Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

이 프로토콜의 전반적인 목표는 바이오프린팅 장치를 통해 압출할 수 있는 하이드로겔 바이오잉크를 설계하기 위한 다양한 접근 방식을 입증하는 것입니다. 그런 다음 바이오잉크를 사용하여 3차원 조직 구조를 제작할 수 있습니다. 이 방법은 바이오프린터를 사용하여 압출할 수 있는 재료를 제공하는 데 필요한 기계적 특성을 제어하는 방법과 같은 바이오프린팅 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 모듈식으로 결합된 상업적으로 이용 가능한 구성 요소를 사용하여 간단하고 효과적인 바이오프린팅 가능한 하이드로겔 바이오잉크를 만든다는 것입니다. 이러한 기술의 응용 분야에는 약물, 독소 및 질병의 영향을 정확하게 모델링하는 데 사용할 수 있는 3D 조직 오가노이드 생성이 포함됩니다. 이 방법은 3D 간 구조체를 바이오프린트하기 위한 프레임워크를 제공할 수 있지만 근육, 폐 및 결장과 같은 다른 조직 유형에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 하이드로겔 바이오잉크를 만드는 데 사용되는 다양한 시약이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있지만 실제로는 매우 간단합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 박사후 연구원인 Young-Joon Seol이 맡을 것입니다. 먼저, 다른 곳에서 설명한 대로 하이드로겔 제형에 사용할 조직 특이적 세포외 기질 분해물을 준비합니다.

그런 다음 광개시제를 0.1%의 부피당 중량비로 물에 용해시켜 하이드로겔 바이오잉크를 형성하려면 먼저 히알루론산 하이드로겔 키트의 기본 재료 성분을 물 광개시제 용액의 개별 부분 표본에 용해시킵니다. 그런 다음 ECM 용액, 2% 티올 히알루론산, 2% 티올 젤라틴, 가교제 및 간세포 배양 배지를 여기에 표시된 비율로 결합합니다. 바이오잉크의 압출 특성을 개선하려면 혼합물에 변형되지 않은 히알루론산 1.5mg과 젤라틴 1ml당 30mg을 첨가합니다.

그런 다음 사용하기 전에 생성된 혼합물을 10초 동안 고온에서 와류로 가열합니다. 바이오프린팅 장치에서 바이오잉크를 테스트하기 전에 먼저 실험실 벤치에서 압출 특성을 테스트하십시오. 표준 주사기를 사용하여 바이오잉크의 샘플을 떨어뜨린 다음 20-30 게이지 바늘을 주사기에 부착합니다.

바이오잉크가 가교결합되도록 한 다음 바늘을 통해 바이오잉크를 밀어 부드럽게 압출된 하이드로겔 필라멘트를 만듭니다. 제형이 범프가 거의 또는 전혀 없는 필라멘트를 생성할 수 있으면 바이오프린팅할 준비가 된 것입니다. 바이오잉크에 바이오잉크 제제를 로드하려면 바이오잉크를 멸균된 프린터 카트리지에 피펫으로 넣습니다.

바이오잉크가 카트리지 내에서 자발적인 1단계 가교를 거치므로 압출하기 전에 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 카트리지를 인쇄 설정에 로드하고 공압 소스를 카트리지에 연결합니다. 이와 같은 7 x 7mm 평행선 그리드와 같은 간단한 패턴을 준비하여 압출 호환성을 평가하기 위해 인쇄합니다.

프린트 헤드가 XY 평면에서 분당 약 300mm의 속도로 이동하는 동안 카트리지에 20킬로파스칼의 압력을 가하여 바이오잉크를 압출합니다. 압출 재료가 울퉁불퉁하거나 불규칙한 경우 1단계 가교 재료를 부드럽게 하기 위해 추가되는 가교제의 양을 줄이십시오. 적절하게 준비된 바이오잉크 제형은 매끄럽게 압출되어 정밀한 증착 및 구조가 가능해야 합니다.

96 웰 플레이트에서 3D 일차 세포 간 스페로이드를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 행잉 드롭 방법을 사용하여 준비합니다. 배양 3일 후, 피펫을 사용하여 매달린 드롭 플레이트에서 간 스페로이드를 채취하여 멸균된 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 스페로이드를 1-2분 동안 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉히십시오.

그런 다음 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 새로 준비된 하이드로겔 바이오잉크 용액의 원하는 프린팅 3D 구조 부피의 110-125%를 스페로이드가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 스페로이드를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 하이드로겔 바이오잉크 용액에 다시 현탁시킵니다.

고르게 부유되면 피펫을 사용하여 스페로이드 용액을 바이오프린터 카트리지로 옮기고 용액이 30분 동안 첫 번째 가교 단계를 거치도록 합니다. 교차결합에 대한 다음 단계를 통해 바이오프린팅 장치를 사용하여 1차 간 스페로이드를 포함하는 원하는 하이드로겔 구조를 만듭니다. 각 증착 층 후 인쇄된 바이오잉크를 2-4초 동안 자외선에 노출시켜 2차 가교 메커니즘을 시작합니다.

이렇게 하면 구조물이 안정화되고 강성이 원하는 수준으로 증가합니다. 용액 내 PEG 알킨의 농도는 전체 가교 밀도를 제어하므로 주로 최종 구조의 강성을 제어합니다. 바이오프린팅 후, 컨포칼 현미경을 사용하여 간 구조물의 높은 세포 생존율을 관찰했습니다.

최적의 환경 조건에서 생존율은 85% 이상이어야 합니다.또한, 간 조직을 나타내는 마커를 위해 구조체를 염색했을 때 CYP3A4, 사이토크롬 P450 이성질체, 세포 내 알부민, 상피 세포-세포 접착 단백질인 E-cadherin, 간에서 많이 발현되는 단백질인 DPP4의 양성 발현이 모두 관찰되었습니다. 배양 배지에서 요소 및 알부민 수치를 테스트한 결과, 이 구조체는 14일 동안 요소와 알부민을 일정한 수준으로 분비하는 것으로 나타났습니다. 이는 조직 특이적 하이드로겔 바이오잉크가 간 세포의 기능을 유지하는 데 도움이 된다는 것을 시사합니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 처음부터 끝까지 약 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 그러나 이것은 종종 사용되는 특정 바이오프린팅 장치에 따라 다릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 설명된 단계는 종종 다른 조직 유형 또는 바이오프린팅 장치와 호환되도록 조정되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 다른 조직 유형의 바이오프린팅을 지원하기 위해 다른 하이드로겔 바이오잉크 제형을 만들 수 있습니다. 이러한 기술의 개발은 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위한 다중 오가노이드, body-on-a-chip 플랫폼을 만드는 데 도움이 되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다단계 교차결합을 사용하여 3D 조직 구조체를 바이오프린팅하는 데 사용할 수 있는 재료를 설계하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

자외선으로 작업하는 것은 시력에 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 자외선 차단 고글 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.