Summary
हम प्रोटोकॉल है कि एक साथ एक ऊतक नकल उतार हाइड्रोजेल bioink जिसके साथ कार्यात्मक और व्यवहार्य 3-डी ऊतक निर्माणों में इन विट्रो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए bioprinted जा सकता है प्रदान का एक सेट का वर्णन है।
Introduction
हाल के वर्षों में, प्रौद्योगिकी की एक किस्म उपलब्ध हो गए हैं कि निर्माण करने के लिए, या biofabricate, उन्हें मांग से कार्यात्मक अंगों और ऊतकों के वैकल्पिक स्रोतों के लिए की जरूरत है पते। Bioprinting इन प्रौद्योगिकियों के सबसे होनहार में से एक के रूप में उभरा है। Bioprinting जैविक भागों के रोबोट additive निर्माण का एक रूप है, कि 3 आयामों में पैटर्न व्यवहार्य अंग की तरह या ऊतक की तरह संरचनाओं का निर्माण या करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बारे में सोचा जा सकता है। 1 ज्यादातर मामलों में, bioprinting 3 एक 3 आयामी को रोजगार ( डी) मुद्रण डिवाइस है कि एक कंप्यूटर द्वारा निर्देशित है सटीक स्थिति में कोशिकाओं और biomaterials जमा करने के लिए, जिससे recapitulating शारीरिक आर्किटेक्चर संरचनात्मक रूप से नकल उतार। 2 इन उपकरणों एक "bioink", जो सेल समुच्चय का रूप ले सकता है मुद्रित, हाइड्रोजेल में समझाया कोशिकाओं या चिपचिपा तरल पदार्थ, या सेल वरीयता प्राप्त microcarriers, साथ ही सेल मुक्त पॉलिमर कि सेल मुक्त पीएलए के रूप में यांत्रिक संरचना या अधिनियम प्रदानceholders। 3,4 bioprinting प्रक्रिया के बाद, जिसके परिणामस्वरूप संरचना कार्यात्मक ऊतक या अंग संरचनाओं में परिपक्व किया जा सकता है, और अपने उद्देश्य अंत आवेदन के लिए इस्तेमाल किया। 5,6 तिथि करने के लिए, एक पूरा पूरी तरह कार्यात्मक मानव आकार अंग मुद्रित नहीं किया गया है, लेकिन यह अनुसंधान और विकास bioprinting के प्राथमिक दीर्घकालिक लक्ष्य रहता है। 2 हालांकि, छोटे पैमाने पर "organoid" ऊतक निर्माणों वर्तमान में विकृति मॉडलिंग, दवा के विकास, और विष विज्ञान स्क्रीनिंग सहित आवेदन की एक संख्या में लागू किया जा रहा है।
मुख्य बाधा है कि शोधकर्ताओं bioprinting प्रौद्योगिकी को लागू करने में सामना करना पड़ा है में से एक है कि बहुत कम सामग्री bioprinting के स्पष्ट उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है। प्रभावी ढंग से bioprinting में सफल होने के लिए, एक biomaterial 4 बुनियादी आवश्यकताओं को पूरा करना होगा। biomaterial 1) उचित यांत्रिक गुणों बयान अनुमति देने के लिए की जरूरत है (यह एक जेल या एक मैं के रूप में एक नोजल के माध्यम से बाहर निकालना होएक छोटी बूंद के रूप में nkjet), 2) एक 3-डी संरचना बयान के बाद के एक घटक के रूप में अपने आकार धारण करने की क्षमता है, 3) 2 से पहले विशेषताओं के उपयोगकर्ता नियंत्रण, और 4) एक सेल दोस्ताना और सहायक वातावरण सभी पर के लिए क्षमता bioprinting प्रक्रिया के चरणों। 7 ऐतिहासिक, bioprinting काम अक्सर बजाय एक biomaterial डिजाइनिंग bioprinting और बाद के बाद मुद्रण अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक गुण है, उनकी अनुकूलता के लिए विचार किए बिना bioprinting उपकरणों में मौजूदा पारंपरिक biomaterials को रोजगार के लिए कोशिश की है।
bioinks की एक किस्म बयान और निर्माण हार्डवेयर के साथ बेहतर इंटरफ़ेस करने के लिए हाल ही में विकसित किया गया है। स्टैंडर्ड हाइड्रोजेल सिस्टम महत्वपूर्ण समस्या पैदा क्योंकि वे आम तौर पर या तो अग्रदूत के रूप में मौजूद अपर्याप्त यांत्रिक गुणों, या polymerized हाइड्रोजेल कि अगर मुद्रित नलिका रोकना कर सकते हैं या बाहर निकालना प्रक्रिया पर टूट बनने के साथ तरल पदार्थ समाधान। हमारी टीम है, साथ ही othe के रूप मेंरुपये इन bioprinting समस्याओं का समाधान करने के लिए विभिन्न योगों हाइड्रोजेल, हाइड्रोजेल substrates में सेल अंडाकार आकृति मुद्रण, microcapillary ट्यूब से 5.8 सेल और हाइड्रोजेल रेशा बाहर निकालना, 9-11 extrudable hyaluronic एसिड (हेक्टेयर) -Gold nanoparticle गतिशील crosslinking गुणों के साथ हाइड्रोजेल सहित पता लगाया है , photopolymerizable का उपयोग कर हाइड्रोजेल कठोरता के 12 अस्थायी नियंत्रण हा और जिलेटिन, 13 फाइब्रिनोजेन-थ्रोम्बिन आधारित crosslinking, 14,15 आयनिक विनिमय alginate कोलेजन जैल, 16 methacrylated और हाल ही में तेजी से polymerizing पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) -initiated crosslinking, 17
इन उदाहरणों सामग्री है कि प्रभावी ढंग से bioprinted से कर सकते हैं पैदा करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन। हालांकि, हार्डवेयर के साथ एकीकरण के अलावा, सफलतापूर्वक व्यवहार्य और कार्यात्मक 3-डी ऊतक निर्माणों उत्पन्न करने के लिए, biomaterials जैव रासायनिक और यांत्रिक संकेतों सेलुलर को बनाए रखने में सहायता शामिल होना चाहिएव्यवहार्यता और समारोह। ये अतिरिक्त कारकों, जैव रासायनिक और यांत्रिक प्रोफाइल, bioprinted ऊतक निर्माणों के सफल समारोह पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।
दोनों कोशिकाओं और देशी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) इस तरह के विकास कारकों और अन्य कोशिकाओं को अन्य साइटोकिन्स के रूप में संकेतन अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला पेश करने के लिए जिम्मेदार हैं। इन संकेतों के संयोजन के ऊतकों को ऊतकों से बदलता है, लेकिन अत्यंत शक्तिशाली और सेल और ऊतक व्यवहार को विनियमित करने में प्रभावशाली हो सकता है। 18 विभिन्न अंगों से ऊतक विशेष ईसीएम घटकों को रोजगार और एक हाइड्रोजेल के रूप में या एक हाइड्रोजेल के हिस्से के रूप में लागू करने के साथ पता लगाया गया है सफलता। 19-21 यह दृष्टिकोण है, जो एक दिया ऊतक decellularizing, यह pulverizing, और यह भंग के शामिल है, किसी भी ऊतक से ऊतक विशेष जैव रासायनिक संकेतों का उत्पादन करने के लिए और 3-डी हाइड्रोजेल निर्माणों में शामिल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है। 22
इसके अतिरिक्त,यह व्यापक रूप से प्रलेखित है कि शरीर में ऊतकों stiffnesses की एक विस्तृत श्रृंखला पर कब्जा। 23 जैसे, धुन करने की क्षमता ऐसी लोचदार मापांक ई 'या कतरनी लोचदार मापांक जी' के रूप में biomaterials, के यांत्रिक गुणों, ऊतक इंजीनियरिंग में एक उपयोगी उपकरण है । जैसा कि ऊपर वर्णित है, bioink यांत्रिक गुणों पर नियंत्रण है कि लक्ष्य अंग प्रकार की है कि मैच से बाहर निकालना आधारित biofabrication एक नरम जेल, जो फिर आगे एक बाद की बात है, जिस पर लोचदार मापांक का स्तर प्राप्त किया जा सकता है पर माध्यमिक crosslinking से छेड़छाड़ कर सकते हैं प्रयोग करने के लिए अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, biomaterials इन organoids की क्षमता में कार्य करने के लिए बढ़ रही है 23 एक देशी जिगर की तरह 5-10 किलो पास्कल की कठोरता मैच के लिए, या देशी हृदय के ऊतकों की तरह 10-15 किलो पास्कल की कठोरता मैच, सिद्धांत में 24,25 अनुकूलित किया जा सकता उनके पैतृक ऊतक समकक्षों के लिए एक समान तरीके से। सेल phenotype पर पर्यावरण कठोरता के प्रभाव के विस्तार किया गया गया हैहाल के वर्षों में lored, विशेष रूप से स्टेम सेल के संबंध में। Engler एट अल। सब्सट्रेट कि लोच मिलान सब्सट्रेट की है कि ऊतक लोच के साथ प्रजातियों के प्रति mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) ड्राइविंग में सहायता प्राप्त प्रदर्शन किया। 25 इस अवधारणा को आगे मांसपेशी में भेदभाव, हृदय समारोह, जिगर phenotype, hematopoietic स्टेम सेल प्रसार के लिए पता लगाया गया है और स्टेम सेल चिकित्सीय क्षमता के रखरखाव। 24,26-29 धुन करने के लिए सक्षम होने के नाते अलग लोचदार moduli करने के लिए एक हाइड्रोजेल एक biomaterial है कि ऊतक निर्माणों biofabricate करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की एक महत्वपूर्ण विशेषता है। 30
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि एक बहुमुखी हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल एक हाइड्रोजेल प्रणाली है कि बाहर निकालना bioprinted जा सकती है तैयार करने के लिए दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है, और 1 के लिए अनुकूलित) एक विशेष ऊतक प्रकार के जैव रासायनिक प्रोफ़ाइल होते हैं और 2) है कि ऊतक प्रकार की लोचदार मापांक नकल का वर्णन । इन आवश्यकताओं को संबोधित करके, हम पी के लिए लक्ष्यएक सामग्री है कि इन विवो की physiochemical और जैविक विशेषताओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं rovide ऊतक। 31 मॉड्यूलर हाइड्रोजेल समग्र प्रणाली यहाँ बताया लाभ एक बहु तिर्यक दृष्टिकोण के extrudable bioinks उपज के लिए लेता है, और स्थिर करने के लिए एक उच्च माध्यमिक crosslinking अनुमति देता है और कठोरता बढ़ जाती है अंत उत्पादों प्रकार के ऊतकों की एक श्रृंखला के मैच के लिए। बायोकेमिकल अनुकूलन ऊतक विशेष ईसीएम घटकों का उपयोग करके पूरा किया जाता है। एक प्रदर्शन के रूप में, हम कार्यात्मक जिगर organoid निर्माणों bioprint को यह हाइड्रोजेल प्रणाली का एक जिगर-विशिष्ट किस्म को रोजगार। प्रोटोकॉल वर्णित एक कस्टम 3-डी bioprinting डिवाइस का उपयोग करता है। सामान्य में, इस प्रोटोकॉल के सबसे बाहर निकालना आधारित प्रिंटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विशिष्ट मुद्रण मापदंडों उपकरण के प्रत्येक प्रकार के लिए नाटकीय रूप से भिन्न है और उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण की आवश्यकता है।
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Protocol
1. हाइड्रोजेल Bioink योगों और तैयारी
- आदेश, ऊतक विशेष जैव रासायनिक प्रोफाइल प्रदान करने के लिए तैयार ऊतक विशेष ईसीएम के रूप में पहले जिगर के लिए वर्णित समाधान डाइजेस्ट में। 20
नोट: सामान्य में, इस ईसीएम डाइजेस्ट अंतिम हाइड्रोजेल bioink मात्रा है कि कार्यरत है की 40% शामिल होंगे। ईसीएम डाइजेस्ट समाधान के कई सौ मिलीलीटर, तैयार किया जा सकता aliquoted, और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं। - सूत्रीकरण हाइड्रोजेल करने के लिए, एक photoinitiator, 2-हाइड्रोक्सी 4 'भंग प्रायर - 0.1% से कम (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone, पानी में w / v।
नोट: 50-100 मिलीग्राम रेंज में वॉल्यूम समय से आगे तैयार किया जा सकता है और कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से परिरक्षित संग्रहीत। - हाइड्रोजेल bioinks फार्म के लिए, पहले पानी photoinitiator समाधान में hyaluronic एसिड (हेक्टेयर) हाइड्रोजेल किट से आधार सामग्री घटक भंग।
- पानी पी में अलग से thiolated हा और thiolated जिलेटिन भंगhotoinitiator समाधान (1.2 चरण) 2% w / v समाधान बनाने के लिए।
- एक 8% w / v समाधान बनाने के लिए पॉलीथीन ग्लाइकोल diacrylate (PEGDA), हाइड्रोजेल किट में crosslinker, पानी photoinitiator समाधान (1.2 चरण) में भंग।
- एक 8% w / v समाधान बनाने के लिए पानी-photoinitiator समाधान (1.2 चरण) में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) 8-शाखा alkyne (10 केडीए मेगावाट) भंग।
- सामान्य में, निम्न योजना का उपयोग कर हाइड्रोजेल फार्म हालांकि अतिरिक्त अनुकूलन संभव है।
- 4 भागों में 2% हा thiolated, 4 भागों में 2% thiolated जिलेटिन, 1 भाग crosslinker 1, 1 हिस्सा crosslinker 2 से 8 के साथ भागों ऊतक ईसीएम समाधान और 2 भागों hepatocyte संस्कृति मीडिया (HCM) (या 10 भागों पानी का मिश्रण एक सामान्य गैर ऊतकों के रूप में विशिष्ट हाइड्रोजेल)।
ध्यान दें: अतिरिक्त असंशोधित हेक्टेयर या जिलेटिन और अधिक सुचारू रूप bioink बाहर निकालना बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है। यह नीचे में वर्णित है।
- 4 भागों में 2% हा thiolated, 4 भागों में 2% thiolated जिलेटिन, 1 भाग crosslinker 1, 1 हिस्सा crosslinker 2 से 8 के साथ भागों ऊतक ईसीएम समाधान और 2 भागों hepatocyte संस्कृति मीडिया (HCM) (या 10 भागों पानी का मिश्रण एक सामान्य गैर ऊतकों के रूप में विशिष्ट हाइड्रोजेल)।
- उपयोग करने से पहले मिश्रण करने के लिए 10 सेकंड के लिए (10 से बाहर गति 10) उच्च पर जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण भंवर। </ Li>
- हाइड्रोजेल bioink का उपयोग
- बाहर निकालना या bioprinting परीक्षण के लिए, एक सिरिंज या प्रिंटर कारतूस में मिश्रण हस्तांतरण और यह 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट (चरण 1 crosslinking) के लिए अनायास crosslink करने के लिए अनुमति देते हैं।
- rheological माप के लिए, एक 35 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण हस्तांतरण और इसे 30 मिनट के लिए crosslink करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: मिश्रण तुरंत thiol-acrylate बंधन गठन के माध्यम से crosslink करने के लिए शुरू होता है और चिपचिपापन में वृद्धि करने के लिए शुरू हो जाएगा। मिश्रण स्थानांतरण के दौरान एक पिपेट या सिरिंज के clogging से बचने के लिए 10 मिनट के भीतर एक सिरिंज, प्रिंट कारतूस, या लक्ष्य स्थान पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए। - जब माध्यमिक crosslinking (चरण 2) वांछित है, मंच पर एक thiol-alkyne polymerization प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम, 18 डब्ल्यू / 2 सेमी) के साथ 1-crosslinked जैल चमकाना।
नोट: विकिरण की अवधि सामग्री की सतह क्षेत्र पर निर्भर है। सामान्य में, सामग्री का एक वर्ग सेंटीमीटर केवल 1- आवश्यकताइस यूवी सत्ता पर यूवी जोखिम के 2 सेकंड।
2. प्रिंटर संगतता परीक्षण
- bioprinting उपकरणों, मानक सीरिंज और छोटे गेज सुई सुझावों (20-30 गेज) का उपयोग कर सरल बाहर निकालना परीक्षण प्रयोगशाला के साथ बेंच पर परीक्षण बाहर निकालना विशेषताओं के साथ एकीकरण के परीक्षण से पहले।
- कुछ या कोई धक्कों के साथ हाइड्रोजेल का सुचारू रूप से extruded तंतु प्राप्त करने के लिए एक मानक सिरिंज के माध्यम से bioink पुश। लाइनों या साधारण पैटर्न के Extruding सफलता का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त है।
- bioprinter एकीकरण के लिए, उन्हें प्रिंटर कारतूस में pipetting द्वारा तैयारियों bioink लोड, और bioink के लिए 30 मिनट के भीतर कारतूस सहज चरण 1 crosslinking गुजरना करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: bioink की मात्रा विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करता है और उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। प्रिंटर कारतूस के समान या सीरिंज कि bioprinter डिवाइस के साथ संगत कर रहे हैं हो सकता है। - बाहर निकालना अनुकूलता का मूल्यांकनbioink का उपयोग कर एक साधारण पैटर्न मुद्रण द्वारा bioprinting के लिए। उदाहरण के लिए, एक 7 x 7 मिमी पैटर्न समानांतर लाइनों के शामिल प्रिंट। दबाव (जैसे, 20 किलो पास्कल साँस का दबाव) लागू है, जबकि लगभग 300 मिमी / मिनट की एक वेग में XY विमान में printhead चलता रहता है।
नोट: विभिन्न आकार के Printhead नोक व्यास इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन 400-500 मीटर व्यास के उद्घाटन के साथ शंक्वाकार नलिका 250-350 माइक्रोन रेंज में spheroids मुद्रण के लिए उपयोगी हैं।- extruded सामग्री गठान या अनियमित हैं, तो 2.4 कदम देखते हैं, या चरण 1 Crosslinked सामग्री को नरम करने के PEGDA की मात्रा कम हो। ठीक से तैयार bioink योगों को सुचारू रूप से बाहर निकालना, वांछित पैटर्न या आर्किटेक्चर में सटीक बयान की इजाजत दी।
नोट: bioprinting वर्णित प्रक्रियाओं उपयोग एक कस्टम 3-डी bioprinting डिवाइस विशेष रूप से ऊतक के लिए मुद्रण निर्माण घर में तैयार की 32 ऐसी विशिष्ट मुद्रण मापदंडों के रूप में भिन्न नाटकीय रूप से डिवाइस के प्रत्येक प्रकार के लिए और testin की आवश्यकता होती है।उपयोगकर्ता द्वारा छ।
- extruded सामग्री गठान या अनियमित हैं, तो 2.4 कदम देखते हैं, या चरण 1 Crosslinked सामग्री को नरम करने के PEGDA की मात्रा कम हो। ठीक से तैयार bioink योगों को सुचारू रूप से बाहर निकालना, वांछित पैटर्न या आर्किटेक्चर में सटीक बयान की इजाजत दी।
- बाहर निकालना गुणों में सुधार करने के लिए, bioinks को असंशोधित हा और जिलेटिन के पूरक (1.5 मिलीग्राम / एमएल और 30 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः)।
3. मान्यकरण प्राथमिक यकृत constructs के साथ Bioprinting द्वारा
- सेलुलर घटक के रूप में 33 बूंद तरीकों फांसी से 3-डी प्राथमिक सेल जिगर spheroids तैयार
नोट: Bioprinting spheroids के बिना किया जा सकता है, लेकिन इसके बजाय व्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से हाइड्रोजेल bioinks में निलंबित कर दिया कोशिकाओं के साथ। Spheroids सेल सेल बातचीत में तेजी लाने और कार्यक्षमता का निर्माण करने के लिए यहां कार्यरत हैं। spheroids या कोशिकाओं की संख्या में कार्यरत विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करता है और उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। ये कदम बाँझ आपूर्ति का उपयोग बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए।- hepatocyte बेसल मीडिया (HBM) और बाँझ छानने के लिए हो ची मिन्ह पूरक घटक किट के thawed सामग्री जोड़कर HCM तैयार करें।
- गला लें पूरक घटकों संयुक्त राष्ट्रतरल तिल।
- पूरक घटकों (एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें, 0.5 मिलीग्राम, गोजातीय सीरम albumin [फैटी एसिड मुक्त], 10 मिलीलीटर, जेंटामाइसिन सल्फेट / amphotericin बी, 0.5 मिलीग्राम, hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 मिलीग्राम, इंसुलिन, 0.5 मिलीग्राम, पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक , 0.5 मिलीग्राम, स्थानांतरित, 0.5 मिलीग्राम) 500 मिलीलीटर HBM करने के लिए।
- एक 0.45 माइक्रोन या 0.22 माइक्रोन एक बोतल टॉप फिल्टर यूनिट या एक सिरिंज टिप फिल्टर का उपयोग फिल्टर के माध्यम से बाँझ फिल्टर।
- एक hemocytometer पर गिनती के बाद प्रत्येक कोशिका प्रकार निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार thawed किया गया है द्वारा प्राथमिक मानव hepatocytes, Kupffer कोशिकाओं, और तारामय कोशिकाओं की सेल घनत्व का निर्धारण करते हैं।
- हो ची मिन्ह मीडिया में सेल नंबर से एक 80:10:10 अनुपात है कि एक शंक्वाकार ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है में प्राथमिक मानव hepatocytes, Kupffer कोशिकाओं, और तारामय कोशिकाओं का मिश्रण।
नोट: मीडिया का इस्तेमाल किया जा करने के लिए की मात्रा समग्र सेल नंबर पर आवेदन करने के लिए विशिष्ट निर्भर करता है और वें द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिएई उपयोगकर्ता। - 20 डिग्री सेल्सियस पर 520 XG पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate, सेल गोली पीछे छोड़ रहा है।
- हो ची मिन्ह मीडिया में सेल गोली Resuspend प्रति 40 μl मीडिया 1,000 कोशिकाओं से युक्त एक सेल निलंबन उपज के लिए। पर spheroids की संख्या उत्पादन किया जा रहा कुल मात्रा निर्भर है।
- 96 अच्छी तरह प्रारूप फांसी ड्रॉप प्लेटों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। लगभग 1000 कोशिकाओं की कुल 3 दिन के दौरान जो बहुकोशिकीय spheroids फार्म के लिए 5% सीओ 2 में HCM में एक अच्छी तरह से जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए।
- एक pipettor का उपयोग कर फांसी ड्रॉप थाली से जिगर spheroids लीजिए। एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण।
- hepatocyte बेसल मीडिया (HBM) और बाँझ छानने के लिए हो ची मिन्ह पूरक घटक किट के thawed सामग्री जोड़कर HCM तैयार करें।
- जिगर-विशिष्ट हाइड्रोजेल bioink में Bioprint जिगर spheroids
- चरण 1 में वर्णित है, crosslinkers के रूप में 8% PEGDA और 8% 8 शाखा खूंटी alkyne रोजगार जिगर ईसीएम युक्त हाइड्रोजेल bioink की एक सूत्रीकरण तैयार करें। resu में अपनी क्षमता के लिए इस संयोजन का उपयोग करेंएक हाइड्रोजेल मूल निवासी जिगर के ऊतकों को कतरनी लोचदार मापांक में करीब में lting।
- spheroids शंक्वाकार ट्यूब के नीचे, जिसमें वे कदम 3.1.7 में रखा गया था करने के लिए तय है। इस अंडाकार आकृति आकार और घनत्व के आधार पर भिन्न होता है, लेकिन आम तौर पर 1-2 मिनट के भीतर होता है। ध्यान से श्वास द्वारा या एक pipettor के साथ सभी मीडिया निकालें।
- spheroids युक्त शंक्वाकार ट्यूब हौसले से तैयार हाइड्रोजेल bioink समाधान के वांछित मात्रा स्थानांतरण। आम तौर पर, एक उचित मात्रा 10% -25% 3-डी निर्माण की मात्रा मुद्रित करने के लिए अधिक से अधिक है। ध्यान से हाइड्रोजेल bioink समाधान में spheroids resuspend करने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और। एक pipettor या सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक bioprinter कारतूस के लिए स्थानांतरण।
- bioprinter कारतूस के अंदर, समाधान 30 मिनट के लिए पहले चरण crosslinking (thiol-acrylate प्रतिक्रिया) से गुजरना करने के लिए अनुमति देते हैं।
नोट: अंडाकार आकृति आकार पर निर्भर करता है, धीरे-धीरे कारतूस होने की घुमाया आवश्यकता हो सकती है या सामग्री के साथ मिश्रित होना पड़ सकता हैएक बाँझ रंग मंच 1 crosslinking दौरान spheroids bioink भर में वितरित रखने के लिए। इस spheroids के बजाय निलंबित कोशिकाओं के साथ तैयार bioinks के लिए एक आवश्यकता के कम है।
नोट: चरण 1 crosslinking के बाद, उन कई घंटे की एक ऑपरेटिंग खिड़की है। हालांकि, यह bioprinting प्रक्रिया को पूरा करने के लिए जल्दी से सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए सिफारिश की है। - चरण 1 crosslinking के बाद, प्राथमिक जिगर spheroids (या अन्य कोशिकाओं) युक्त वांछित हाइड्रोजेल संरचना बनाने के लिए एक bioprinting डिवाइस का उपयोग करें।
नोट: इस प्रौद्योगिकी संरचनाओं की एक विस्तृत विविधता biofabricating के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। इस तरह कुल मात्रा कोशिकाओं या spheroids, मुद्रित संरचना ज्यामिति की संख्या, और सब्सट्रेट के रूप में पैरामीटर जिस पर मुद्रित कर रहे हैं निर्माणों उपयोगकर्ता के लक्ष्यों पर अत्यधिक निर्भर हैं। - इच्छित विन्यास में बयान के बाद, 2-4 सेकंड के लिए पराबैंगनी प्रकाश प्रशासन माध्यमिक crosslinking तंत्र आरंभ करने के लिए, सह स्थिरnstructs और वांछित स्तर तक बढ़ रही कठोरता।
नोट: खूंटी-alkyne की एकाग्रता, और इस तरह कुल मिलाकर अंतिम crosslinking घनत्व, मुख्य रूप से अंतिम निर्माण कठोरता को नियंत्रित करता है। - आदेश बहुस्तरीय निर्माणों बनाने के लिए कदम 3.2.4 और 3.2.5 दोहराएँ।
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Representative Results
ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का पालन सही ढंग से कर रहे हैं, हाइड्रोजेल एक जैव रासायनिक प्रोफ़ाइल लक्ष्य ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट शामिल करना चाहिए, 20 bioprinting और अंतिम लोचदार मापांक, 34 से अधिक नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के लिए अनुमति देते हैं और ऊतक निर्माणों में व्यवहार्य कार्यात्मक कोशिकाओं समर्थन करते हैं।
हाइड्रोजेल अनुकूलन
सबसे अच्छा नकल मूल निवासी जिगर के लिए, हाइड्रोजेल bioink जिगर ईसीएम समाधान और एक विकास फैक्टर ऐरे द्वारा पूरक किया गया था, 20 ईसीएम समाधान वृद्धि कारक है और साइटोकिन्स (पीजी / एमएल, चित्रा 1 ए में दिखाया गया है) की एक विस्तृत किस्म के होते हैं। ये मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF), bFGF, हड्डी morphogenetic प्रोटीन 5 (बीएमपी 5), FGF -4, इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक बाध्यकारी प्रोटीन 2 (IGFBP-2), TGF- बी 1, बीएमपी -7, EGF शामिल , FGF-7, वृद्धि हार्मोन (जीएच), हेपरिन बाध्यकारी EGF की तरह वृद्धि कारक (एचबी EGF), HGF और एनeurotrophin 3 (NT-3)। इसके अतिरिक्त, ईसीएम समाधान अतिरिक्त संरचनात्मक घटक है, जो वर्णमिति assays से विश्लेषण कर रहे होते हैं। 20 जिगर ईसीएम समाधान के लिए, जिगर ईसीएम समाधान के कुल कोलेजन सामग्री था 91.33 ± 0.58 मिलीग्राम / एमएल, इलास्टिन सामग्री था 189.33 ± 48.40 मिलीग्राम / एमएल, और ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (भूमिकाः) सामग्री 86.00 ± 53.45 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 1 बी) था।
हाइड्रोजेल, bioink यांत्रिक गुणों एक कतरनी तनाव झाडू टेस्ट (0.6-10 फोनों के लिए, दोलन आवृत्ति 1 हर्ट्ज) rheometer पर। 10,12,13,34 का उपयोग कर विशेषता जा सकता सहज चरण 1 thiol-acrylate रसायन विज्ञान तटस्थ पीएच पर घटित करने के लिए अनुमति देकर 113.66 ± 22.59 पा के एक जी 'के साथ एक नरम हाइड्रोजेल का गठन किया है। यूवी photopolymerization द्वारा चरण 2 thiol-alkyne crosslinking की दीक्षा के बाद, लगभग 10 किलो पास्कल (10,637 ± 113.83 फोनों के लिए, figu करने के लिए जी 'बढ़ जाती हैफिर 1 सी), नकल उतार जिगर ऊतक लोच। सांद्रता, आणविक वजन, और crosslinkers की geometries के अतिरिक्त हेरफेर चरण 2 जी 'मूल्यों की एक विस्तृत रेंज को प्राप्त कर सकते हैं। 34
Bioprinted हाइड्रोजेल की गुणवत्ता
रासायनिक रणनीति और हाइड्रोजेल bioinks के चरण 1 और चरण 2 crosslinking के कार्यान्वयन चित्रा 2 में वर्णित है। सामान्य में, इस तरह के Extralink, के रूप में crosslinkers जो acrylated खूंटी पॉलिमर के आधार पर कर रहे हैं, अनायास तटस्थ पर हेक्टेयर पर thiol समूहों और जिलेटिन चेन के साथ प्रतिक्रिया पीएच (चरण 1) कोशिकाओं की उपस्थिति में एक नरम extrudable हाइड्रोजेल के रूप में। इस नरम हाइड्रोजेल एक bioink, जिसके बाद पराबैंगनी प्रकाश unreacted thiols और माध्यमिक crosslinkers alkyne संशोधित खूंटी पॉलिमर के आधार पर की photopolymerization आरंभ करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में bioprinted जा सकता है। विशेष आणविक वजन और crosslinkers की geometries जानाVern bioprinted निर्माण के अंत कठोरता। एक 7 x 7 मिमी पैटर्न परीक्षण प्रयोजनों (चित्रा 3 ए) के लिए लागू किया गया था। प्रारंभिक परीक्षणों से पता चला है कि प्रारंभिक योगों extrudable थे, लेकिन दौरान और बाहर निकालना (चित्रा 3 बी) के बाद अनियमित और clumped दिखाई दिया। बाहर निकालना गुणों में सुधार करने के लिए, असंशोधित हा और जिलेटिन bioinks (1.5 मिलीग्राम / एमएल और 30 मिलीग्राम / एमएल) के लिए सहारा लिया जाता था। में सुधार चिकनी मुद्रित संरचना चित्रा -3 सी में दिखाया गया है।
व्यवहार्यता और bioprinted प्राथमिक मानव यकृत निर्माणों के बुनियादी समारोह
3 डी का प्रयोग bioprinter बायोएक्टिव जिगर-विशिष्ट हाइड्रोजेल bioink encapsulate और प्राथमिक मानव यकृत spheroids, पहले ड्रॉप संस्कृतियों फांसी, प्लास्टिक coverslips पर द्वारा तैयार जमा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्लास्टिक coverslips सेल संस्कृति वातावरण की एक किस्म के लिए मजबूत हैंडलिंग और हस्तांतरण के लिए अनुमति पर मुद्रित किया जा रहा है। bioprinting के बाद, हायजिगर निर्माणों में जीएच सेल व्यवहार्यता लाइव / मृत व्यवहार्यता / cytotoxicity धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा -4 ए) के बाद मनाया गया। इष्टतम पर्यावरणीय परिस्थितियों में व्यवहार्यता 85% से ऊपर होना चाहिए। प्राथमिक मानव hepatocytes आम तौर पर यांत्रिक और रासायनिक तनाव है, जो पर्यावरण चर के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता के प्रति संवेदनशील माना जाता है।
bioprinting और व्यवहार्यता के सत्यापन के बाद, अतिरिक्त जिगर निर्माणों कि संस्कृति में रखा जाता है स्रावित यूरिया और एल्बुमिन के विश्लेषण के लिए 3 दिन, 7 दिन, 10 दिन, और दिन 14 पर हटाया मीडिया aliquots का विश्लेषण करके कार्यक्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। यूरिया वर्णमिति assays, 14 दिन की समय के पाठ्यक्रम पर जिगर निर्माणों से यूरिया स्राव की एक अपेक्षाकृत लगातार स्तर का पता चलता है 15 और 20 एनजी / एमएल (चित्रा 4 बी) के बीच शेष। पता चला यूरिया का स्तर अलग-अलग समय में एक दूसरे से काफी अलग नहीं थेअंक। मानव Albumin एलिसा परख पता चलता है कि निर्माणों से एल्बुमिन उत्पादन भी समय के साथ अपेक्षाकृत लगातार बनी हुई है, 125 और 140 एनजी / एमएल (चित्रा 4C) के बीच स्थिर शेष। साथ ही, जब जिगर ऊतक, intracellular एल्बुमिन की सकारात्मक अभिव्यक्ति, CYP3A4 (एक साइटोक्रोम P450 isoform चयापचय पर शामिल), ई cadherin (एक उपकला सेल सेल आसंजन प्रोटीन), और dipeptidyl का संकेत मार्करों के लिए दाग पेप्टिडेज़ -4 (एक प्रोटीन व्यक्त जिगर में अत्यधिक) (चित्रा 4 डी-एफ) मनाया जाता है। साथ में ले ली, इस व्यवहार्यता और कार्यात्मक आंकड़े बताते हैं कि ऊतक विशेष व्यवहार्यता और bioprinted प्राथमिक सेल आधारित जिगर निर्माणों के समारोह को बनाए रखने में हाइड्रोजेल bioink एड्स।
चित्रा 1. हाइड्रोजेल घटक लक्षण वर्णन और कठोरता मूल्यांकन। ए) विकास का कारक है औरजिगर। बी से तैयार ईसीएम समाधान) कोलेजन, ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन के वर्णमिति परख मात्रा का ठहराव, और जिगर ईसीएम समाधान में इलास्टिन सामग्री के लिए प्रोटिओमिक्स सरणियों द्वारा साइटोकाइन विश्लेषण। सी) की क्षमता bioink कठोरता को नियंत्रित करने का प्रदर्शन। बाद चरण 1 crosslinking, जेल अपेक्षाकृत नरम और आसानी से निकाला जा करने में सक्षम है। बाद पराबैंगनी प्रकाश, परिमाण के एक आदेश से अधिक लोचदार मापांक बढ़ जाती है, जिगर ऊतक लोचदार मापांक नकल उतार द्वारा चरण 2 crosslinking। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. ऊतक के ऊपर बाहर निकालना bioprinting और नियंत्रण के लिए कई खूंटी-आधारित crosslinkers रोजगार यांत्रिक गुणों का निर्माण। एसacrylate आधारित crosslinkers (crosslinker 1), alkyne आधारित crosslinkers (crosslinker 2) के शामिल मुद्रण योग्य bioinks के निर्माण के trategy, हा, thiolated जिलेटिन, ऊतक ईसीएम सामग्री, और असंशोधित हा और जिलेटिन thiolated। bioink तैयार करने के लिए तैयार है और अनायास बाध्यकारी thiol-acrylate के माध्यम से crosslinks, एक नरम, extrudable सामग्री में जिसके परिणामस्वरूप। Bioprinting किया जाता है। अन्त में, bioprinted परतों में जुड़े हुए हैं, स्थिर, और जिगर लोचदार मापांक के लिए लाया। इस प्रक्रिया को बहुस्तरीय संरचनाओं उत्पन्न करने के लिए दोहराया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा bioinks 3. Bioprinting परीक्षण। ए) एक 7 x 7 मिमी घुमावदार पैटर्न bioink बाहर निकालना परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया गया थाbioprinter में हैैं। बी) के एक PEGDA और 8 हाथ खूंटी alkyne bioink की प्रारंभिक सूत्रीकरण अनियमित बयान। सी में हुई) कच्चे हा जोड़ना और जिलेटिन bioink के निर्बाध बाहर निकालना है, जिसके परिणामस्वरूप बाहर निकालना सुधार हुआ है। स्केल बार -। 1 मिमी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. व्यवहार्यता और जिगर-विशिष्ट हाइड्रोजेल bioink। ए) bioprinting के लिए जिगर bioink के कार्यान्वयन में bioprinted जिगर spheroids के समारोह का प्रदर्शन, उच्च व्यवहार्यता निर्माणों में हुई। ग्रीन - calcein AM से सना हुआ व्यवहार्य कोशिकाओं; लाल - ethidium homodimer से सना हुआ मृत कोशिकाओं बी) यूरिया और सी) एल्बुमिन में 14 घ जिगर निर्माणों द्वारा स्रावित।संस्कृति में ays, क्रमशः, वर्णमिति और एलिसा assays के द्वारा मात्रा। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। डी) CYP3A4, ई) Intracellular एल्बुमिन, और एफ) DPP4 और ई cadherin: जिगर ऊतक के साथ जुड़े मार्कर की Immunostaining। हरे या लाल - दाग संकेत दिया; ब्लू -। DAPI यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वहाँ कई घटक है कि जब मनुष्य में या इन विट्रो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए, 3-डी ऊतक निर्माणों biofabricate करने के प्रयास में अंतिम उपयोग के लिए विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उचित सेलुलर घटकों को रोजगार अंत संभावित कार्यक्षमता निर्धारित करता है, जबकि biofabrication डिवाइस ही अंत का निर्माण तक पहुँचने के लिए सामान्य कार्यप्रणाली निर्धारित करता है। तीसरे घटक, biomaterial, के रूप में यह दोहरी भूमिकाओं में कार्य करता है, उतना ही महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, biomaterial घटक दोनों biofabrication हार्डवेयर (यानी, bioprinters) और भी संभावित नाजुक जैविक सेल घटकों का समर्थन के साथ संगत होना चाहिए। इन आवश्यकताओं के दोनों अनुकूलन मुश्किल हो सकता है, bioprintable सामग्री कई महत्वपूर्ण मापदंडों को पूरा करने की जरूरत है: 1) उचित रासायनिक, यांत्रिक, और लौकिक गुण कुशल और भार रहित मुद्रण की सुविधा के लिए अधिकारी, 2) तैयारी चरणों और bioprin दौरान समर्थन सेल व्यवहार्यताटिंग प्रक्रिया; 3) और सत्कार वातावरण है कि सबसे अच्छा सेल व्यवहार्यता और अंतिम ऊतकों का निर्माण समारोह bioprinting निम्नलिखित बढ़ाता है प्रदान करते हैं। हम मॉड्यूलर हाइड्रोजेल bioink प्रणाली कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए वर्णित रोजगार। सबसे पहले, वृद्धि कारक है, कोलेजन, gags, और एक विशेष ऊतक प्रकार की ईसीएम से निकाली गई Elastins को शामिल करके, हम एक जैव रासायनिक प्रोफ़ाइल है कि लक्ष्य ऊतक प्रकार की याद ताजा करती है हासिल कर सकते हैं। दूसरा, 2 समान है, लेकिन स्वतंत्र crosslinking प्रतिक्रियाओं को रोजगार से हम एक नरम extrudable सामग्री है जो सबसे बाहर निकालना आधारित है, जो आगे दूसरे crosslinking कदम के साथ बदला जा सकता है एक निर्धारित सामग्री लोचदार मापांक लक्ष्य से मेल खाता है तक पहुँचने के लिए के साथ संगत है को प्राप्त करने में सक्षम हैं पसंद के ऊतक। 34
इस प्रणाली है कि यह उपयोगी बनाता है की महत्वपूर्ण विशेषता कई रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि polyme हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता समर्थन करने की क्षमता हैrization कैनेटीक्स और bioink प्रणाली के यांत्रिक गुणों। 2 स्वतंत्र प्रतिक्रिया प्रकार, thiol-acrylate और thiol-alkyne काम करके, हम एक चरण 1 thiol-acrylate प्रतिक्रिया है कि एक नरम सामग्री है कि एक सिरिंज या bioprinting डिवाइस के माध्यम से निकाला जा सकता है में परिणाम है, और एक मंच 2 thiol प्रदर्शन करने की क्षमता प्राप्त -alkyne प्रतिक्रिया है, जो केवल एक photoinitiator, जो अंतिम bioprinted निर्माण के लोचदार मापांक निर्धारित करता है की उपस्थिति में यूवी जोखिम पर शुरू की है। ये कई कदम एक bioprintable सामग्री में परिणाम। जैसे, ताकि एक स्थिर bioink कि, बाहर निकालना और बाद लोचदार मापांक अनुकूलन का समर्थन करता है ये अलग प्रतिक्रिया प्रकार बनाए रखने के लक्ष्य को हासिल करने में महत्वपूर्ण है।
biofabrication के लिए प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्राथमिक ड्रॉ जो या तो माध्यमिक crosslinker के माध्यम से अंत लोचदार मापांक जोड़ तोड़, या अलग ऊतक व्युत्पन्न ईसीएम सामग्री के शामिल किए जाने के माध्यम से के माध्यम से किया जाता है अनुकूलन के लिए अपने आसानी है, या वृद्धि कारक कॉकटेल। ऊतकों में ईसीएम वृद्धि कारक है और अन्य साइटोकिन्स, जो अक्सर प्रकार के ऊतकों के बीच समग्र वितरण में भिन्नता की एक किस्म शामिल हैं। हम मानते हैं कि इन कारकों जैसे प्राथमिक मानव hepatocytes के रूप में कुछ प्रकार की कोशिकाओं के समारोह को बनाए रखने के लिए अभिन्न अंग हैं। इस अवधारणा के कार्यान्वयन के पहले व्यवहार्यता और heparinized hyaluronic एसिड सैंडविच संस्कृतियों में प्राथमिक मानव hepatocytes का कार्य करते हैं। 20 बढ़ाने के लिए हेपरिन के बंधन में वृद्धि कारकों के साथ हाइड्रोजेल के साथ ही जिगर ईसीएम से अन्य ईसीएम घटकों में हेपरिन चेन के संयोजन के द्वारा प्रदर्शन किया गया था, हम में सक्षम थे इस जिगर-विशिष्ट प्राथमिक मानव hepatocytes, समय की एक विस्तारित अवधि के लिए इन विट्रो में व्यवहार्यता और समारोह को बनाए रखने के लिए जैव रासायनिक प्रोफ़ाइल पेश करने के लिए। यह दृष्टिकोण आसानी से शोधकर्ताओं decellularizing और अन्य ऊतकों solubilizing द्वारा इन ऊतक विशेष कारकों की आवृत्ति को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है।
तम्बू "> उपयोगकर्ता बारे में पता होना चाहिए कि इस bioink प्रणाली के आधार घटकों bioprinting में पहले से लागू किया गया है, जबकि, 10,12,17, लेकिन कम सूक्ष्म, ऊतक विशिष्ट दृष्टिकोण, साथ ही अन्य पुनर्योजी दवा आवेदनों की एक किस्म में, 35 45 biofabrication सभी प्रकार के ऊतकों के लिए प्रयास नहीं किया गया है। इस तरह के रूप में, वहाँ कुछ आगे विकास और आदेश में इस तरह अतिरिक्त ऊतक निर्माणों को बनाने के लिए आवश्यक समस्या निवारण हो सकता है। हालांकि, इस तरह यहाँ वर्णित है कि के रूप में एक मॉड्यूलर प्रणाली बहुत अच्छी तरह से अनुकूल हो सकता है। अन्य संभावित सीमाओं प्राकृतिक समानताएं कुछ सेल प्रकार विशिष्ट biomaterials की ओर हो सकता है कि शामिल हैं। सामान्य में, हमने पाया है कि Hyaluronic इस हाइड्रोजेल प्रणाली के समर्थन की एसिड, जिलेटिन, और खूंटी-आधारित आधार घटक वहाँ सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता का व्यवहार्य संस्कृतियों, अभी तक कोशिकाओं है कि इस तरह के कोलेजन, जो एक अंतर्निहित रेशेदार na है के रूप में विभिन्न रचनाओं के इंजीनियर वातावरण में बेहतर प्रदर्शन करने के कुछ प्रकार के हो सकते हैंसंरचना, या इलास्टिन है, जो प्रकृति और अधिक लचीला कर रहा है। जैसे, एक दिया ऊतक प्रकार और अंत आवेदन के लिए इष्टतम सामग्री के लिए विचार के लिए महत्वपूर्ण है, और हाइड्रोजेल bioink प्रणाली यहाँ वर्णित सभी उपयोगों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। इसके अतिरिक्त, यह पर्यावरण की स्थिति है जिसके तहत bioprinting किया जाता है पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, हम पास के परिवेश (कमरे के तापमान) किसी भी सेल मीडिया के बिना bioinks, जो गरीब व्यवहार्यता के लिए नेतृत्व का उपयोग कर स्थितियों से संक्रमित कर यदि तैयारी और मुद्रण बार भी 37 डिग्री bioinks सी का उपयोग कर के तहत, करने के लिए और अधिक तेजी से प्रोटोकॉल बाहर खींचा गया था एक मीडिया घटक है, जो नाटकीय रूप से वृद्धि हुई सेल व्यवहार्यता के साथ।अभी हाल तक, कुछ सामग्री या सामग्री प्रणालियों विशेष रूप से विकसित किए गए bioprinting सिस्टम के साथ इंटरफेस करने के लिए। नतीजतन, अधिकांश सामग्री सरलीकृत कर रहे हैं, कोशिकाओं को समर्थन करने के लिए लाभ के लिए या तो उनके जैविक विशेषताओं, या, biofabrication के साथ अपनी संगतताहार्डवेयर। कुछ सामग्री दोनों स्थानों में उपयोगी हैं। सिस्टम इस पद्धति में वर्णित इन विशेषताओं decouples, जिससे जैविक लक्षण वर्णन के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, जबकि यांत्रिक गुणों बाहर निकालना bioprinting के लिए आवश्यक सुविधा। इस हाइड्रोजेल bioink प्रणाली का एक अतिरिक्त अंतर यह है कि यह लक्ष्य ऊतकों यह biofabricating के लिए प्रयोग किया जाता है की दोनों जैव रासायनिक और शारीरिक मापदंडों की नकल कर सकते है। यह लचीलापन के एक प्रभावशाली स्तर का समर्थन करता है लगभग किसी भी ऊतक के जैव रासायनिक कारकों का संक्षिप्त अनुमति देता है, साथ ही किसी भी नरम ऊतक की लोचदार मापांक मिलान। दोनों एक ऊतक के इन पहलुओं पर ध्यान शायद ही कभी मिलकर में पता लगाया गया है।
इस प्रौद्योगिकी के मॉड्यूलर प्रकृति एक लचीलापन आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में लागू किया जाना देता है। विभिन्न प्रकार के ऊतकों की नकल करने की क्षमता नहीं है, बस जिगर इस काम में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया निर्माणों biofabricate करने की क्षमता प्रदान करता है, लेकिन चोरstructs शरीर में अन्य ऊतकों के कई प्रतिनिधित्व। शायद सबसे स्पष्ट व्यापक इन मापदंडों का उपयोग कर आवेदन में इस तरह के आरोपण या नशीली दवाओं और विष विज्ञान स्क्रीनिंग के रूप में असली अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियर निर्माणों के अंत समारोह अनुकूलन करने के लिए एक विशेष ऊतकों को दोनों पहलुओं से मेल करने की क्षमता है। जबकि मरीजों में प्रत्यारोपण के लिए मानव आकार ऊतकों की पीढ़ी नियामक बाधाओं, सेल सोर्सिंग, और ऊतक इंजीनियर अंगों में कार्यात्मक वाहिका के निर्माण की क्षमता पर सीमाओं के कारण, कई शोधकर्ताओं के लिए अंत लक्ष्य है, इस महान लक्ष्य आगे के विकास के लिए और समय की आवश्यकता होगी एहसास होना। इन विट्रो प्लेटफार्मों के लिए "organoids" पैदा करने के लिए लागू किया जाना हालांकि, इस तरह कार्यप्रणाली यहाँ वर्णित के रूप में प्रौद्योगिकियों वर्तमान में शुरुआत कर रहे हैं। हमारी टीम, साथ ही दूसरों को, वर्तमान में मॉडल प्रणाली में जो विष विज्ञान के अध्ययन प्रदर्शन कर रहे हैं बनाने के लिए biofabrication organoid का उपयोग होता है। इसके अतिरिक्त, इस तरह के organoids करने के लिए नियोजित किया जा सकताइस तरह के कैंसर, 46 के रूप में विकृतियों और रोग प्रगति, अध्ययन और संभावित चिकित्सीय उपचार का परीक्षण करें। अन्त में, इस प्रणाली को भी एक अन्य महत्वपूर्ण उपयोग का समर्थन करता है। स्वतंत्र रूप से इन मानकों से छेड़छाड़, शोधकर्ताओं यांत्रिक कारकों की तुलना में जैव रासायनिक के रिश्तेदार महत्व को निर्धारित करने के लिए बुनियादी विज्ञान के प्रयोगों प्रदर्शन कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों कृतज्ञता डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी (DTRA) अंतरिक्ष और नौसेना वारफेयर सिस्टम केंद्र प्रशांत (एसएससी प्रशांत) अनुबंध सं N6601-13-C-2027 के तहत द्वारा धन स्वीकार करते हैं। इस सामग्री के प्रकाशन के निष्कर्षों या निष्कर्ष के साथ साथ सरकार द्वारा अनुमोदन का गठन नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
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