Name: Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 학습하세요 조직 모방 하이드로겔 바이오잉크를 설계하여 생체프린팅 장치로 압출하는 다목적 방법을. 이 기술은 상용 구성 요소를 모듈 방식으로 결합하여 3D 조직 구조물을 제작하고 약물 및 질병 모델링 연구를 지원합니다.

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저자는 기꺼이 공간과 해군 전쟁 시스템 센터 태평양 (SSC PACIFIC) 계약 번호 N6601-13-C-2027에서 국방 위협 감소기구 (DTRA)에 의해 자금을 인정합니다. 이 자료의 공개는 본 연구 결과 나 결론 정부의 승인을 구성하지 않습니다.

1. 하이드로 겔 Bioink 제형 및 준비 <ol><li> 조직 특이 적 생화학 적 정보를 제공하기 이전에 상술 간 조직 특이 ECM 솔루션 다이제스트 준비하기 위해. 20 주 : 일반적으로, ECM 다이제스트 채용 최종 히드로 겔 bioink 용적의 40 %를 포함 할 것이다. ECM 다이제스트 솔루션의 수백 밀리리터가 준비 분주하고, 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다. </li><li> 광개시제, 2- 히드 록시 -4 &#39;녹이고 하이드로 겔 제형에 앞서 - 0.1 %로 (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone 물하여 W / V. 주 : 50-100 ml의 범위에서 볼륨이 미리 제조 될 수 있고, 몇 달 동안 4 ℃에서 차광 저장된다. </li><li> bioinks 하이드로 겔을 형성하기 위해, 우선 수분 광개시제 용액에 히알루 론산 (HA) 하이드로 겔 키트에서 기재 성분을 용해. <ol><li> 물 페이지에 별도로 HA 티올과 티올 젤라틴을 녹여hotoinitiator 솔루션 (단계 1.2) w / v 용액 2 %를 확인합니다. </li><li> 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)의 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 키트에 가교제를 용해. </li><li> 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8 아암 알킨 (10 kDa의 MW)을 녹인다. </li></ol></li><li> 추가 사용자가 가능하지만 일반적으로 다음과 같은 방식을 사용하여 하이드로 겔을 형성한다. <ol><li> 일반이 아닌 조직으로 2 %는 HA를 티올 4 부, 4 부 2 % 티올 젤라틴, 1 부 가교제 1, 1 부 가교제 2 8 부 조직의 ECM 솔루션 2 부 간세포 배양 배지 (HCM) (10 부품 물을 결합 - 특정 하이드로 겔). 주 : 추가 변성 HA 또는 젤라틴보다 원활 bioink 돌출을 첨가 할 수있다. 이것은 후술한다. </li></ol></li><li> 사용 전에 혼합 10 초 (10 명 중 속도 10) 고에 생성 된 혼합물을 소용돌이. &lt;/ 리&gt; <li> 하이드로 겔 bioink의 사용 <ol><li> 압출 또는 bioprinting 테스트에 대한 주사기 또는 프린터 카트리지 내로 혼합물을 전송하고, 37 ° C에서 30 분 (1 단계 가교)에 대해 자발적으로 가교 할 수있다. </li><li> 유변학 적 측정 들어 35mm 페트리 접시에 혼합물을 전송하고 30 분 동안 가교 결합 할 수있다. 참고 : 혼합물을 즉시 티올 - 아크릴 레이트 결합 형성을 통해 가교 시작하여 점도가 증가하기 시작합니다. 혼합물을 전송하는 동안 주사기 또는 피펫의 막힘을 방지하기 위해 10 분 내에 주사기 카트리지 또는 타겟 위치로 전송한다. </li><li> 이차 가교 (2 단계)가 요구되는 경우, 티올 알킨 중합 반응을 개시하는 단계를 자외선 (365 nm의, 18 W / cm 2) 1 가교 겔을 조사. 주 : 조사 시간은 물질의 표면적에 의존한다. 일반적으로 재료의 평방 센티미터는 1- 필요이 UV 전력에서 UV 노출이 초. </li></ol></li></ol> 2. 프린터 호환성 테스트 <ol><li> 표준 주사기와 작은 게이지 바늘 팁 (20 ~ 30 게이지)를 사용하여 간단한 압출 검사와 실험실 벤치에 bioprinting 장치, 테스트 압출 특성과의 통합 테스트에 앞서. <ol><li> 거의 또는 전혀 범프 하이드로 겔의 원활 압출 필라멘트를 달성하기 위해 표준 주사기를 통해 bioink을 누릅니다. 선이나 간단한 패턴으로 돌출하는 것은 성공을 결정하기에 충분하다. </li></ol></li><li> bioprinter 통합의 경우, 프린터 카트리지로 피펫 팅에 의해 준비를 bioink로드와 bioink 30 분 카트리지 내에서 자발적으로 1 단계 가교를받을 수 있습니다. 참고 bioink의 볼륨이 특정 어플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 프린터 카트리지는 유사하거나 bioprinter 장치와 호환되는 주사기 할 수있다. </li><li> 압출 호환성 평가bioink를 사용하여 간단한 패턴을 인쇄하여 bioprinting합니다. 예를 들어, 평행 한 라인으로 구성된 7 × 7mm 패턴을 출력한다. 압력 (예컨대, 20 kPa의 공기압)을 적용하는 동안 약 300mm / 분의 속도로 XY 평면에서의 헤드 이동한다. 다양한 크기의 프린트 헤드의 노즐 직경이 사용될 수 있지만, 400 ~ 500 μM 직경 개구부 원추형 노즐은 250-350 μm의 범위에서 회전 타원체 인쇄에 최적 참고. <ol><li> 압출 재료가 울퉁불퉁하거나 불규칙한 경우 2.4 단계 참조하거나 1 단계 가교 물질을 부드럽게 PEGDA의 양을 줄일 수 있습니다. 제대로 준비 bioink 제형은 원하는 패턴 또는 구조의 정확한 증착을 가능하게 매끄럽게 돌출. 장치의 각 유형에 대해 극적으로 같은 특정 인쇄 매개 변수로서 32 설명 사용 bioprinting 절차를 구체적으로 인쇄를 구성하는 조직을 위해 집에서 디자인 된 사용자 지정 3 차원 bioprinting 장치를 다양하고 testin 필요합니다. 참고사용자가 g. </li></ol></li><li> 압출 특성을 개선 bioinks에 수정되지 않은 HA 및 젤라틴을 보충하기 위해 (1.5 ㎎ / ㎖, 30 ㎎ / ㎖, 각각). </li></ol> 주 간를 구축과 Bioprinting 3. 검증 <ol><li> 세포 구성 요소 (33)로 드롭 방법을 매달아 3-D 일차 전지 간 타원체를 준비 참고 Bioprinting도 하이드로 겔 bioinks 현탁 개별 세포 타원체없이 수행 대신 할 수있다. 타원체가 세포 - 세포 상호 작용을 가속 기능을 구성하기 위해 여기에서 사용된다. 사용 타원체 또는 셀의 수는 특정 애플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 이러한 단계는 멸균 물품을 사용하여 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. <ol><li> 간세포의 기저 미디어 (HBM) 및 멸균 필터링에 HCM 보충 구성 요소 키트의 해동 내용을 추가하여 HCM을 준비합니다. <ol><li> 보충 구성 요소 유엔를 해동액체 참깨. </li><li> 황산 젠타 마이신 / 암포 테리 신 B, 0.5 ㎖;, 하이드로 코르티손 21- 헤 미숙시 네이트, 0.5 ml의 인슐린 0.5 ㎖; 10 ㎖, 소 혈청 알부민 [지방산 무료] 0.5 mL를 보충 성분 (아스코르브 산을 추가 인간 재조합 표피 성장 인자 0.5 ㎖를 상기 용액 (500)에 HBM), 0.5 ml의 전사. </li><li> 병 탑 필터 유닛 또는 주사기 팁 필터를 사용하여 0.45 ㎛의 0.22 ㎛의 필터를 통해 멸균 필터. </li></ol></li><li> 각각의 세포 유형은 제조업 자의 지시에 따라 해동 후 혈구 계산에 의해 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포의 세포 밀도를 결정한다. </li><li> 원추형 튜브에서 37 ° C로 가온 한 HCM 배지에서 세포 수에 의해 80:10:10의 비율로 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포 수확기. 주 : 사용되는 매체의 용적이 전체 세포 수에 대한 애플리케이션 특정 달려 번째 의해 결정되어야E 사용. </li><li> 20 ℃에서 520 × g으로 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 남기고 상층 액을 흡인. </li><li> 40 ㎕의 배지 당 1,000 세포를 포함하는 세포 현탁액을 수득 HCM 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 타원체의 수는 생산되는에 전체 볼륨이 달려있다. </li><li> 96 웰 형식 매달려 드롭 판에 세포 현탁액을 전송합니다. 다세포 스페 로이드가 형성되는 과정을 3 일 동안 5 % CO 2에서, HCM의 각 웰에 약 1,000 세포의 총 첨가하고 37 ℃에서 유지한다. </li><li> 피펫을 사용하여 매달려 드롭 판에서 간 회전 타원체를 수집합니다. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 전송합니다. </li></ol></li><li> 간 특정 하이드로 겔 bioink에 Bioprint 간 타원체 <ol><li> 가교제로서 PEGDA 8 % 8 % 8 아암 PEG의 알킨을 이용하는 단계 1과 간 ECM 함유 하이드로 겔 bioink의 제형을 준비한다. resu에서의 기능이 조합을 사용하여기본 간 조직에 전단 탄성 계수에 가까운 하이드로 겔에 lting. </li><li> 타원체들이 단계 3.1.7에 넣고있는 원추형 튜브의 바닥에 정착하자. 이것은 구형의 크기 및 밀도에 기초하지만, 일반적으로 1 ~ 2 분 이내에 발생 달라진다. 주의 깊게 흡입에 의해 또는 피펫 모든 용지를 제거합니다. </li><li> 타원체를 함유하는 원뿔형 튜브에 새로 제조 된 하이드로 겔 bioink 용액을 원하는 부피로 이동. 일반적으로, 적절한 양의 10 %를 인쇄 할 수있는 3 차원 구조체의 체적에 비해 -25 % 크다. 조심스럽게 하이드로 겔 bioink 용액에 회전 타원체를 재현 탁 아래로 피펫합니다. 피펫 또는 혈청 학적 피펫을 사용하여 bioprinter 카트리지에 전송합니다. </li><li> bioprinter 카트리지 내부의 용액을 30 분 동안 최초의 가교 단계 (티올 레이트 화 반응)을 겪게 할 수있다. 주 : 구형의 크기에 따라 카트리지가 느리게 회전 될 필요가있다거나 내용물을 혼합 할 필요가있다멸균 주걱 1 단계 가교 동안 bioink에 걸쳐 분산 회전 타원체를 유지합니다. 이 일시 중단 된 세포 대신 회전 타원체 준비 bioinks에 대한 필요성 이하이다. 주의 : 단계 1의 가교 후, 사용자는 몇 시간 동안의 동작 윈도우를 갖는다. 그러나, 세포 생존을 향상시키기 위해 신속 bioprinting 처리를 행하는 것을 추천합니다. </li><li> 단 하나의 가교 후, 주 간 타원체 (또는 다른 세포)를 함유하는 하이드로 겔, 원하는 구조를 생성하기 위해 bioprinting 장치를 사용한다. 주 :이 기술은 구조물의 다양한 biofabricating위한 시스템을 제공한다. 구조가 인쇄되는 이러한 전체 부피, 세포 또는 타원체 인쇄 된 구조 형상의 수, 기판 등의 파라미터는 사용자의 목적에 따라 크게 좌우된다. </li><li> 원하는 구성으로 증착 한 후, 공동 안정화 보조 가교 결합 메카니즘을 개시 2-4 초 동안 UV 광을 관리원하는 수준으로 nstructs 및 증가 강성. 주 : PEG-알킨의 농도, 따라서 전체적인 최종 가교 밀도는 주로 최종 구조체의 강성을 제어한다. </li><li> 다층 구조물을 생성하기 위하여 단계 3.2.4 및 3.2.5을 반복한다. </li></ol></li></ol>

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인간 또는 시험 관내 스크리닝 응용 프로그램에 대한 최종 사용, 3 차원 조직 구조를 biofabricate 할 때 고려해야 할 중요한 몇 가지 구성 요소가 있습니다. biofabrication 장치 자체는 최종 구조에 도달하기위한 일반적인 방법을 결정하는 동안 적절한 세포 성분을 이용하는 것은 최종 잠재적 기능을 결정한다. 이 이중 역할을 역할로 세 번째 구성 요소, 바이오 물질은 똑같이 중요하다. 특히, 생체 재료의 구성 요소는 biofabrication 하드웨어 (즉, bioprinters) 또한 잠재적으로 취약한 생물학적 세포 구성 요소를 지원 모두 호환 가능해야합니다. 이러한 요구 사항을 모두 최적화 bioprintable 물질은 몇 가지 중요한 변수를 충족시킬 필요에 따라 어려울 수있다 : 1)을 효율적이고 방해 인쇄를 용이하게하기 위해 적절한 화학, 기계 및 시간적 특성을 갖는다; 제조 단계 및 bioprin 중에 2)지지 세포 생존팅 절차; 3) 최적의 세포 생존과 bioprint...

최근, 다양한 기술이이를 제조 또는 biofabricate 모색하여 기능 기관 및 조직의 대체 소스에 대한 필요성을 해결이 가능하게되었다. Bioprinting는이 기술의 가장 유망한 중 하나로 떠오르고있다. Bioprinting은 3 차원 패턴 가능한 기관 형상 또는 조직과 같은 구조를 구축하거나 사용할 수있는 생물학적 부품 로봇 첨가제 제조의 형태로 생각 될 수있다. 대부분의 경우 1 bioprinting 3 (3 차원을 채용 -D)함으로써 recapitulating 정확한 위치로 세포 및 생체 물질을 증착하기 위해 컴퓨터에 의해 지시되는 인쇄 장치 생리 아키텍처 해부학을 흉내 낸.이 이러한 장치 세포 집합체의 형태를 취할 수있는 &quot;bioink&quot;를 인쇄 하이드로 캡슐화 세포 점성 유체, 또는 셀 시드 미세 전달체뿐만 아니라 무 세포 PLA 기계적 구조 또는 행위를 제공하는 무 세포 중합체ceholders. 3,4- bioprinting 처리 후는, 결과 구조는 기능적 조직 또는 기관 구조로 성숙하고 의도 된 최종 애플리케이션에 사용될 수있다. -5,6- 현재까지 완전한 완전히 기능 인간 크기 기관이 인쇄되지 않은, 하지만이 연구 개발 bioprinting의 주요 장기 목표가 남아있다. (2) 그러나, &quot;organoid&quot;티슈 구조물은 병리 모델링, 약물 개발 및 독성 검사를 포함하여 응용 프로그램으로 구현되는 소규모. 연구자 bioprinting 기술을 적용 발생한 주요 장애물 중 하나는 매우 적은 재료 bioprinting의 명시적인 목적으로 개발 된 것이있다. 효과적으로 bioprinting에서 성공하기 위해, 생체 재료 (4) 기본 요구 사항을 충족해야합니다. 바이오 물질이 증착을 허용하도록 1) 적절한 기계적 특성을 가질 필요가 (이것은 겔 또는 I와 같은 노즐을 통해 압출 될액적으로서 nkjet) 증착 후의 3 차원 구조의 구성 요소로 그 형상을 유지하기 위해, 2) 기능, 3)이 종래의 특성에 대한 사용자 제어 및 4) 셀 친절한 지원 환경에서 모든 기능 bioprinting 절차의 단계. 7 역사적으로, 작업을 bioprinting는 종종 대신 bioprinting 및 후속 후 인쇄 응용 프로그램에 필요한 특성을 가지고 생체 재료의 설계, 자신의 호환성을 고려하지 않고 bioprinting 장치에서 기존의 전통적인 생체 재료를 사용하기 위해 노력하고 있습니다. bioinks의 다양한 증착 및 제조 하드웨어와 더 나은 인터페이스에 최근에 개발되었다. 그들은 일반적으로 어느 전구체로서 충분한 기계적 특성, 또는 경우 노즐을 막히게 할 수있는 인쇄 또는 압출 공정에 망가가 중합 하이드로 유체 솔루션이 존재하기 때문에 표준 겔 시스템은 심각한 문제를 제기. 우리 팀뿐만 아니라 인접로rs는 하이드로 겔 기판에 세포 회전 타원체 인쇄, 마이크로 캐 필러 튜브에서 5,8 세포와 하이드로 겔 필라멘트 압출, 동적 가교 특성을 가진 9-11 압출 히알루 론산 (HA) - 금 나노 입자 하이드로 겔을 포함하여 이러한 bioprinting 문제를 해결하기 위해 다양한 하이드로 겔 제형을 살펴 보았다 광중합을 사용하여 하이드로 겔 강도의 12 시간 제어, 17 HA 및 젤라틴, 13 피브리노겐 - 트롬빈 계 가교제, 14, 15의 이온 교환 알긴산 콜라겐 겔 (16) 메타 크릴 레이트 최근 급격한 중합 자외선 (UV) -initiated 가교 이러한 예는 효과적으로 bioprinted에 의해 수 생성 물질의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 하드웨어의 통합에 추가하여, 성공적 가능한 기능적 3-D 조직 구조를 생성하기 위해, 생체 물질은 세포 유지를 지원하는 생화학 적 및 기계적 신호를 포함해야생존과 기능. 이러한 추가 요인, 생화학 적 및 기계적 프로필, bioprinted 조직 구조의 성공적인 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 두 세포 및 원시 세포 외 기질 (ECM)는 이러한 성장 인자 및 다른 세포에 다른 사이토킨 신호 분자로서 폭넓게 제시 할 책임이있다. 이들 신호의 결합 조직의 조직에서 다르지만, 세포 및 조직의 행동을 조절하는 매우 강력한 영향력 수있다. (18) 탐색 된 다른 기관으로부터 조직 특이 ECM 부품을 채용하고, 하이드로 겔 또는 하이드로 겔의 일부로서 구현 성공. 19-21, 주어진 조직 decellularizing을 분쇄하고, 용해 구성되는이 방법, 임의의 조직으로부터 조직 - 특이 적 생화학 적 신호를 생성하기 위해 3-D 하이드로 겔 구조에 혼입 될 수있는 이용 될 수있다. (22) 또한,그것이 널리 체내 조직을 강성의 넓은 범위를 차지하는 것이 설명되어있다. 이와 같이 23 튜닝 능력 등 탄성률 E &#39;또는 전단 탄성률 G&#39;와 같은 생체 재료의 기계적 특성, 조직 공학에서 유용한 도구 . 전술 한 바와 같이, bioink 기계적 특성 제어 대상 기관 유형과 일치하는 다음 상기 탄성률 레벨이 달성 될 수있는 나중 지점에서 이차 가교에 의해 조작 할 수있는 연질 겔을 사용하여 압출 기반 biofabrication 허용한다. 예를 들어, 생체 재료는에서 작동하는이 organoids의 능력 증가, 이론 (24, 25)을, 네이티브 간처럼 23 ~ 10 kPa로의 강성을 일치 또는 기본 심장 조직처럼 10 ~ 15 kPa로의 강성에 맞게 사용자 정의 할 수 그 나라 티슈 대응 유사한 방식. 세포 표현형에 환경 강성의 영향은 특급있다특히 줄기 세포에 대하여, 최근 lored. 잉글 러 외는. 조직 탄성 기판의 그것과 일치하는 계통으로 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 구동에서 도움이 기판 탄성을 보였다. (25) 이러한 개념은 상기 근육으로 분화, 심장 기능, 간 표현형, 조혈 줄기 세포의 증식에 대한 탐구 한 및 줄기 세포 치료 가능성의 유지. 24,26-29 조정할 수있는 서로 다른 탄성률을 하이드로 겔은 조직 구조를 biofabricate 데 사용되는 생체 재료의 중요한 특징이다. (30) 여기에서는 압출 bioprinted 수있는 하이드로 겔 시스템을 공식화하기 위해 실험실에서 사용 다기능 방식을 나타내고, 특정의 조직 유형의 생화학 적 프로파일을 포함하고 2) 그 조직 유형의 탄성률을 모방) (1)에 정의 된 프로토콜을 설명 . 이러한 요구 사항을 해결함으로써, 우리는 페이지에 목표생체의 물리 화학적 및 생물학적 특성 요점을 되풀이 할 수있는 물질을 rovide 조직.도 31은 여기에 기술 된 모듈러 하이드로 복합 시스템은 압출의 bioinks을 수득 다중 가교 방식을 활용하고 안정화시키는 보조 가교 결합을 허용하고의 강성을 증가 최종 제품은 조직 유형의 범위와 일치한다. 생화학 커스터마이즈 조직 특이 ECM 성분을 사용하여 만족된다. 데모, 우리는 기능 간 organoid 구조를 bioprint이 하이드로 겔 시스템의 간 고유의 다양한 사용합니다. 기술 된 프로토콜은 사용자 3 차원 bioprinting 장치를 사용한다. 일반적으로,이 프로토콜은 대부분 압출 기반 프린터에 적용 할 수 있고, 특정 인쇄 파라미터는 장치의 각 유형에 대해 극적으로 변화하고, 사용자에 의해 검사를 필요로한다.

<table><tbody><tr><td>히알루론산</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>히알루론산 및 젤라틴 하이드로겔 키트(HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>키트에는 Heprasil(티올 및 헤파린 화 히알루론산), Gelin-S(티올화 히알루론산) 구성 요소가 포함되어 있습니다. 젤라틴) 및 Extralink(PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&nbsp; kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>1차 인간 간세포</td><td>삼각 연구소</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>1차 인간 간 성상 세포</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>1차 인간 쿠퍼 세포</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>간세포 기저 매체(HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>간세포 배지 보충 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot 키트 (아스코르브산, 0.5&nbsp; 밀리리터; 소 혈청 알부민 [지방산 무함유], 10&nbsp; 밀리리터; 겐타마이신 설페이트/암포테리신 B, 0.5&nbsp; 밀리리터; 하이드로 코르티손 21- 헤미숙시 네이트, 0.5&nbsp; 밀리리터; 인슐린, 0.5&nbsp; 밀리리터; 인간 재조합 표피 성장 인자, 0.5&nbsp; 밀리리터; 전송, 0.5&nbsp; ml)</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T9284</td><td>다른 제조업체는 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>수산화 암모늄</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>다른 제조업체는 괜찮습니다.</td></tr><tr><td>신선한 돼지 사체 조직</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freezer mill</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>여기에 설명된 바이오프린터는 사내에서 맞춤 제작되었습니다. 일반적으로 다른 장치는 하이드로겔 재료의 컴퓨터 제어 압출 기반 인쇄를 지원하는 경우 적절합니다.</td></tr><tr><td>행잉 드롭 셀 배양 플레이트</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D 배양 플랫폼</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 bioink를 사용하여 구축

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

바이오프린팅은 조직 공학 장기 구조물을 만들기 위한 다목적 바이오프린팅 접근 방식으로 부상했습니다. 이러한 구조체는 환자에게 이식하기 위한 장기 대체물로 잠재적으로 사용될 수 있으며, 약물 및 독성학 스크리닝을 위한 체외 시스템에서 사용할 수 있는 모델 "오가노이드"로 더 작은 크기로 만들 때도 사용할 수 있습니다.
다양한 바이오프린팅 장치의 개발에도 불구하고, 바이오프린팅 절차의 신속화와 조직 특이적 단서를 제공하여 세포의 생존력과 기능을 지원하는 물질의 가용성으로 인해 바이오프린팅 기술의 적용이 제한될 수 있습니다. 여기에서는 조직 특이적 생화학적 신호를 제공하고 생체 내 조직의 기계적 특성을 모방할 수 있는 다중 가교제, 2단계 가교 프로토콜로 구성된 다목적 히알루론산(HA) 및 젤라틴 기반 하이드로겔 시스템에 대해 설명합니다. 
생화학적 인자는 강력한 성장 인자를 포함하는 조직 유래 세포외 기질 물질을 통합함으로써 제공됩니다. 조직의 기계적 특성은 다양한 분자량, 기하학(선형 또는 다중군) 및 작용기를 가진 PEG 기반 교차결합제의 제어된 조합으로 넓은 범위(100 Pa - 20 kPa)에 걸쳐 압출 가능한 바이오잉크와 최종 구조 전단 강성 값을 생성합니다. 이러한 파라미터를 사용하여 하이드로겔 바이오잉크를 사용하여 간 특이적 바이오잉크에 1차 간 스페로이드를 바이오프린팅하여 높은 세포 생존율과 측정 가능한 기능성 알부민 및 요소 출력을 가진 체외 간 구조체를 생성했습니다. 이 방법론은 광범위한 조직 구성 유형의 바이오 제조를 위한 하이드로겔의 향후 맞춤화에 적용할 수 있는 일반적인 프레임워크를 제공합니다.

전술 한 과정이 올바르게 준수 할 때 하이드로 겔은 표적 조직 유형 특정 생화학 적 프로파일을 포함한다 (20) bioprinting 최종 탄성률 (34)을 통해 고도의 제어를 허용 및 조직 구조물은 가능한 기능 셀을 지원한다. 히드로 겔 지정 가장 모방 네이티브간에, 하이드로 겔 bioink이 간 ECM 솔루션과 성장 인자 어레이에 의해 보충하고, 20 ECM 솔루션 (PG / ㎖,도 1a에 도시 됨) 성장 인자 및 사이토 카인의 다양한 포함한다. 이들은 뇌 유래 신경영 양인자 (BDNF), bFGF를, 뼈 형태 형성 단백질 5 (BMP-5), FGF-4, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2 (...

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 바이오프린팅 장치를 통해 압출 가능한 하이드로젤 바이오잉크를 설계하는 다각적인 접근법을 제시하는 것입니다. 이렇게 제작된 바이오잉크는 이후 3차원 조직 구조체를 제작하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 바이오프린터를 사용하여 압출할 수 있는 재료를 제공하기 위해 필요한 기계적 특성을 제어하는 방법과 같이, 바이오프린팅 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 시판되는 구성 요소들을 모듈 방식으로 결합하여 간단하고 효과적인 바이오프린팅 가능 하이드로젤 바이오잉크를 제작한다는 점입니다. 이러한 기술의 응용 분야로는 약물, 독소 및 질병의 영향을 정확하게 모델링하는 데 사용할 수 있는 3D 조직 오가노이드 제작이 포함됩니다. 이 방법은 3D 간 구조물을 바이오프린팅하기 위한 프레임워크를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 근육, 폐, 결장과 같은 다른 조직 유형에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 하이드로겔 바이오잉크를 만드는 데 사용되는 시약의 종류가 많아 어려움을 겪을 수 있지만, 실제 과정은 매우 간단합니다. 절차 시연은 저희 팀의 박사후 연구원인 설영준 님이 맡아 진행하겠습니다. 우선, 다른 문헌에 설명된 대로 하이드로겔 제형에 사용할 조직 특이적 세포외 기질 소화물을 준비하십시오.그런 다음, 광개시제를 물에 중량 대 부피 비율 0.1%로 용해합니다. 하이드로젤 바이오잉크를 형성하려면, 먼저 히알루론산 하이드로젤 키트의 기본 재료 성분들을 각각의 물 광개시제 용액 분주량에 용해합니다. 그다음 ECM 용액, 2% 티올화 히알루론산, 2% 티올화 젤라틴, 가교제 및 간세포 배양 배지를 여기에 표시된 비율로 혼합합니다. 바이오잉크의 압출 특성을 개선하기 위해, 혼합물에 미변형 히알루론산 1.5 mg/mL와 젤라틴 30 mg/mL를 첨가합니다.그 다음, 사용하기 전에 결과 혼합물을 강한 강도로 10초 동안 볼텍싱합니다. 바이오프린팅 장치에서 바이오잉크를 테스트하기 전에, 먼저 실험대 위에서 압출 특성을 테스트하십시오. 표준 주사기를 사용하여 바이오잉크 샘플을 떨어뜨린 후, 20~30 게이지 바늘을 주사기에 장착합니다.바이오잉크를 가교시킨 후, 바늘을 통해 바이오잉크를 밀어내어 매끄럽게 압출된 하이드로젤 필라멘트를 형성합니다. 돌출 부위가 거의 없거나 없는 필라멘트가 생성된다면, 바이오프린팅 준비가 된 것입니다. 바이오프린터에 준비된 바이오잉크를 장착하려면, 멸균된 프린터 카트리지에 바이오잉크를 피펫으로 분주합니다.바이오잉크가 카트리지 내에서 자발적인 1단계 가교 반응을 거치므로, 압출 전 30분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 카트리지를 프린팅 장치에 장착하고 공압 압력원을 카트리지에 연결합니다. 압출 적합성을 평가하기 위해, 이 7 by 7 mm 평행선 그리드와 같은 단순한 패턴을 준비하여 출력합니다.프린트 헤드가 XY 평면에서 약 300 millimeters per minute의 속도로 이동하는 동안, 카트리지에 20 kilopascals의 압력을 가하여 바이오잉크를 압출합니다. 압출된 재료가 덩어리져 있거나 불규칙한 경우, 1단계 가교 재료를 부드럽게 만들기 위해 첨가하는 가교제의 양을 줄이십시오. 적절하게 조제된 바이오잉크 제형은 부드럽게 압출되어 정밀한 증착과 구조 형성이 가능해야 합니다.동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 hanging drop 방법을 사용하여 96-well 플레이트에 3D 일차 간세포 스페로이드를 준비합니다. 3일간 배양한 후, 피펫을 사용하여 hanging drop 플레이트에서 간 스페로이드를 수집하고, 이를 멸균된 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 스페로이드가 원심분리 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 1~2분 동안 둡니다.그런 다음, 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 새로 준비한 하이드로겔 바이오잉크 용액을 원하는 3D 프린팅 구조물 부피의 110%에서 125%만큼 스페로이드가 들어 있는 원추형 튜브에 옮깁니다. 이어서, 피펫으로 스페로이드를 조심스럽게 상하로 섞어 하이드로겔 바이오잉크 용액에 다시 부유시킵니다.균일하게 현탁되면 피펫을 사용하여 스페로이드 용액을 바이오프린터 카트리지로 옮기고, 용액이 30분 동안 1차 가교 단계를 거치도록 둡니다. 가교 단계 이후, 바이오프린팅 장치를 사용하여 1차 간 스페로이드를 포함하는 원하는 하이드로겔 구조물을 제작합니다. 각 층을 적층한 후, 프린팅된 바이오잉크를 2~4초 동안 UV 광선에 노출시켜 2차 가교 기전을 개시합니다.이렇게 하면 구조체가 안정화되고 강성이 원하는 수준까지 증가합니다. 용액 내 PEG alkyne의 농도가 전체적인 가교 밀도를 결정하며, 따라서 최종 구조체의 강성을 주로 조절합니다. 바이오프린팅 후, 공초점 현미경을 통해 간 구조체에서 높은 세포 생존율이 관찰되었습니다.최적의 환경 조건에서 생존율은 85% 이상이어야 합니다. 또한, 간 조직을 나타내는 마커로 구성물을 염색했을 때, cytochrome P450 동형 단백질인 CYP3A4, 세포 내 albumin, 상피 세포 간 접착 단백질인 E-cadherin, 그리고 간에서 높게 발현되는 단백질인 DPP4의 양성 발현이 모두 관찰되었습니다. 배양액의 urea 및 albumin 수치를 측정한 결과, 구성물이 14일의 기간 동안 일정 수준으로 urea와 albumin을 모두 분비하는 것으로 나타났습니다. 이는 조직 특이적 하이드로겔 바이오잉크가 간 세포의 기능 유지에 도움이 된다는 것을 더욱 시사합니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 시작부터 끝까지 약 2시간 정도 소요됩니다. 하지만 이는 사용하는 특정 바이오프린팅 장치에 따라 달라지는 경우가 많습니다. 이 절차를 시도할 때, 시연된 단계들은 다른 조직 유형이나 바이오프린팅 장치와 호환되도록 조정해야 하는 경우가 많다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차를 따라 다른 조직 유형의 바이오프린팅을 지원하기 위한 또 다른 하이드로겔 바이오잉크 제형을 제작할 수 있습니다. 이러한 기술의 발전은 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위한 다중 오가노이드 바디-온-어-칩(body-on-a-chip) 플랫폼 구축의 토대가 되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 다단계 가교 결합을 이용하여 3D 조직 구조체 바이오프린팅에 사용할 수 있는 재료를 설계하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.자외선 광원을 사용하는 것은 시력에 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 UV 보호 고글을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 유념하십시오.

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

여기서, 우리는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위하여 액체 같이 bioinks (낮은 점도를 가진 젤라틴 methacryloyl)를 위한 새로운 다층 수정 전략을 개발했습니다.

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

이 프로토콜은 젤라틴 기반 과립 지지체에 인산 칼슘 잉크를 증착하여 뼈와 같은 구조를 제조하는 3D 프린팅 기술을 설명합니다. 인쇄된 뼈 유사체는 다상 구축물을 위한 살아있는 세포 매트릭스 내에서 인쇄물의 직접 수확 또는 가교를 위한 유연성과 함께 자유 형태로 증착됩니다.

뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

학습하세요 조직 모방 하이드로겔 바이오잉크를 설계하여 생체프린팅 장치로 압출하는 다목적 방법을. 이 기술은 상용 구성 요소를 모듈 방식으로 결합하여 3D 조직 구조물을 제작하고 약물 및 질병 모델링 연구를 지원합니다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

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