Introduction
Das Konzept der mütterlichen Immunaktivierung (MIA) stammt aus den epidemiologischen Studien über die Assoziation der Infektion der Mutter mit Autismus und Schizophrenie 1. Aufgrund des Fehlens von nachweisbarem replizierenden viralen Pathogenen in der Plazenta oder fetalen Gehirn nach mütterlichen Virusinfektion 2,3, wird die Wirkung der Infektion auf die Nachkommen Hypothese eher durch die Aktivierung des mütterlichen Immunsystem verursacht werden , als die Pathogene selbst .
Polycytidylsäure: Um die Ursache-Wirkungs-Beziehung zwischen MIA und psychiatrischen Störungen, die Injektion von chemisch synthetisierten, viral mimic doppelsträngige RNA polyinosinic aufzuklären (poly (I: C)) in schwangeren Nagetieren wurde als Tiermodell für MIA weit verbreitet 4,5. Poly (I: C) von Toll-like-Rezeptor erkannt wird 3 (TLR3) und die systemische Verabreichung von Poly (I: C) induziert viral wie akute Entzündungsreaktion. Einer der Mechanismen, durch die poly (I: C) produces Verhaltensstörungen und Neuropathologien bei den Nachkommen wird durch ein Ungleichgewicht von pro- und anti - inflammatorischen Zytokinen in der mütterlichen Plazenta-fetalen Achse 6 verursacht. Mehrere Gruppen haben die MIA - Modell angenommen , die Ätiologie von psychiatrischen Störungen 7 und aufgrund der unterschiedlichen Interessen zwischen Forschungsgruppen, verschiedenen Zeitpunkten der Immunaktivierung verwendet worden , um zu verstehen , 7 verschiedene Störungen auf die Entwicklung des Gehirns und das Verhalten zu erreichen.
Das Paul H. Patterson Labor am California Institute of Technology nimmt die Strategie der Injektion von Poly (I: C) in trächtigen Mäusen an embryonalen 12,5 Tage (E12,5), die erfolgreich unter Beweis gestellt hat, dass MIA induzieren Verhaltens-, neurologische fähig ist, und immunologische Veränderungen bei den Nachkommen , die mit Autismus und Schizophrenie 8-11 verbunden sind. Unser Stand der Arbeiten zeigen , dass MIA Nachwuchs Verhaltensauffälligkeiten zeigen (zB soziale impairment, Kommunikationsdefizit, repetitive Verhalten, Angst-ähnliches Verhalten und latente Hemmung Defizit 8,10,12), Immundysregulation und Zytokine Ungleichgewicht 8,13,14, Veränderung des fötalen Gehirns Genexpression 15, Verlust der Purkinje - Zellen in Läppchen VII von Cerebellum 11, Veränderung der synaptischen Eigenschaften in Hippocampus 9, Gen - Umwelt - Interaktion x 13, Veränderung der Darmdurchlässigkeit und Darmmikrobiota Zusammensetzung 16. Darüber hinaus werden therapeutische und prophylaktische Strategien auch von diesem Modellsystem 13,16,17 entwickelt. Durch die Induktion MIA bei E12,5, andere haben gezeigt , dass MIA fötalen Mikrogliaaktivierung und cholinergen Entwicklungs Veränderung in basalen Vorderhirns 18, Stamm spezifische Wechselwirkung 19, Gehirn zerebralen synaptosomaler ultra Anomalien, zerebrale mitochondrialen Atmungskette Überfunktion abnormalties, Herabregulation der zerebralen synaptischen Moleküle 17 erzeugt .depressiv-ähnliche Verhaltensweisen, Beeinträchtigung der Kognition und des Hippocampus Langzeit - Potenzierung (LTP), und das Defizit von Erwachsenen Neurogenese im Hippocampus 20.
Hier bieten wir eine detaillierte Methode, wie MIA zu induzieren bei E12,5 von Poly (I: C), sowie Paradigmen, wie dieses Modell anzuwenden, um die Entstehung von Autismus und Schizophrenie zu studieren. Es ist wichtig zu beachten , dass MIA ein Risikofaktor für eine Vielzahl von Erkrankungen ist 4, und dessen Ergebnisse sind extrem empfindlich gegenüber der Zeit und Methode der Induktion sowie die Haltung der trächtigen Muttertieren. Als solche auch kleinere Unstimmigkeiten zwischen den Laboratorien führen oft zu geringe Reproduzierbarkeit und / oder unterschiedlichen Phänotypen bei den Nachkommen. Unsere Methode ist für die Interessenten an einem Studium MIA als Umweltrisikofaktor für Autismus und Schizophrenie speziell entwickelt, und die detaillierte Beschreibung wird es den Forschern zur Verfügung gestellt helfen, die Reproduzierbarkeit ihrer Daten zu verbessern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Protokolle wurden im Rahmen der Genehmigung des California Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Vorbereitung für Timed-Paarung Paare
- Verwenden Sie mindestens sechs Dämme für Verhaltensexperimente und 3 für die Genexpressionsanalyse.
HINWEIS: die doppelte Anzahl der geschätzten weiblichen Mäusen, da nur etwa 50% der Mäuse aus der timed-mating eingesteckt werden. - Verwenden weibliche Mäuse ohne vorherige Schwangerschaft und bei 8-16 Wochen alt sind.
HINWEIS: Weibliche Mäuse, die vor sexuellen Kontakt mit männlichen Mäusen haben, aber noch nicht schwanger gewesen sind akzeptabel. - Haus der weiblichen Mäusen zusammen und legen Sie die Käfige nebeneinander, um ihre Östrocyclus zu synchronisieren. Verwenden Sie ein Standard-Mäuse Käfig mit einer Höhe von mehr als 5,5 Zoll und einer 75 Quadratzoll Innenboden Gehäuse von 5 erwachsenen Mäusen zu ermöglichen. Beschriften Sie jede weibliche Maus mit einem Ohr Schlag.
2. Einrichten Timed-mating Pair
- Stellen Sie die timed-Paarung 0-2 Stunden, bevor der Dunkel-Zyklus beginnt. Legen Sie zwei weibliche Mäuse in jedem Käfig. Nehmen Sie die Mäuse heraus und wiegen sie einzeln. Nehmen Sie das Körpergewicht der einzelnen weiblichen Maus.
- Legen Sie eine männliche Maus in jedem Käfig mit den beiden weiblichen Mäusen. Verwenden trio Paarungs das väterliche Verwechselung Effekt zu minimieren.
3. Vaginalpfropfens Check (E0.5)
- Überprüfen Sie die weibliche Mäuse 0-4 Stunden nach der Dunkel-Zyklus endet. Heben Sie vorsichtig die weibliche Maus aus der Basis des Schwanzes und lassen Sie die Maus, um das Drahtgitter, Käfig oben oder Käfigrand zu greifen.
- Suchen Sie nach Anzeichen von Vaginalpfropfens: Vaginalpfropfens ist eine sichtbare weißliche Masse in die vaginale Öffnung. Wenn der Stecker nicht offensichtlich ist, legen Sie vorsichtig mit einem 200 ul Pipettenspitze in die vaginale Öffnung. Widerstand von Koagulation bestätigt Vaginalpfropfens Bildung. Überprüfen Sie die Vaginalpfropfens einmal pro Tag.
HINWEIS: Vaginal Stecker ist nur ein Hinweis darauf, dass der Kopulation, aufgetreten ist und daher nicht funktioniert guarantee Schwangerschaft. Vaginalpfropfens kann schwierig sein, in bestimmten Stämmen von Mäusen zu identifizieren. Wenden Sie sich an einen erfahrenen Mäuse Betreuer, die Genauigkeit der Stecker Identifizierung zu erhöhen. - Bewegen Sie die gesteckten Mäuse in einen neuen Käfig und Gruppe beherbergen sie. Definieren Sie den Tag der Vaginalpfropfens Aussehen wie embryonale 0,5 Tage (E0.5).
4. Auf E10.5-11.5, Check für Schwangerschaft
- Heben Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und lassen Sie die Maus, um das Drahtgitter, Käfig oben oder Käfigrand zu greifen. Beachten Sie die Bauchbereich auf Anzeichen einer Schwangerschaft zu überprüfen, zum Beispiel eine Ausbuchtung im Bauch (Abbildung 1).
HINWEIS: Das Zeichen der Schwangerschaft ist immer deutlicher bei E11,5 als bei E10,5. - Wiegen Sie die Mäuse Schwangerschaft zu überprüfen. Die schwangere Maus wiegt im Allgemeinen ungefähr 20% schwerer bei E10.5 und 30% schwerer bei E12.5 im Vergleich zu einer nicht-schwangeren Maus (Abbildung 2). Einfamilienhaus die schwangere Mäuse in saubere Käfige.
5. 20 mg /kg Poly (I: C) Herstellung
- Verwenden Sie mindestens sechs Dämme pro Gruppe für Verhaltensexperimente und 3 pro Gruppe für die Genexpressionsanalyse. Bereiten Sie die entsprechende Menge an Poly (I: C) Lösung.
- Wiegen Sie die poly (I: C) -Pulver in einem 50 ml konischen Röhrchen eine Endkonzentration von 40 mg / ml herzustellen. Um die Spannung, die durch Injektionsvolumen zu minimieren und zu standardisieren, injizieren 5 ul poly (I: C) Lösung pro Gramm Körpergewicht der Maus (5 & mgr; l / g bzw. 5 ml / kg). Zu induzieren MIA injizieren wir 20 mg Poly (I: C) pro kg.
HINWEIS: Die Konzentration von Poly (I: C) Lösung erforderlich ist (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Da das poly (I: C) Pulver enthält 10% poly (I: C), benötigen wir eine Endkonzentration von (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml Poly (I: C), um Lösung.
ACHTUNG: Die Poly (I: C) Pulver ist sehr leicht. Achten Sie darauf, keine Pulver zu verlieren, während aus dem Spachtel auf den konischen Röhrchen übertragen. - Fügen Sie die entsprechenden Volumen von 0,9% Natriumchlorid (Kochsalzlösung) in den konischen Wannee und die Kappe schließen. Lösen Sie das Pulver durch sanft die Salztropfen über der Poly-Walzen (I: C) Pulver, bis die Lösung klar ist. Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 1 min (3C). Filtern die poly (I: C) Lösung von 0,22-um-Filter. Übertragen die poly (I: C) Lösung eines 1,5 oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Optional: ein Spektralphotometer Verwenden Sie das 260/280 Verhältnis des Poly (I: C) zu messen Lösung. Sicherstellen , dass das Verhältnis zwischen 1,54 bis 1,82 (3) , wie vom Hersteller beschrieben. HINWEIS: Die Kochsalzlösung verwendet Poly aufzulösen (I: C) Pulver und dienen als Kontroll Injektion sollte steril und pharmazeutischer Qualität sein.
6. Saline oder Poly (I: C) Injection auf E12.5
- Wiegen Sie die Maus auf die Waage und steckte es wieder in den Käfig. Verwenden Sie die folgende Formel, um das Volumen der Injektion sowohl für Kochsalzlösung und Poly zu berechnen (I: C) Mäuse: Körpergewicht (g), multipliziert mit 5 = gewünschte Injektionsvolumen (ul). Verwenden Sie ein 0,3 ml insul(I: C) Lösung, beispielsweise 150 & mgr; l für eine 30 g Maus in der Spritze das berechnete Volumen Kochsalzlösung oder 20 mg / kg Poly auszuarbeiten.
- holen Sie vorsichtig die Maus durch die Basis des Schwanzes und legen Sie es auf der Oberseite des Käfigs. Behandeln Sie die Maus verwirrende Effekte sanft durch Stress ausgelöst zu vermeiden. Führen Sie die Nadel, Fase auf, bei etwa 20 ° gegenüber der Maus in die Mitte seiner beiden oberen Nippel (Abbildung 4), und injizieren , um die Kochsalzlösung oder Poly (I: C) Lösung. HINWEIS: Die Nadel sollte für jede Maus nach der Injektion ersetzt werden.
- Platzieren Sie die Maus wieder in seinen Käfig. Legen Sie die Käfige in einer ruhigen, wenig Verkehr Zimmer, die anderen verwirrende Effekte zu vermeiden.
7. Der Tag nach Poly (I: C) Injektion (E13.5)
- Schauen Sie sich die injizierten Mäuse am folgenden Morgen. Verwenden Sie eine Skala Körpergewicht zu messen.
HINWEIS: Poly (I: C) injiziert trächtige Mäuse gewinnen in der Regel weniger Gewicht als Salz Mäuse am Tag nach inj injiziertection. - Bitte nicht stören die Mäuse, bis die Nachkommen geboren werden.
8. Spur von MIA Nachkommen
- Um die verwirrende Wirkung von MIA Induktion zu minimieren, befolgen Sie die unten aufgeführten Richtlinien die Verwendung von MIA Nachkommen zu messen.
- Schließen Sie die Würfe von Frühgeborenen oder verzögerte Geburt, oder wenn die Wurfgröße kleiner als 5.
- Euthanize die übermäßigen Welpen von CO 2 , wenn die Wurfgröße größer als 10 ist.
9. Optional: Überprüfen Sie die akute Entzündungsantwort nach MIA
- Opfere die schwangere Mäuse 3 Stunden nach der Kochsalzlösung oder Poly (I: C) Injektion mit dem beschriebenen Verfahren in der Tierpflege Institution Ausschuss genehmigten Protokoll.
HINWEIS: Cervical Dislokation wird oft bevorzugt , da sie die Wirkung von CO 2 / Euthanasie Medikamente auf dem Damm und embryo minimiert. - Sammeln Sie die Milz von den erwachsenen schwangeren Mäusen und zu isolieren, die Plazenta und fetale brain unter dem Stereomikroskop.
- Für Milz Sammlung, legen Sie die Maus auf die Dissektion Platte und 70% Ethanol auf den Bauchbereich der schwangeren Mäusen sprühen. ein Paar sterile Schere unter dem Brustkorb durch die Haut einen vertikalen Schnitt in der Mitte der Bauchbereich zu machen.
- Die Milz liegt in der linken überlegen Bauch. Verwenden einer Pinzette, die Milz zu isolieren. Rollen Sie die Milz auf heikle Aufgabe Wischer, um das Fettgewebe um das Organ zu entfernen. Sammeln Sie in etwa 50 mg Milzgewebe und legen Sie sie einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA stabilisieren Puffer oder TRIzol zu Nukleinsäure-Abbau zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
- Für Plazenta Sammlung, ziehen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner aus dem Körper. Legen Sie die Gebärmutterhörner in einer Petrischale gefüllt mit autoklavierten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und lassen Sie die Schüssel auf dem Eis. Verwenden Sie zwei Zangen die Gebärmutterwand aufreißen und die Fruchtblase aus.
- Verwenden Sie vorsichtig die Pinzette die Fruchtblase zu öffnen, ohne die Plazenta und den Fötus schädigen. Trennen Sie die Plazenta von der Fötus und schneiden die Nabelschnur so nah an der Plazenta wie möglich. Entfernen Sie die Fruchtblase Trümmer aus der Plazenta. Legen Sie die Plazenta einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA-Puffer oder TRIzol stabilisieren. Lagern Sie die Probe bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
- Für fötale Gehirn Sammlung, Speicherung der Fötus in der RNA-Puffer von Schritt 9.2.2 bis Dissektion stabilisieren. Necken die pialen Membran aus dem Ventrikel des Gehirns mit zarten # 5 Pinzette unter dem Stereomikroskop ab. Entfernen Sie vorsichtig alle die Membran von der fetalen Gehirns. Legen Sie die fötale Gehirn einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 500 & mgr; l RNA-Puffer oder TRIzol stabilisieren. Lagern Sie die Probe bei -80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
- Extrahieren Sie die RNA aus dem Gewebe und wandeln die RNA in cDNA. Analysieren Sie den IL - 6 - Gen - Expression in der cDNA durch real-time PCR.
- Extrahieren Sie die RNA aus den Geweben durch Befolgen der Herstellung Protokoll TRIzol. Wenn die Gewebe in RNA Stabilisierungspuffer gespeichert. Tauen Sie die Probe und drehen Sie den Puffer nach unten. Übertragen Sie das Gewebe durch die Spitze auf einen anderen eppendorf mit 500 ul TRIzol und RNA-Extraktion fortzusetzen.
- Verwenden Sie ein Spektralfotometer, die Konzentration, 260/280 und 260/230 Verhältnis der RNA zu messen. Sicherstellen, dass die Verhältnisse über 2,0 sind.
- Beseitigen die DNA Kontamination durch behandelt, um die RNA mit DNase I. Mix 1 & mgr; g RNA, 1 & mgr; l 10X-Reaktionspuffer, 1 & mgr; l RNase-Free DNase und Nuklease-freies Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 & mgr; l. Inkubieren des Mastermix bei 37 ° C für 30 min. 1 & mgr; l DNase Stop-Lösung, um die Reaktion zu beenden. Inkubieren der Mischung bei 65 ° C für 10 min.
- Kehrt die RNA in cDNA transkribiert. Verwenden 20 ul-Reaktionen und bis zu 1 & mgr; g Gesamt-RNA pro Reaktion. Mix 4 ul 5x Transkription (RT) Reaktionsmischung Puffer umkehren, 1 & mgr; l reverse Transkriptase, 11 & mgr; l RNA - Matrize nach der Behandlung mit DNase I und 4 & mgr; l Nuklease-freies H 2 O , um eine endgültige 20 & mgr; l Lösung herzustellen. Den Thermocycler Bedingungen für die RT. Ein allgemeiner Zustand sind: Schritt 1: 25 ° C für 5 min; Schritt 2: 42 ° C für 30 min; Schritt 3: 85 ° C für 5 min; Schritt 4: Halten bei 4 ° C. Verdünnen Sie die cDNA 5 mal. Für die kurzfristige Lagerung, speichern Sie die cDNA bei 4 ° C. Für die Langzeitlagerung gefrier die cDNA bei -20 ° C.
- Analysieren Sie den IL - 6 - Gen - Expression in der cDNA durch real-time PCR und normalisieren die IL - 6 - Genexpression zu ß-Actin - Genexpression.
- Machen Sie einen Master - Mix für IL - 6 und β-Actin - Erkennung. Verwenden Sie 25 ul Reaktion, die Master - Mix für jedes Gen enthält 12,5 ul SYBR Green Mix, 0,5 ul 10 uM Vorwärtsprimer, 0,5 ul 10 uM Reverse - Primer und 6,5 ul Nuklease-freies H 2 O.
- Platz 5 ul 5x verdünnt cDNA eint die Unterseite des Brunnens von optischen 96-Well-Reaktionsplatte. Je 20 ul Master-Mix in jede Vertiefung eine endgültige 25 & mgr; l PCR-Mix zu machen. Verdreifachen jedes Gen für jede Probe. Verschließen Sie die Platte durch eine optische Klebefolie verwendet wird. Spin down die Platte bei 800 × g für 3 min bei 4 ° C Verwenden Sie das Standardprogramm von real-time PCR: Schritt 1: 50 ° C für 2 min; Schritt 2: 95 ° C für 10 min; Schritt 3: 40 Zyklen von 95 ° C für 15 sec und die Temperatur 60 ° C für 1 min. Fügen Sie einen zusätzlichen Schritt für -Dissoziationskurve.
Untersuchen 10. die Verhaltensauffälligkeiten in MIA Erwachsene Kinder (Optional):
- Führen Sie die Verhaltenstests im Alter von 8-12 Wochen. Ändern Sie den Käfig Bettwäsche mindestens 3 Tage vor dem Test. Akklimatisieren die Mäuse auf die Verhaltenstestraum mindestens 30 min vor dem Test.
- Für Präpulsinhibition (PPI), hemmen die Mäuse in Plexiglaszylinder mit einem piezoelektrischen Sensor darunter. Akklimatisieren die Mäuse auf die PPIKammer für 5 min. Setzen Sie die Mäuse mit 6 Studien mit 120 dB weißes Rauschen (Schreckhaftigkeit).
- Dann setzen die Mäuse mit randomisierten Mischungen von 14 Studien von Hintergrundgeräuschen, 14 Studien mit Startle, 14 Studien mit Prepuls 5 dB (5 dB höher als Hintergrundrauschen) + Startle (PPI5) und 14 Studien mit Prepuls 15 dB (15 dB höher als Hintergrundrauschen + Startle (PPI15).
- Der Mittelwert der Schreckhaftigkeit für die ersten 6 Studien von 120 dB Studien. Der Mittelwert der Schreckhaftigkeit für die anderen einzelnen Stimulationen. Covert den Wert auf Präpulsinhibition durch (Startle - PPI5 oder PPI15) / Startle.
- Für Open-Feldtest, legen Sie die Maus in die Ecke eines offenen Platz Arena (50 x 50 x 50 cm 3). Notieren Sie sich die Flugbahn der Maus für 10 min durch eine Decke montierten Kamera. Definieren Sie die Mitte der Arena als der mittleren Zone (17 x 17 cm 2). Quantifizieren Sie die zurückgelegte Strecke, Mittelzone Einträge und Zeit in Mittelzone verbracht manuell oder durch bildbasierte automatische Analyse-Software. Für Marmor Vergraben Test akklimatisieren Sie die Maus auf einen Testkäfig mit Druck 5cm tief, sauber, Aspen Kiefer Betten für 10 min. Bringen Sie die Maus auf seine homecage. Sanft legen Sie 20 marineblau 1,5 cm Durchmesser Glasmurmeln in der Art und Weise von 4 x 5-Anordnung. Platzieren Sie die Maus zurück in den Testkäfig mit Murmeln für 10 min. Zählen Sie die Murmeln, die in der 10 min Prüfdauer begraben wurde.
11. Überprüfen Sie die Zerebelläre Neuropathologie in MIA Erwachsene Kinder (Optional):
- Euthanize die Saline und MIA erwachsenen Nachkommen von Betäubungsmittel. Perfundieren die Maus mit 50 ml PBS und anschließend 50 ml 4% Paraformaldehyd durch die Herz-Kreislauf-System.
- Entfernen Sie das Gehirn sorgfältig und Postfix das Gehirn in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C. Spülen Sie das Gehirn mit PBS dreimal und speichern das Gehirn in PBS mit 0,02% Natriumazid in einem 4 ° C Kühlschrank bis zur Verwendung.
HINWEIS: Das nachfixiert Gehirn kann in PBS mit 0,02% sod gespeichert werdenium Azid im Kühlschrank für bis zu einem Monat. - Abschnitt das Gehirn in 50 & mgr; m dünne Scheiben sagittal mit Vibratom. Sammeln Sie die Gehirnschnitte mit einem weichen Pinsel Stift. Beenden Sie die endogene Peroxidase-Aktivität durch die Abschnitte in 0,6% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Inkubieren der Abschnitte in anti-Calbindin Antikörper in Blockierungspuffer (10% Ziegenserum mit 0,1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid in PBS) verdünnt, über Nacht bei Raumtemperatur. Dann Inkubieren der Abschnitte in entsprechende in biotinylierter sekundärer Antikörper verdünnt Puffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert.
- Inkubieren der Abschnitte in Avidin DH - biotinylierter Peroxidase-Komplex H-Puffer des Biotin für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu detektieren. Entwickeln Sie die Abschnitte durch Peroxidase-Substrat mit dem Antigen zu visualisieren. Waschen der Schnitte mit PBS dreimal zwischen den Schritten. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger. Bild die Abschnitte unter dem Mikroskop.
- Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
- Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
- Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
- Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
- Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
- Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
- Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
- Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
- Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
- Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
- Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
- Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
- Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
- Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
- Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
- Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
- Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
- Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
- Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
- Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Injektion von 20 mg / kg Poly (I: C) bei E12,5 konnte eine akute Entzündungsreaktion in der mütterlichen Plazenta-fetale Achse hervorrufen und eine chronische Wirkung auf die Entwicklung des Gehirns und Verhaltens - Phänotypen 12,13 auszufällen. Erhöhte Niveaus eines proinflammatorischen Cytokin, Interleukin (IL) -6, ist ein zuverlässiger Indikator einer akuten Entzündungsreaktion nach MIA. Die Spitzenzeit für IL6 Genexpression in der Plazenta und fötaler Gehirn ist 3 Stunden nach der poly (I: C) Injektions 12,13. Wir haben gezeigt, dass Poly gezeigt (I: C) induziert höhere IL6 Genexpression über die mütterliche Milz-Plazenta-fetalen Gehirns (Abbildung 5) (Daten von Wu angepasst et al, 2015) . 13. Die Forscher konnten dieses Paradigma mit einer anderen Behandlung kombinieren , um die Faktoren zu untersuchen, die akute Entzündungsreaktion nach MIA verändern könnten, zum Beispiel mütterliche Ernährung, genetische Mutanten - Mäuse, entzündungshemmende Medikamente, usw.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Auf der anderen Seite, sind Verhaltensänderungen Markenzeichen des MIA-Modell auch mehrere können Verhaltenstests auf die Nachkommen MIA Erwachsenen durchgeführt werden, um zu zeigen, verschiedene autistischen und schizophrenen-like. Verhalten. in der Regel , wenn sie Salz Nachkommen verglichen, zeigen MIA Nachkommen Daten Test und unteren PPI (Abbildung 6) (angepasst verbrachte weniger Zentrum Zoneneinträge und kürzere Dauer Mittelzone in offenen Feldtest. Sie begrub auch häufiger vergraben Verhaltensweisen in Marmor anzuzeigen von Wu et al., 2015) 13. der Verlust der Purkinje - Zellen im Kleinhirn Läppchen VII ist ein weiteres Markenzeichen von MIA Nachkommen (Shi et al., 2009). Wenn Sie mit Calbindin - Antikörper gefärbt, gibt es weniger Calbindin-positive Purkinje - Zellen im Kleinhirn Läppchen VII von MIA Nachkommen im Vergleich zur Kochsalzlösung Kontrolle Nachkommen (Abbildung 7).3643 / 53643fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Das Zeichen von schwangeren Mäusen. Mid-Trächtigkeit Maus kann durch die Beule in seiner Bauchbereich (Pfeil) identifiziert werden. Inbred C57BL / 6 - Maus - Stamm wird hier als ein Beispiel verwendet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Änderungen des Körpergewichts bei schwangeren C57BL / 6N Mäuse aus embryonalen (E) 0,5 bis 12,5 Tage. Bei einem Vergleich der schwangeren und nicht schwangeren Mäusen mit Vaginalpfropf , die an E0.5, die (A) Körpergewicht und (B) Prozentsatz des Körpergewichts erfährt einen dramatischen Anstieg bei E10,5 bei schwangeren Mäusen. Pregnant n = 10, nicht schwangeren n = 5. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. *** P <0,001, ****p <0,0001. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Extinktionsmessung von Poly (I: C).. Lösung Stellen Sie sicher , das 260/280 Verhältnis zwischen 1,54-1,82 ist Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Poly (I: C) Injektion an embryonalen (E) 12,5 Tage Scruff die schwangere Maus sanft.. Die Injektionsstelle ist am mittleren Punkt der oberen Nippel befindet. Spritzen Sie die Nadel, Fase auf, bei etwa 20 ° Winkel gegenüber der Maus. Inbred C57BL / 6 Mausstamm hier als Beispiel verwendet wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Poly (I: C) Injektion erhöht IL - 6 - Gen - Expression in den Milz-Plazenta-fetalen Gehirns Achse des Dammes Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.. * P <0,05, ** p <0,01 (Die Daten sind ursprünglich von Wu et al., 2015 und für die Artikel 13 geändert). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 6 & #. 160; MIA erwachsenen Nachkommen mit den Endophänotypen von Autismus und Schizophrenie assoziiert Verhaltensauffälligkeiten zeigen Im Freifeldtest, MIA Nachkommen (A) geben Sie die Mittelzone weniger häufig und (B) verbringen weniger Zeit in der mittleren Zone. (C) Im Marmor Vergraben Test, begraben MIA Nachkommen mehr Murmeln als Kochsalzlösung Kontrolle Nachkommen. MIA Nachkommen Präpulsinhibition (PPI) Defizit in (D) Prepuls 5 dB und (E) Prepuls 15 dB aufweisen. Mittelwert ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 (Die Daten sind ursprünglich von Wu et al., 2015 und für die Artikel geändert 13). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. MIA erwachsenen Nachkommen mit den Endophänotypen von Autismus neuropathologischen Auffälligkeiten zeigen. Der Verlust der Purkinje - Zellen in Läppchen VII in MIA erwachsenen Nachkommen gezeigt wurde. Pfeil: Calbindin + Purkinje - Zellen. ML: Molekülschicht, GCL: Körnerzellschicht, PCL. Purkinjezellschicht Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MIA Induktion zu unterschiedlichen Zeitfenstern stört unterschiedliche Entwicklung des Gehirns Ereignisse bei Nagern und folglich führt zu unterschiedlichen Verhaltensstörungen und Neuropathologien bei den Nachkommen. Hier beschrieben wir ein Protokoll zu induzieren MIA in Mäusen, die mit Poly (I: C) Injektion an E12.5. Diese Methode der MIA Induktion führt zu Verhaltens, neurologische, immunologische und Magen - Darm - Anomalien im Zusammenhang mit Autismus und Schizophrenie bei den Nachkommen 8,10,11,16. Es ist wichtig zu beachten, dass, weil MIA eine Umweltrisikofaktor ist, wird der Phänotyp der Nachkommenschaft zu haben höhere Variation erwartet als die von Mäusen, aus genetischen Modellen von Neuroentwicklungsstörungen. So genau und konsistent Autismus und Schizophrenie bezogenen Phänotypen durch MIA erzeugen, ist es besonders wichtig, zusätzliche Variablen zu minimieren, die die Ergebnisse durcheinander bringen kann.
Die Zeitleiste in dem beschriebenen Protokoll sollte in der Nähe verfolgt werdenly. Die richtige Einspritzzeitfenster würde sicherstellen, dass MIA die Nachkommen der Entwicklung des Gehirns in der gewünschten Stufe stört. Die Induktion von MIA bei E12,5 in Maus entspricht Störungen in der Nähe des Ende des ersten Trimesters in der menschlichen Schwangerschaft 21 - ein Zeitraum , in dem bedeutende Entwicklung des Gehirns auftritt, einschließlich der Entwicklung von Purkinje - Zellen und Nucleus caudatus Putamen und Neurogenese in der Rindenschicht. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Assoziation zwischen dem Verlust der Purkinje-Zellen in MIA Cerebellum und der frühen Störung der Gehirnentwicklung zu beweisen.
Während eine einheitliche Behandlung, Untersuchung und sogar Haltung der Dämme, die Wirkung der mütterlichen Stress auf die Nachkommen Phänotyp minimieren würde, enthält unser Protokoll noch Vorbehalte, die Forscher sollten sich bewusst sein. Zum Beispiel heben wir Haus, um die Dämme am Tag vor der Injektion von Poly (I: C) und für den Rest der Schwangerschaft. Unsere Strategie ist es, die trächtige Mäuse in einem undisturbe zu verlassend Umwelt. Jedoch könnte diese Wirkung Stressantwort in der mütterlichen Umgebung induzieren. Obwohl wir nicht wissen, ob diese Isolation induzierte Stress-Reaktion mit der Entwicklung der Nachkommen stört, kann die MIA-Effekt, indem Sie unser Verfahren zu beachten.
Darüber hinaus muss der Stamm und genetischen Hintergrund der Mäuse für MIA Induktions sorgfältig ausgewählt und geprüft werden. Bisher wird die Wirkung von MIA meist in Wildtyp C57BL / 6N Mäuse 8,10,13,16 repliziert. Andere haben auch beobachtet , die MIA - Effekt in BTBR Mausstamm 19. Es hat sich gezeigt , poly (I: C) können verschiedene Immunreaktionen in gentechnisch veränderten Mäusen 13,22-24, hervorzurufen , die zusätzliche verwirrende Wirkungen auf die Nachkommen einführen.
In Bezug auf die Anzahl der biologischen Replikaten verwenden wir mindestens 6 Würfe pro Gruppe für Verhaltens- oder physiologische Tests und 3 Würfe pro Gruppe für die Genexpression, Protein oder Immunohistochemistry Ansätze. Wir prüfen alle Nachkommen in einem Wurf anstelle einer oder zwei Nachkommen innerhalb eines Wurfes mit experimentellen Verzerrungen zu vermeiden. Durchschnittlich halten wir auch die Daten für alle Nachkommen in einem Wurf, und verwenden Sie diese als Durchschnitt einen Datenpunkt (so dass n = die Anzahl der Würfe) 13 unangemessenen Statistiken zu vermeiden. Die Daten von jedem Geschlecht werden gepoolt auch , weil keine offensichtliche Unterschied zwischen den Geschlechtern hat sich im MIA - Modell 13 beobachtet worden.
Die Logik hinter Messung MIA Nachkommen von Wurfgröße ist die Variation durch mütterliche Pflege und Fürsorge zu minimieren. Wurfgröße wurde mit Stereotypien Verhalten in C57BL / 6 - Mäuse 25 korreliert. Wir vermuten, dass dies auf die Zuweisung von Ressourcen während der mütterlichen Pflege zurückzuführen sein könnte und fürsorglich. Um diesen verwirrenden Effekt zu vermeiden, unsere Standard gewünschten Wurfgröße ist 6-10 für C57BL / 6-Mäuse.
Auch wenn das Protokoll genau verfolgt, kann der Experimentator enZähler, um eine zu schwache oder zu starke Immunantwort bei schwangeren Mäusen nach Poly (I: C) Injektion. Um dies zu vermeiden, ist es wesentlich, die pyrogene und cytokinogenic Aktivität verschiedener Chargen von Poly (I: C) zu validieren. Verschiedene Reihen und viele Poly (I: C) von der gleichen Firma auf verschiedenen Ebenen der Entzündungsreaktion bei Mäusen führen könnten; auffallend, Injizieren identische Dosen von Poly (I: C) aus unterschiedlichen Chargen führen in bis zu 10 - fache Unterschiede in Plasma IL-6 - Spiegel 26. Die Ermittlung der Dosierung und Charge von Poly (I: C) für weitere MIA Experiment durch das Auslesen von nicht-schwangeren weiblichen IL-6-Messung könnte dazu beitragen, die Variation der Wirkung von MIA Induktion reduzieren.
Wenn es erforderlich ist, um die Dosierung für bestimmte Chargen von poly zu modifizieren (I: C), ist es auch wichtig, die Konzentration des Poly modifizieren (I: C) Herstellung einer Injektionslösung, so dass das injizierte Volumen bleibt in etwa 5 & mgr; l pro Gramm Maus Gewicht. Beispielsweise nach dem manufacturer des Verfahrens, Poly (I: C) wird vermutlich bei ~ 10 mg / ml Wasser rekonstituiert, um eine Polynucleotid in physiologischen Phosphatpufferlösung zu ergeben. Im Vergleich zu unseren 40 mg / ml Lösung, würde die untere Konzentration durch 4 faltet das Injektionsvolumen erhöhen. Bei schwangeren Mäusen könnte ein großes Volumen an Pufferinjektion erhöht potentiell den Druck auf die Embryonen und die Einführung unerwünschter, verwirrende Wirkungen auf die Nachkommen. Daher wählen wir Poly aufzulösen: mit einer höheren Endkonzentration, um (I C) Pulver in 0,09% Natriumchlorid das Injektionsvolumen zu reduzieren.
IL-6 wird gewählt, die Marker der akuten Entzündungsreaktion auf, weil frühere Untersuchungen IL-6 Signalisierung als kritischer Faktor bei der Vermittlung der Wirkungen von MIA auf die Entwicklung des Gehirns und des Verhaltens identifiziert hat. Im Anschluss an Poly (I: C) Behandlung, IL-6 ist die hochregulierte Cytokin in mütterlichem Blut und Plazenta 10,12. Am wichtigsten ist, Smith et al. dass von mehreren gezeigthoch upregulated Cytokine, nur IL-6 zeigte sowohl Notwendigkeit und Angemessenheit für die Induktion von MIA-assoziierten Gehirn und Verhaltensauffälligkeiten. Das heißt, mütterliche Injektion von anti-IL-6 effektiv abnormen Verhaltens - und transkriptomischen Anomalien bei MIA Nachkommen verhindern könnten, während neutralisieren andere Zytokine tat nicht mehr als 10. Außerdem mütterlichen Injektion von rekombinantem IL-6 allein (ohne poly (I: C)) reproduziert MIA-assoziierten Transkriptions und Verhaltens im MIA 12,15 fötalem Gehirn und Nachkommen gesehen Anomalien.
Im Vergleich zu anderen Methoden MIA zu induzieren (beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) oder Influenza), Poly (I: C) ist relativ sicher und bietet eine einfache Möglichkeit , die Intensität der Immunantwort zu kontrollieren. Obwohl die Entzündungsreaktion durch mütterliche Poly ausgelöst (I: C) Verabreichung akute vorübergehende ist, ist seine Wirkung auf die Nachkommen Verhalten und die Entwicklung des Gehirns tief. Insgesamt, wenn die Technik der Induzierung MIA turch Poly (I: C) Injektion bei E12,5 beherrscht wird, kann man dann gehen unterschiedliche Verhaltens- und biologischen Tests auszuführen, um die Wirkung dieser Umweltrisikofaktor auf die Nachkommen zu untersuchen. Zugleich könnte man auch das Verfahren mit genetischen Veränderungen oder anderen Behandlungen kombinieren, vor, während oder nach der Schwangerschaft, die Ursachen und mögliche therapeutische Ansätze zu Autismus und Schizophrenie zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir möchten, dass der verstorbene Dr. Paul H. Patterson für seine Beiträge zum Fortschritt der MIA-Modell zu ehren, Autismus und Schizophrenie-Forschung. Wir erkennen an Sarkis K. Mazmanian für seine große Unterstützung auf diesem Protokoll; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni und Leslie A. Neumann für administrative Unterstützung; Ali Khoshnan und Jan C. Ko für die Unterstützung bei der Verfilmung; Elaine Y. Hsiao und Natalia Malkova für ihre Beratung auf MIA Induktion; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandovals und Natalie A. Verduzco für ihre Fachtierhaltung. Diese Arbeit wurde durch das NIH Conte-Center-Preis (NIH 5P50MH086383-04, Paul H. Patterson) unterstützt; Autismus spricht (# 7670, Paul H. Patterson); Simons Foundation (# 322839, zu Sarkis K. Mazmanian); NIH Ausbildung Grant (NIH / NRSA T32GM07616 K.-HC); Caltech Sommer Wissenschaftliche Fellowship (SURF) (bis ZY); Amgen Scholars Program am California Institute of Technology (zu ZY); und Postdoctoral Fellowship from National Science Council, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, W.-LW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
