaの程度に基づいて、間質および上皮細胞型の割合の明確な違いがあります。これらの差異は、所望の細胞型の顕微解剖に関係なく、全体の組織から取得した遺伝子発現データのバイアスされた仮定を導くことができます。したがって、このバイアスを除去するために、RNA抽出前に別個の細胞型に必須であると遺伝子発現解析。

Macrodissectionまたは顕微解剖は、物理的に周囲の間質^{4 -6}から十分に特徴付け上皮領域を分離するために使用することができます。 Macrodissectionは通常、解剖顕微鏡下でのかみそりの刃で行われ、大規模なPCAが間質から結節分離に適していますが、間質を取り巻くから良性の上皮を除去することができるではありません（ 図1の良性前立腺組織像の例を参照）。レーザー（LCM）と顕微解剖はmacrodissectionよりもはるかに多くの労働集約的であるが、非常に正確に良性の上皮^4を分析することができます。

我々の研究室からの最近の刊行物は、RNAが正常にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）生検または凍結組織^4,7-9のいずれかからLCMによって抽出することができることを示しています。 LCM-RNA抽出の主要な課題は1である）を正確に組織の所望の領域を分析するため、及び2）Rを保存しますLCMおよび分離プロセス^4,10の間に整合性NA。純粋な細胞集団から単離したRNAを逆転写定量的PCR（RT-qPCRの^）7,8、マイクロアレイ^11、及び深い-sequencing ^12-14を含むいくつかの方法によって、遺伝子発現解析のために使用することができます。

このプロトコルの目的は、下流の遺伝子発現分析のために凍結した組織からのLCMの前立腺上皮からの全RNAを単離することです。

Protocol

これらの実験に使用したすべてのヒト組織は、シカゴのイリノイ大学の治験審査委員会承認されたプロトコルおよび/または免除を介して取得されました。

1.第新鮮凍結前立腺PEN-スライドへと荷電スライドガラス上に

1. 一日前または数時間サンプルを切片化する前に、きれいなツール（ すなわち、ブラシ、ピンセット、coplins、ブレード、PEN-枠スライド（いない場合は、すでにRNaseを含まない）、ETOH安全マーカーや鉛筆）との内部スプレーボトルとラボワイプを使用して、RNaseを除染液を用いたRTクライオスタット。
   1. RNaseを除染液および70％エタノール（depcH ₂ 0を用いて調製）との最後のすすぎの上に左を削除するには、depcH ₂ 0で洗い流し、RNaseを除染液は拭き取る前に5分間静置します。
      注：これは、RNaseフリーワークスペースを維持することが不可欠です。すべてcoplins、ツール、冷凍封入、ブレードおよび使用スライドはRNaseを含まない仕事のためにのみ使用する必要がありますそして、標準的な非RNaseを含まない環境で使用されることはありません。すべての機器は、各実験の前のRNase汚染除去溶液で処理する必要があります。
2. -24℃に冷却し、クライオスタット。
3. スライド100％エタノール、ツール、小さな凍結組織カセットと装着チャックでコプリンに満ちた：前の切片に少なくとも30分を冷却するクライオスタット内部で、次の洗浄のRNaseフリーの器具を配置します。
4. 輸送のためにドライアイスを充填した発泡バケットに凍結保存し、場所から凍結した前立腺組織を取得します。少なくとも30分間温度をクライオスタット平衡にクライオスタットに組織を配置します。
   注：レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのためのヒト前立腺組織は、新鮮凍結、またはホルマリン固定のいずれかパラフィン包埋（FFPE）することができます。時間の制約とスライドの準備は、組織源との間にわずかに異なります。ここでは、凍結切片のための手順を説明します。
5. 一度に一つの組織と協力し、だぼっに凍結された封入剤を噴出カセットのMとすぐには冷えた鉗子を使用して凍結されたマウンティング培地中に凍結された前立腺組織をマウントします。
6. 凍結されたマウンティング培地を設定するために5分間クライオスタット内チラーに組織にカセットを置きます。
7. チャック上に凍結された封入剤を少量噴出し、慎重に凍結されたマウンティング培地上に取り付けられた組織下側を押してください。 5分が凍結された封入剤が完全に固化することを可能にするためのクライオスタットに設定してみましょう。
8. ホルダーにチャックを配置し、締めます。
9. ロックされた位置でハンドルをロックし、クライオスタットに新しいブレードを配置します。増幅工程（ すなわち、定量PCR）を含む下流分子のエンドポイントの場合には、汚染を防止する（または次のサンプルに対して、ブレードの面積を使用するように刃を上に移動）するために、各患者のための新しいブレードを使用することをお勧めします。
10. ハンドルのロックを解除し、慎重にしても、50μで組織を露出させるために手またはフットペダルで組織を進めます所望の組織の曝露までメートル部に到達します。
11. 5μmのクライオスタットを調整し、一つまたは二つの部分を切断して（ステップ2を参照）、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色するための荷電スライドガラス上に配置します。
12. すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを配置します。
13. エタノールから充電スライドガラスを削除し、H＆E染色（ステップ2）に進む前に、室温でそれが乾燥してみましょう。
14. フレームサポーターにRT PEN-フレームスライドを置きます。
15. RT PENフレームスライド上に10ミクロンと場所のセクションにクライオスタットを調整します。四つの部分の一つは、組織の大きさに応じて、各スライド上の場所であることができます。
16. すぐに2分間の冷100％エタノールにスライドを突入。
17. エタノールからPEN-フレームスライドを削除し、LCMの準備ができるまで-80℃の冷凍庫にデシケーターボックス内でスライドボックスでスライドを保存します。三日後、最適なRNAの回収の最大蓄積時間です。
18. 充電ガラスがスライドのみステップ2に進んでくださいE。 PEN-フレームスライドのステップ3に進みます。

2.ヘマトキシリン​​およびエオシンY（H＆E）組織学的マークアップのための染色

注：この充電スライドガラス上の組織およびNOT LCMのためのPEN-フレームスライドの場合。

1. 以下のように段階的エタノールを通してスライドを浸漬荷電したガラススライド上に切片を水和：3分間二、70％エタノール中で一回、3分間、3分間、スライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回浸し3分間蒸留H _{2 O}で倍。
   1. 99 mlの70％エタノール+ 1 mlの1％HClおよび0.1％重炭酸ナトリウム溶液_：H 2 Oを100mlの蒸留中に0.1グラムの炭酸水素ナトリウム酸アルコール溶液を調製します
2. 5分間ヘマトキシリン​​ギルII（0.4％）でスライドを浸し。
3. 3分間定常走行タップH _{2 O}中の過剰な汚れを洗い流します。
4. 酸アルコールでスライドを10回浸し
5. 3分間水道H _{2 O}を実行するには、スライドを洗浄します。
6. スライドを浸し青紫に色をオンに30~60秒間0.1％重炭酸ナトリウム溶液です。
7. 3分間水道H _{2 O}を実行するには、スライドを洗浄します。
8. 10ディップで、95％エタノールでスライドを洗浄します。
9. 15秒の合計エオシン-Y 2-3回でスライドを浸し。
10. 次のように段階的エタノールを通してスライドを脱水：キシレンにスライドを95％エタノールで2回、100％エタノールで2回、そして2回浸し（組織は徹底的に脱水を示した明確な表示されますことを確認してください）​​。
11. 非水性永久ハード封入し、カバースリップでスライドをマウントします。
12. 30分間スライドを乾燥させてください。
13. 任意の整数のスライドスキャナでスキャンスライドとは、8 "×11"紙の上に大きな、高解像度の画像を印刷します。
14. 興味の概要エリアがマーカーで（一般的にボード認定病理学者によって行われます）。このマークアップは、LCMの手続きのためのガイドです。

PEN-フレームスライドの3トルイジンブルー染色

注：番目LCMと同じ日に行われています。すべてのソリューションをdepcH _{2 O}水を使用してください。 RNaseフリーエリア内のすべての手順を実行します。すべてcoplinsはRNaseを除染液で洗浄しなければなりません。

1. LCMの日は2分間、その後2分間90％エタノールに静かに浸漬スライドすることにより、75％エタノールを-80℃の冷凍庫や水和物からPEN-フレームスライドを削除します。
   1. その後、室温で0.2μmのフィルターとストアを介して滅菌フィルタ分子生物学グレードの水に溶解して0.5％のトルイジンブルーを用意。この溶液を6ヶ月までに再利用することができます。注：それは非常濾過の前に数時間かかることがありますように溶液を調製することをお勧めします。
2. 静かに5-30秒間0.5％トルイジンブルーにスライドを浸漬することにより、前立腺組織を染色します。 3分30秒75％エタノール、続いて15秒間の洗浄スライドによる組織depcH ₂ Oで2回脱色。注：染色及び脱色時間は、良好な染色性を確保するように調整することができます。前立腺は、汚れを超える傾向にあります。

4.レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）

1. LCM、15分間42℃で暖かいスライド上の乾燥したスライドの直前に。それらの準備ができるまで処理され、氷の上に残りの部分を保存するだけでスライドドライ。
2. LCMとコンピュータの順に、顕微鏡パワー、レーザーキー、レーザースイッチしてから、コンピュータの電源をオンにします。レーザーマイクロダイセクションのソフトウェアを起動します。
3. スライドとコレクションチューブをロードするために顕微鏡を制御するためのソフトウェアを使用してください。その後、「続ける」をクリックし、「アンロードサンプルホルダー」をクリックして下に向けて組織を顕微鏡のスライドホルダーにセクションを含むスライドをロードし、顕微鏡での適切なスロットにスライドホルダーを挿入します。
   1. 「コレクションチューブをアンロード」、ラベルをクリックして、チューブホルダーに0.5ミリリットルチューブをロードし、機器内の適切なスロットに挿入します。一度キャップは、収集キャップに溶解緩衝液の35μlを添加し、気泡を回避しようと、固定されています。その後、「OK」をクリックします。
      注意：25μlの溶解バッファーを10μlのdepcH2Oで：蒸発は問題がある場合は、次のようにバッファーを希釈します。
4. ソフトウェアでは、スライドは、スライドホルダーに置かれている位置を選択します。 LCM標本を収集するために、コレクションキャップを選択します。
5. 視覚化し、10Xでコンピュータを介してスライドを集中。その後、「キャリブレーション」「レーザー」を選択することで、レーザーを校正するためのソフトウェアを使用してください。完全にかつ効率的に選択した領域をカットするレーザービームを可能にするために、次に「コントロール」の「レーザー」を選択、レーザーのパワー、絞りと速度を調整します。完全に組織を通るレーザーカットまで調整を繰り返します。
6. ガイドとして8 "×11"病理学者のマークアップを使用して、epitheの所望の領域に外接する「図形を描画」ツールを使用しますビューのliumとは、任意の間質を収集しないようにしてください。
   複数の領域を1つのビュー内で選択することができますが、「形をカット」ツールをクリックすることで、第一の切断することなく、別のビューに移動しません。注意して​​ください。
   1. 領域が完全にレーザーでカットされない場合は、手動でその上に行くために「移動とカット」ツールを使用します。新しいビューに目標を移動する続け、スライドが完全に切開されるか、または組織の所望の量が収集されるまで、レーザー切断を繰り返す（一般的に100良性腺の150〜500 ngのRNAをもたらします）。 （ 図1Aの例を参照）。
7. 慎重に収集ホルダーからチューブを外し、キャップを閉じ、キャップに溶解バッファーと組織の意識です。簡単に説明すると、チューブの底に液体や組織を収集するために30秒間遠心します。 RNA単離のための準備ができるまで-80℃で30分間、店舗、42℃でサンプルをインキュベートします。

フィル5.全RNA単離ターベースキットと品質分析

1. 氷の上にチューブを解凍し、100μlに溶液の体積をもたらします。
2. フィルタの中心に30μlのofLysisソリューションを適用することにより、RNA単離キットのミクロフィルターを事前に濡らし、それは次の2つの手順（最低5分）whileperforming浸すことができます。
3. 溶解液に（キットに付属）LCM添加剤溶液3μLを加え、5秒間ボルテックスで混和します。チューブの底に液体を収集するために30秒間遠心分離。
4. 遠心液体を除去するためにトップスピードで〜30秒間予め湿らせたフィルター。
5. 軽くボルテックスまたはピペット上下、溶解液の混合物に、100％エタノールの1.25容量（この場合は129μl）を追加します。 **このメソッドは、大小両方のRNA種を回復します。
6. フィルターにRNAに結合する予め湿潤ミクロフィルター、および1分間万×gで遠心分離器にサンプルをロードします。その後、洗浄溶液1、R」の180μlのマイクロフィルターを洗います21; 1分間万×gで遠心します。
   注：すべての遠心分離で、この点は13,000×gで、または最高速度で実行する必要がありますから。
7. キットのプロトコールによって指示としてそれぞれ、「洗浄溶液2および3」の180μlの二回フィルターを洗浄してください。 30秒間遠心し、フロースルーを廃棄し、残留液を除去し、フィルターを乾燥させるために1分間スピンフィルター。
8. 新しいコレクションチューブにフィルターを転送します。
9. （キットに付属）-95°Cに暖かい溶出溶液。
10. フィルタの中心に予熱し、溶出溶液10μlを適用し、キャップを閉め、室温で5分間保存します。その後、RNAを溶出するために1分間遠心し、RNAの〜20μLを得、この手順を一度繰り返します。
11. 37℃で15分間のDNase I処理を行います。
12. 260 nmの吸光度を分光光度計により、RNAを定量化します。 260 nmおよび280 nmの波長での光学密度の比率は、純度を評価するために使用されRNA（ 表1参照^）15。

6.遺伝子発現解析

注：（mRNAおよびlncRNAsのような）長いRNA種の遺伝子発現は、ステップ6.1に示されており、（マイクロRNAのような）短いRNA種は、ステップ6.2に示されています。別のキットは、RT-qPCRのために利用可能であり、必要なRNAの量は、（10 ngのはわずか）キットによって異なります。 RNAの配列決定分析は、6.3に記載されています。

1. リバース議事録（RT）RTマスターミックス5μlの（RTバッファー、dNTPを、ランダムプライマー、RT酵素、RNase阻害剤）と20 ngの/μlのRNAサンプルの5μLを混合するcDNAへのRNA。 37℃で120分間、その後、25℃で25分間、反応をインキュベートし、85℃で5分間。
2. RNaseを含まない水を用いてRT反応1:10に希釈し、目的の遺伝子のためのプライマーまたはプライマー/プローブセットを用いて10μlの定量PCR反応あたり2.5μlのを使用しています。
   注意：部分的に分解されたRNAの解析を容易にするためにそれはfoのプライマーを使用することをお勧めしますR短いアンプリコン（100bp未満^）16。（表2B）
   1. マイクロRNA発現解析のために2-10 NG / RTマスターミックスの5μlのμlのRNAサンプルの5μLを混合することによって、RT反応を実行します。
      注意：それぞれの市販のPCRベースのマイクロRNA検出技術は、独自か​​つ特異的RTプライマーの使用を必要とします。
3. あるいは、またはRT-PCRに加えて、RNAの異なる種を定量化するために、次世代シーケンシング（RNA-seqのか小RNA-seqの）を使用します。製造業者および検出機器によって示されるように、典型的には、この手順（表3）のために500ngのRNAを使用し、方法を実施します。

Representative Results

以前の研究では、同じ患者⁴から凍結しFFPE前立腺組織からmRNAおよびマイクロRNAのRT-qPCRにより発現プロファイリングを比較する上皮および間質組織を収集するためのLCMの使用を実証しました。 LCMは、RNAの大量次世代配列決定分析のために収集される場合は特に、時間がかかります。そのため、作業スペースを維持するために重要であり、ツールは、RNaseフリー。これは、（次の段落で詳しく説明）を集め、RNAにおける品質および細胞特異性のコントロールを検討することをお勧めします。 図1は 、レーザー捕捉良性上皮の前と後に顕微鏡下でPEN-フレームスライド上の染色された前立腺のセクションを示しています。

試料を採取し、RNAを慎重に抽出された後、表1に示すように、RNAの質および量を評価することが重要である。これは、低い260/280 nmの比を観察することは珍しいことではありません。 RNA意志を集中260/280 nmの比を改善するが、それはまた、小RNA種の損失を引き起こす可能性があります。品質管理に加えて、組織（ - C図1B）のレーザー捕捉領域の特異性を確認するために、細胞タイプ特異的制御を調べることが重要です。例えば、 図1Bに AMACR遺伝子の発現は、正常な上皮組織に比べて前立腺癌上皮組織を確認するために測定されました、。 図1Cに NKX3.1の発現は、LCM-採取した試料中の間質が存在しないことを確認しました。試料中のRNAの質も知られ、優れた品質のRNAのRNAにcompareedすることができます。 RNAを抽出長く小RNA（ 表2）の品質を確認し、培養された初代上皮細胞から回収ようLCM-collected-組織から単離されたRNAについてのRT-qPCRのCt値は、同じ範囲内にあります。最後に、 表3は、このRNAは、次世代RNA sequenciための十分な品質であることを示していますNG。

図1：良性上皮のLCM-コレクション前後のトルイジンブルーで染色した良性上皮のコレクション、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるヒト前立腺から前立腺癌上皮と間質（A）は、前立腺生検。 （B - C）45人の患者からLCMによって収集された組織は、細胞のアイデンティティ⁷の適切な遺伝子マーカーを発現します。 （B）AMACRは、前立腺癌のマーカーであり、腫瘍組織においてのみ検出可能です。 （C）NKX3.1は、上皮のマーカーであり、間質組織では検出できません。この図は、Giangreco ら 、JSBMB 2015 ⁷から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1：LCM-収集前立腺組織からのRNAの質と量。

表2：RT-qPCRのLCM収集前立腺良性上皮から。

表3：LCM-収集前立腺組織からRNAseq。

Discussion

人間の標本から遺伝子発現プロファイリングは、利用可能な組織の品質や数量のでなく、与えられた組織標本に存在する様々な組織学的実体のためだけではなく、挑戦することができます。これは、良性組織が大きく、間質組織および癌の領域である間質を欠いていた前立腺では特に困難です。 LCMは、2つの異なる細胞タイプ（ 図1A）のより正確な署名のための前立腺間質および上皮のRNAの物理的分離を容易にします。 macrodissectionまたは全組織処理と比較して、LCMは、良性組織において細胞区画を分離するが、はるかに多くの費用がかかり、労働集約的であることができます。

任意の技術のように可能な落とし穴があります。例えば、RNAの品質は、初期試料調達中またはLCMおよび抽出手順中に部分的に分解することができます。最初のケースでは、遺伝子発現は異なる短いAMPLの測定を達成することができます定量PCRによってアイコン。後者の場合、すべてのツールと​​材料の綿密なRNaseを含まない治療は、RNA分解、ならびに組織切片の慎重な取り扱いおよび処理を防止するために取られるべきです。また、未満90分に1スライドに費やす時間を制限すること、収集プロセス中にRNAの品質を維持します。 LCM技術の最大の制約は、LCMの楽器へのアクセスで、LCMを行うのに必要な労働力です。

使用可能なレーザー捕捉顕微解剖顕微鏡のいくつかの種類があります。このプロトコルは、その後、以下のコレクションキャップに収まる領域を限定するためにレーザーを使用してLCMの使用を記載しています。 LCMのこのタイプは、収集するために、個別の多領域が含まれている前立腺組織における上皮と間質の分離のための理想的ですが、LCMのこのタイプは、組織からの単離単一の個々の細胞には適していません。例えば、このプロトコルは、常駐マクロファージを収集するために使用すべきではありません多くの場合、単一細胞として存在するS、神経内分泌細胞または浸潤リンパ球、。これらの他の細胞型の単離を容易に膜キャップ、上に組織から単一細胞を「撮影」するためにレーザーを利用する他のLCM機器および方法があります。

徹底した品質管理とRNAの特徴付けは、看過することはできません。 260 nmでの吸光度は、RT-qPCRの研究（ 表1）のためのRNAを定量化するのに適しているが、より正確に、染料ベースの方法をRNAは、配列決定のためのRNAを定量化します。 RT-qPCR分析におけるもう一つの重要な問題は、残留DNA汚染からの潜在的バイアスを回避することです。これは、イントロンにまたがるプライマーを用いることによって達成することができます。そこハウスキーパー遺伝子発現の高い患者の不均一は、したがって、複数のハウスキーパー遺伝子の使用も推奨されており、我々は通常、3つの^4,7-9 5に使用した （図1B - Cおよび表2）。

4を減少 RNAの比較的少量を必要とします。次世代のRNA配列決定は両方の短期および長期のRNA種のための発現を定量するための有効な手法です。次世代シーケンシングは、新規RNA種¹³の発見を可能にします。幸いなことに、次世代シークエンシングのコストが低下しています。

要約すると、このプロトコルは、凍結された前立腺組織から上皮またはストローマ細胞の均一な集団のRNA単離を可能にします。 RNAは、良性および疾患前立腺における正確な細胞型特異的遺伝子発現のためのツールを提供するために多数の下流の分析技術のために使用することができます。このタイプのデータは、知識ANに寄与RNA発現が疾患病態にどのように異なるかのd理解。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111