Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

요약

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

초록

바이오프린팅은 조직 공학 장기 구조물을 만들기 위한 다목적 바이오프린팅 접근 방식으로 부상했습니다. 이러한 구조체는 환자에게 이식하기 위한 장기 대체물로 잠재적으로 사용될 수 있으며, 약물 및 독성학 스크리닝을 위한 체외 시스템에서 사용할 수 있는 모델 "오가노이드"로 더 작은 크기로 만들 때도 사용할 수 있습니다.

다양한 바이오프린팅 장치의 개발에도 불구하고, 바이오프린팅 절차의 신속화와 조직 특이적 단서를 제공하여 세포의 생존력과 기능을 지원하는 물질의 가용성으로 인해 바이오프린팅 기술의 적용이 제한될 수 있습니다. 여기에서는 조직 특이적 생화학적 신호를 제공하고 생체 내 조직의 기계적 특성을 모방할 수 있는 다중 가교제, 2단계 가교 프로토콜로 구성된 다목적 히알루론산(HA) 및 젤라틴 기반 하이드로겔 시스템에 대해 설명합니다.

생화학적 인자는 강력한 성장 인자를 포함하는 조직 유래 세포외 기질 물질을 통합함으로써 제공됩니다. 조직의 기계적 특성은 다양한 분자량, 기하학(선형 또는 다중군) 및 작용기를 가진 PEG 기반 교차결합제의 제어된 조합으로 넓은 범위(100 Pa - 20 kPa)에 걸쳐 압출 가능한 바이오잉크와 최종 구조 전단 강성 값을 생성합니다. 이러한 파라미터를 사용하여 하이드로겔 바이오잉크를 사용하여 간 특이적 바이오잉크에 1차 간 스페로이드를 바이오프린팅하여 높은 세포 생존율과 측정 가능한 기능성 알부민 및 요소 출력을 가진 체외 간 구조체를 생성했습니다. 이 방법론은 광범위한 조직 구성 유형의 바이오 제조를 위한 하이드로겔의 향후 맞춤화에 적용할 수 있는 일반적인 프레임워크를 제공합니다.

서론

최근, 다양한 기술이이를 제조 또는 biofabricate 모색하여 기능 기관 및 조직의 대체 소스에 대한 필요성을 해결이 가능하게되었다. Bioprinting는이 기술의 가장 유망한 중 하나로 떠오르고있다. Bioprinting은 3 차원 패턴 가능한 기관 형상 또는 조직과 같은 구조를 구축하거나 사용할 수있는 생물학적 부품 로봇 첨가제 제조의 형태로 생각 될 수있다. 대부분의 경우 ¹ bioprinting 3 (3 차원을 채용 -D)함으로써 recapitulating 정확한 위치로 세포 및 생체 물질을 증착하기 위해 컴퓨터에 의해 지시되는 인쇄 장치 생리 아키텍처 해부학을 흉내 ^낸.이 이러한 장치 세포 집합체의 형태를 취할 수있는 "bioink"를 인쇄 하이드로 캡슐화 세포 점성 유체, 또는 셀 시드 미세 전달체뿐만 아니라 무 세포 PLA 기계적 구조 또는 행위를 제공하는 무 세포 중합체ceholders. ^3,4- bioprinting 처리 후는, 결과 구조는 기능적 조직 또는 기관 구조로 성숙하고 의도 된 최종 애플리케이션에 사용될 수있다. ^{-5,6- 현재까지} 완전한 완전히 기능 인간 크기 기관이 인쇄되지 않은, 하지만이 연구 개발 bioprinting의 주요 장기 목표가 남아있다. ⁽²⁾

프로토콜

1. 하이드로 겔 Bioink 제형 및 준비

1. 조직 특이 적 생화학 적 정보를 제공하기 이전에 상술 간 조직 특이 ECM 솔루션 다이제스트 준비하기 위해. ²⁰
   주 : 일반적으로, ECM 다이제스트 채용 최종 히드로 겔 bioink 용적의 40 %를 포함 할 것이다. ECM 다이제스트 솔루션의 수백 밀리리터가 준비 분주하고, 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다.
2. 광개시제, 2- 히드 록시 -4 '녹이고 하이드로 겔 제형에 앞서 - 0.1 %로 (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone 물하여 W / V.
   주 : 50-100 ml의 범위에서 볼륨이 미리 제조 될 수 있고, 몇 달 동안 4 ℃에서 차광 저장된다.
3. bioinks 하이드로 겔을 형성하기 위해, 우선 수분 광개시제 용액에 히알루 론산 (HA) 하이드로 겔 키트에서 기재 성분을 용해.
   1. 물 페이지에 별도로 HA 티올과 티올 젤라틴을 녹여hotoinitiator 솔루션 (단계 1.2) w / v 용액 2 %를 확인합니다.
   2. 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)의 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 ....

결과

전술 한 과정이 올바르게 준수 할 때 하이드로 겔은 표적 조직 유형 특정 생화학 적 프로파일을 포함한다 ⁽²⁰⁾ bioprinting 최종 탄성률 ^(34)을 통해 고도의 제어를 허용 및 조직 구조물은 가능한 기능 셀을 지원한다.

히드로 겔 지정
가장 모방 네이티브간에, 하이드로 겔 bioink이 간 ECM 솔루션과 성장 인자 어레이에 의해 보충하고, ²⁰ ECM 솔루션 (PG / ㎖,도 1a에 도시 됨) 성장 인자 및 사이토 카인의 다양한 포함한다. 이들은 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF), bFGF를, 뼈 형태 형성 단백질 5 (BMP-5), FGF-4, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2 (.......

토론

인간 또는 시험 관내 스크리닝 응용 프로그램에 대한 최종 사용, 3 차원 조직 구조를 biofabricate 할 때 고려해야 할 중요한 몇 가지 구성 요소가 있습니다. biofabrication 장치 자체는 최종 구조에 도달하기위한 일반적인 방법을 결정하는 동안 적절한 세포 성분을 이용하는 것은 최종 잠재적 기능을 결정한다. 이 이중 역할을 역할로 세 번째 구성 요소, 바이오 물질은 똑같이 중요하다. 특히, 생체 재료의 구성 요소는 biofabrication 하드웨어 (즉, bioprinters) 또한 잠재적으로 취약한 생물학적 세포 구성 요소를 지원 모두 호환 가능해야합니다. 이러한 요구 사항을 모두 최적화 bioprintable 물질은 몇 가지 중요한 변수를 충족시킬 필요에 따라 어려울 수있다 : 1)을 효율적이고 방해 인쇄를 용이하게하기 위해 적절한 화학, 기계 및 시간적 특성을 갖는다; 제조 단계 및 bioprin 중에 2)지지 세포 생존팅 절차; 3) 최적의 세포 생존과 bioprint.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
히알루론산	Sigma	53747
젤라틴	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
히알루론산 및 젤라틴 하이드로겔 키트(HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	키트에는 Heprasil(티올 및 헤파린 화 히알루론산), Gelin-S(티올화 히알루론산) 구성 요소가 포함되어 있습니다. 젤라틴) 및 Extralink(PEGDA)
PEG 8-Arm Alkyne, 10  kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
1차 인간 간세포	삼각 연구소	HUCPM6
1차 인간 간 성상 세포	ScienCell	5300
1차 인간 쿠퍼 세포	Life Technologies	HUKCCS
간세포 기저 매체(HBM)	Lonza	CC-3199
간세포 배지 보충 키트	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot 키트 (아스코르브산, 0.5  밀리리터; 소 혈청 알부민 [지방산 무함유], 10  밀리리터; 겐타마이신 설페이트/암포테리신 B, 0.5  밀리리터; 하이드로 코르티손 21- 헤미숙시 네이트, 0.5  밀리리터; 인슐린, 0.5  밀리리터; 인간 재조합 표피 성장 인자, 0.5  밀리리터; 전송, 0.5  ml)
트리톤 X-100	시그마	T9284	다른 제조업체는 괜찮습니다.
수산화 암모늄	Fischer Scientific	A669	다른 제조업체는 괜찮습니다.
신선한 돼지 사체 조직	n/a	/a
동결건조기	any	n/a
Freezer mill	any	n/a
Bioprinter	n/a	n/a	여기에 설명된 바이오프린터는 사내에서 맞춤 제작되었습니다. 일반적으로 다른 장치는 하이드로겔 재료의 컴퓨터 제어 압출 기반 인쇄를 지원하는 경우 적절합니다.
행잉 드롭 셀 배양 플레이트	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D 배양 플랫폼

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