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방법 논문

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을

5.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53712

⸱

2016년 3월 28일

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

이 논문에서

요약

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

초록

배아 발달 중 형태 생성 과정의 변경을 제어하는 신호 전달 경로를 해부하려면 강력하고 민감한 메트릭이 필요합니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장은 세로축을 따라 배아가 늘어나는 후기 발달 단계입니다. 이 발달 단계는 피하 세포와 기저 체벽 근육 사이의 세포 간 통신에 의해 제어됩니다. 이러한 신호 전달 메커니즘은 세포골격(cytoskeleton)과 세포-세포 접합부(cell-cell junctions)를 리모델링하여 피하 세포의 형태를 조절합니다. 유충 단계에서 배아 치사율 및 발달 정지를 측정하고 피하 세포와 근육 세포에서 세포 골격 및 세포-세포 접착 구조의 변화를 측정하는 것은 이러한 신호 전달 경로를 해부하기 위해 25년 이상 사용되어 온 고전적인 표현형입니다. 최근의 연구에서는 특히 조기 또는 후기 신장을 목표로 하고 배아의 전후 축을 따라 형태 생성 결함을 특성화하는 새로운 측정 방법의 개발을 필요로 했습니다. 여기에서는 신장 배아의 길이와 너비, 동기화된 유충의 길이를 정확하게 측정할 수 있는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 방법은 신장을 조절하는 유전자를 식별하고, 이러한 유전자가 이 단계의 초기 및 후기 단계를 모두 제어하고 배아의 전후 축을 따라 균등하게 필요한지 여부를 평가하는 데 유용한 도구를 구성합니다.

서론

짧은 라이프 사이클 : 거의 50 년 동안 선충 예쁜 꼬마 선충 개발, 신경 생물학, 진화, 호스트 병원체 상호 작용 등의 중요한 문제를 연구하는 강력한 모델로 자리 매김 한 개발의 연구에서이 모델의 강도에 달려있다 삼일의; 이러한 동물은 유전자 조작 될 수있는 용이성; 대부분 여분의 자궁이다 살아있는 동물과 개발에 세포 변위 및 형태의 관찰을 가능하게 투명성. 선충의 발달 단계는 성인이 다음에 배아 네 애벌레 단계 (L4에 L1)를 포함한다. 배아 발생 동안, 표피 형태 형성 세포는 그들의 접합부를 재구성하는 방법을 그룹으로 마이그레이션 방법 상피의 더 나은 이해를 가능하게하고 개별적인 형태뿐만 아니라 기능적 상피 세포 내에서의 상대 위치를 수정하는 능력에 상당한 관심을 끌었다.표피의 형태 형성은 네 단계로 구분됩니다 지느러미 표피 세포의 구조 조정에 구성된 지느러미 인터에서, 하피라고 함; 따라서 상피 세포 단층의 배아를 감싸는 복부 정중선으로 복부 피하 세포의 이동에 구성된 복부 인클로저; 초기와 후기 신장 벌레 모양의 유충에 콩 모양의 배아를 변환. 다음과 같은 형태 형성, 배아 해치 및 L1 유충은 즉시 환경에서 사용 가능한 박테리아를 사용하여 먹이를 시작합니다.

배아 신장 따라서 배아 발달의 후기이다. 그것은 그것의 길이 방향 축을 따라 배아의 확장과 가로 직경의 감소로 구성되어 있습니다. 이것은 피하 세포의 형상 급격한 변형을 포함한다. 신장은 초기와 후기로 나누어진다. 몸 벽 근육이 w의 1.75 배 단계에서 계약 시작할 때 초기 단계는 쉼표 단계에서 시작 및 종료ILD 형 (중량) 배아 - 비 신장 배아에 비해 길이의 1.75 배입니다 배아에 대응. 그 단계에서 발생하는 형태 형성 공정은 주로 두 배의 안테 - 후방 축에 그들의 연장 운전 피하 세포의 꼭대기에 위치한 극 액틴 필라멘트 다발 FBS ()의 수축에 의해 구동된다. 이물 제거의 수축 세 키나제 LET-502 / ROCK, MRCK-1, PAK-1 (5)에 의해 미오신 라이트 체인의 인산화에 의해 컨트롤입니다. 몸 벽 근육의 기능이되어 계약을 시작할 때 신장의 후기가 시작됩니다. 그것은 지느러미와 복부 피하 세포에 몸 벽 근육에서 mechanotransduction 신호를 포함하고 동물 3 부화 할 때 끝납니다.

및 L1 유충 (애벌레 체포 표현형으로 그 체포 그들의 개발, 신장 결함은 일반적으로 배아로 죽어가는 동물의 비율 (EMB 배아 치사)을 특징으로 레벨a) 및 중량보다 훨씬 짧은 것을. 발달 체포의 단계의 확인은 죽은 태아의 현미경 관찰을 필요로하고 유충 3-6을 체포했다.

그것은 최근에 같은 Cdc42 / 라 세미 레귤레이터 및 이펙터 PIX-1과 박-1, 여러 유전자가, 초기와 후기 신장 3,7 둘 중에 형태 형성 과정을 제어하는 것으로 나타났다. 우리는 또한 최근에 형태 형성 과정 초기 신장 3 ~ 7시 배아의 안테 - 후방 축을 따라 차이가 있음을 보여 주었다. 이러한 연구 결과는 특히 초기 신장 동안 자신의 안테 - 후방 축을 따라 배아의 형태의 특성을 가능하게 일찍 또는 늦게 신장 단계 및 기타 측정을 대상으로 새로운 지표의 개발 동기를 부여.

이러한 새로운 방법은 폭뿐만 아니라 처음부터 초기 신장 끝에 배아의 길이를 측정하는 구성 그광고 및 꼬리. 7 두 프로토콜은 또한 L1 단계 7에서 동기화 새로 부화 유충의 길이를 측정하기 위해 개발되었다.

유충, 성인 및 배양액에 존재하는 세균이 처리에 의해 용해되는 동안 배아 달걀 껍질 알칼리 처리 염소산으로부터 보호. 이러한 처리 후, 잘 공급 성인 (8)의 대부분을 함유하는 비 - 동기화 집단으로부터 배아를 정화하는데 사용된다. 식품 제한은 새로 부화 유충을 동기화하는 데 사용됩니다. 이들 유충의 길이를 측정하는 것은 다음 신장 결함을 검출하기 위해 사용된다. 에서 부화 유충이 아닌 완전히 신장 배아가 공급 될 때 "정상 길이"로 복구 할 수 있지만, 음식이없는 구속 할 때 자신의 소형화를 유지하기 때문에이 측정은 배양 플레이트에 구속 유충의 측정보다 선호된다.

여기서는 르의 측정을 가능 상세한 프로토콜을 제시경과 DIC 현미경과 화상 해석 (1 프로토콜)을 사용하여 배아뿐만 아니라 헤드의 폭과 신장의 꼬리 ngth. 또한 화상 해석 (프로토콜 2) 플로우 세포 계측법 (3 프로토콜)을 사용하여 동기화 된 유충의 길이를 측정하기위한 구체적인 프로토콜을 제공한다.

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프로토콜

WT 및 돌연변이 동물의 초기 신장 결함 1. 특성

  1. Normarski DIC 현미경에 대한 설치 배아
    1. 다음 문화 매체와 재료를 준비합니다 :
      1. M9 버퍼, 용해 12.8 g / L 나 2 HPO 4 • 7H 2 O 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L의 NaCl, 0.25 g / L 황산 증류수와 소독하는 오토 클레이브에서 4 • 7H 2 O.
      2. NGM 판, DDH 2 O 3 g / L의 NaCl 16 g / L의 한천, 2.5 g / L의 bactopeptone을 용해 압력솥과 1 mM의 황산, 1 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 인산 완충액 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤을 추가합니다. 60mm 요리 당 NGM 6 ml에 따르십시오. 매체가 실온에서 24 시간 동안 응고하도록 허용합니다. E.의 포화 문화의 몇 방울을 추가 대장균 OP50 박테리아는 루리아의 국물 (LB)에서 재배. 박테리아가 48 시간 동안 성장, 4 ° C에서 접시를 저장할 수 있습니다.
      3. 웜 파이를 생성하려면CK. 짧은 파스퇴르 피펫에 0.01 "직경 백금선 마운트 벤젠 버너이 말단을 가열하여, 상기 유리 피펫의 선단에 백금 와이어를 고정. 셔블의 정렬을 생성하기 위해 상기 와이어의 선단을 병합.
    2. 20 ° C에서 OP50와 60mm NGM 플레이트에 웜 변형 성장.
      참고 : 열성 대립 유전자는 최대 25.5 ° C에서 비 허용 온도에서 동물을 성장 필요할 수 있습니다. 플레이트는 프로토콜을 추구하기 위해 많은 젊은 성인과 여전히 음식을 많이 포함해야합니다.
    3. 마스킹 테이프 (그림 1A)의 두 층으로 덮여 두 개의 스페이서 슬라이드 사이의 현미경 슬라이드를 놓습니다.
    4. 30 초 동안 전자 레인지에서 가열하여 20 mL의 M9 버퍼 아가 분말 0.6 g을 용해시켜 M9 버퍼의 3 % 아가로 오스 용액 (중량 / 부피)를 준비한다. 용액을 5 분 동안 냉각 할 수 있습니다.
      주 : 아가로 오스 용액을 전자 레인지에서 용융 후 며칠 동안 이용할 수있다. 그것또한 분주 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
    5. 두 개의 스페이서 슬라이드 사이에있는 유리 슬라이드에 뜨거운 3 % 아가로 오스 용액의 방울을 놓는다. 거품을 형성하지 마십시오.
    6. 도 1b에 도시 부드럽게 눌러로 빠르게 다른 슬라이드와 아가로 오스를 다룹니다. 상단 슬라이드 아가로 오스 드롭을 평평하고 마스킹 테이프의 두 층의 두께의 패드를 생성합니다.
    7. 아가로 실온에서 적어도 1 분 동안 또는 배아 패드로 전송 될 준비가 될 때까지 고형화 할 수있다.
    8. 웜 선택을 사용하여, M9 버퍼의 400 μl를 포함하는 마이크로 원심 분리기 튜브에 NGM 플레이트에서 30도 공급 젊은 성인 (20)를 전송할 수 있습니다.
    9. 벌레가 약 5 분 동안 중력에 의해 침전 및 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 선충류와 촬상 박테리아의 최대 값을 제거하는 것을 목적으로한다.
    10. 각 관에 M9 버퍼의 200 μl를 추가합니다.
    11. 파스퇴르 핍 사용두기가이 시계 유리 튜브 (버퍼 선충)의 내용을 전송.
    12. 합니다 (spermatheca과 외음부 사이) 중반 본체 부에서 동물을 잘라 하나 또는 두 개의 25G 5/8 "바늘을 사용합니다.
      주 : 메스 블레이드는 바늘 (들)에 대한 대안으로서 사용될 수있다. 수영 선충에서이 작업을 수행과 연습이 필요할 수 있습니다. 아이디어는 위 또는 다수의 주사 바늘을 사용하는 방법에 따라 나이프로 바늘을 사용하는 것이다. 동물이 절개되면, 자웅 동체는 버퍼에 자신의 배아를 놓습니다.
    13. 액체 내에서 순환 와류의 생성을 통해 시계 접시의 중심에 배아를 집중한다.
    14. 마이크로 피펫을 사용하여 시계 접시에서 M9의 대부분을 제거합니다. 배아와 M9의 약 30 μl를 남겨주세요.
    15. 패드 떨어져 그것을 밀어 아가로 오스 패드 (그림 1B)를 덮고있는 슬라이드를 제거합니다.
    16. (완전히 커버 슬립으로 커버 할 수 있도록하기 위해 면도날 패드 컷그림 1C).
    17. 파스퇴르 피펫을 사용하여, 아가로 오스 패드에 모든 배아 (및 웜의 파편)을 전송합니다.
    18. 그룹을 200㎕ 마이크로 피펫에 사용되는 팁의 선단에 접착 속눈썹을 사용하여 패드의 중심에서 배아.
    19. 천천히 기포 형성을 회피 패드 커버 슬립을 배치하고 밀봉.
      참고 : 여러 물개 사용할 수 있습니다. 우리는 (일반적으로 수채 화법 그림에 대한 껌을 마스크로 사용) 예술과 공예 상점에서 발견 껌을 그리기 사용합니다. 이 친수성과 굳은 합리적으로 빠르고 벌레에 대한 독성이 없기 때문에이 껌이 사용됩니다. 슬라이드는 매니큐어 또는 VALAP (바셀린, 라놀린과 Parafin 왁스로 만들어진 혼합물)로 밀봉 할 수있다.
    20. 약 15 분 동안 그리기 껌 건조를 허용합니다.
  2. 초기 신장 4 개의 차원 Normarski DIC 현미경을 사용하여 촬영
    주 :이 단계의 목적은 후기 연신의 시작 콤마 조기 신장률을 기록 할 것이다- 몸 벽 근육이 수축을 시작할 때 순간으로 정의. 우리는 또한 시간에 하나 이상의 수정란을 기록하고자합니다. 기록 8 시간은 일반적으로 비 - 동기화 된 배아의 초기 그룹 신장률을 기록해야한다.
    1. 현미경의 무대에 탑재 된 슬라이드를 놓습니다. 현미경은 시간 경과 현미경과 Z - 스택의 생성 (자동 Z-플랫폼)을 가능하게 10X 및 60X 목표뿐만 아니라 DIC 렌즈, 프리즘, 카메라와 캡처 소프트웨어가 장착되어 있는지 확인합니다.
      참고 : 온도가 현미경 실 20과 23 °의 C 사이의 일정 있는지 확인합니다. 가열 냉각 챔버 열성 돌연변이를 이용하여, 특히 현미경 스테이지에 요구 될 수있다.
    2. 10 배 목표를 사용하여 사전 형태 형성 단계에서 배아의 그룹을 식별합니다.
    3. 일단 10X 목적을 밀어 슬라이드에 기름 침지 한 방울을 추가, 위치.
    4. 60X 대물 렌즈를 사용하여, 상부 및 (E)의 저부를 식별셋업 mbryos는 Z 스택 촬상 파라미터.
      참고 : 배아의 두께보다 큰 Z - 스택을 설정하는 것을 망설이지 말라. 0.8 μm의로 인접한 두면 사이의 거리를 설정합니다. 이것은 35 내지 50-Z 평면에서 배아의 전체 깊이를 커버 할 수있게 할 것이다.
      참고 : 현미경 자동화 된 XY 플랫폼을 포함하는 경우, 패드의 서로 다른 위치에있는 배아를 동시에 기록 할 수 있습니다. 이렇게하려면, 기록 XY는 실험의 과정에서 분석하고자하는 패드의 각 위치의 좌표. 기록 매개 변수를 설정할 때 XY를 선택하고 표시된대로 프로토콜의 나머지 부분을 수행해야합니다. 녹화 중 배아의 얇은 Z-절편은 반드시이 프로토콜에 설명 된 측정이 필요하지 않습니다. 최대 해상도 중량 및 돌연변이 동물의 배아 발달을 녹화 그러나 추가 분석을 지원할 수 녹음의 라이브러리를 구축하기 위해 좋은 방법입니다.
    5. 세트8 시간 지속이 인수 사이에 2 분 간격으로 시간 경과입니다.
      주 : 노광 시간이 현미경에 설정된 광 강도에 의존 할 것이다. 초기 신장 동안 셀 운동은 매우 느립니다; 노출 시간은 초 이하 당 약 한 프레임이 될 수 있습니다. 배아 초기 형태 형성 단계 (지느러미 인터, 복부 인클로저)에있는 경우, 초기 신장 1 시간 내에 기록 될 것입니다. 확인 광 셔터는 각 획득 사이에 폐쇄된다.
    6. 인수를 실행하고 저장합니다.
  3. 이미지 분석을 이용하여 초기 신장 결함의 측정
    1. 열기 피지 - ImageJ에 소프트웨어 ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji ).
    2. 메뉴에서 / 설정 측정 분석 선택, 경계를 선택합니다. 각각의 배아를 들어,도 2a에 도시 한 바와 같이 태아의 인두에 초점을 Z 스케일 막대를 조절한다. 이것은 배아의 중심에 초점을 맞출 수 있도록합니다.
    3. 배아의 길이를 측정하기 위해 초기 연신 시작시 관심 배아를 갖는 시간 스케일 바를 조정 (쉼표 단계;도 2a 참조). 시간 ( "시간 시작") 참고.
    4. 분할 줄 도구를 선택합니다. 배아 (그림 2A)의 중간 선 아래 꼬리의 끝 부분까지 배아의 입의 끝에서 분할 선을 그립니다. 메뉴 탭 / 측정 분석하여 그린 라인의 길이 ( "길이 시작")을 얻었다 사용.
    5. (근육이 수축을 시작할 때 순간) 초기 신장의 끝에서 동일한 배아이 측정을 반복합니다. ( "시간 - 엔드") 시간을 기록하고 배아 (도 2b) 위에 설명 된 바와 같이 ( "길이 단부")의 길이를 측정한다.
    6. 다음과 같이 초기 단계에서 신장 및 길이의 증가 (L)의 기간 (D)을 계산한다 :
      D = "시간 끝"- "시간 시작"
      & #(160); L = "길이 엔드"- "길이-시작"
    7. 헤드 폭을 측정하기 위해, 관심 (1.2 배 단계 또는 초기 신장의 끝 부분)의 단계에서 배아를 가지고 시간 척도 막대를 조정합니다. 직선 도구를 선택합니다. 머리의 횡단 (배측 - 복부 축) 중간 선을 그립니다. 이 섹션에서는 배아 (그림 2C)의 가장 두꺼운 부분이다. 메뉴가 / 분석 측정하여, 헤드의 폭에 대응하는 라인의 길이를 얻었다.
    8. (도 2C를 장내 밸브 꼬리의 끝 사이의 중간 선) 및 테일 폭을 얻기 위해 그것을 측정 동일 시각에, 꼬리의 횡단 중심선을 묘화하여이 과정을 반복한다.
      참고 : 다른 표현형에서 동일한 단계에서 배아를 비교하는이 측정을 사용합니다. 이 측정의 재현성을 보장하기 쉽게 한 동물에서 인식 할 수있는 동물의 꼬리의 중간 선 주위에있는 위치를 찾을 수 있는지 확인사람 같아.
    9. 꼬리 폭 비율 헤드를 계산하는 꼬리 폭으로 헤드 폭을 나눈다.

늦은 신장 결함의 특성 (2) 이미지 분석을 이용하여

  1. 알칼리성 하이포 아 염소산 치료를 사용하여 L1 애벌레의 동기화
    1. 많은 성인 포란을 함유하는 비 - 고갈 60mm 플레이트에서 M9 완충액 1 ㎖를 파스퇴르 피펫을 이용하여 상기 플레이트 오프 선충 세척하여 마이크로 원심 분리 튜브 내의 모든 웜 모은다.
    2. 퇴적물 선충 상온에서 3 분 동안 3,500 XG에 웜 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거합니다.
    3. 각각의 튜브 (0.4 M 차아 염소산, 0.5 M 수산화 나트륨)에 차아 염소산 용액 1 ㎖를 추가하고 3 분 동안 흔들어.
      참고 : 알칼리 차아 염소산 용액을 새로 제조해야하며,이 솔루션의 배아 부드럽게 교반해야하지만 지속적으로 EMBR의 성인의 용해와 산소를 최적화 할 수YOS. 3 분 교반 한 후, 대부분의 성인은 용액에 알을 해제해야합니다.
    4. 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 이용하여 상층 액을 제거 빨리 상온에서 3 분 동안 3500 × g으로 스핀하고.
    5. 3 분 동안 3,500 XG에서 원심 분리 M9 버퍼 1 ㎖로 4 회 세척 할 것.
    6. 네 번째 세척 후, 계란 (계란이 팁의 플라스틱에 집중하는 것처럼)로 pipetting없이 M9 버퍼 700 μL의 상층 액과에 resuspend 계란을 제거합니다.
    7. 적절한 성장 온도 인큐베이터에 넣고 3 mm 궤도 진탕 기 튜브를 테이프 밤새 600 rpm으로 흔들어.
  2. 동기화 유충의 길이 측정
    1. 원심 분리기는 상온에서 3 분 동안 3,500 XG에서 L1 유충을 체포 뜨는을 제거합니다. M9 버퍼 100 ㎕의 유충을 재현 탁하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 아가로 오스 패드에 그들을 전송 (아가로 오스 패드를 준비해야한다D로 1.1.8에 섹션 1.1.2에서 설명). 패드에 커버 슬립을 놓습니다.
      주 : 패드가 짧은 인수 관련이 실험을 위해 고무로 밀봉 할 필요가 없습니다.
    2. 고해상도 카메라를 사용하는 경우 유충의 길이를 측정하는 10X 대물 렌즈와 위상차 조명을 사용한다. 유충 (도 2D)의 선명한 화상을 몇 밀리 초 내에 이미지를 캡처하고 그 결과 획득 할 수있는 빛의 강도를 증가시킨다.
      참고 : 유충의 수영 삭제 한 사용자가 아가로 오스 패드에 의해 감소​​하는 동안, 그들은 여전히​​ 이동하고 있습니다. 따라서, 고속 기록은 선명한 화상을 얻기 위해 필수적이다.
    3. 피지 - ImageJ에를 열고 단계 1.3.1를 반복합니다. 유충의 길이를 측정하기 위해, 분할 줄 도구를 선택합니다. 유충 (그림 2D, 오른쪽 패널)의 중간 선 아래 꼬리의 끝 부분에 머리까지의 끝에서 분할 선을 그립니다.
    4. 의 길이를 구하는 측정 / 분석 메뉴 사용법마이크로 미터의 유충의 길이에 대응하는 그린 라인.

유동 세포 계측법을 사용하여 늦은 신장 결함 3. 특성

  1. 애벌레 동기화
    1. 잘 자란 젊은 성인의 100 전체 mm 플레이트에서 2.1 절에 설명 된대로 알칼리 차아 염소산 처리를 사용하여 배아를 정화하고 배아 해치 20 또는 25.5 ° C에서 24 시간에 16 M9 버퍼에 L1 체포가 변형에 따라하자 분석 하였다.
      참고 : 변형 당 잘 자란 성인의 한 전체 접시 아래에 설명 된 분석에 충분하다.
  2. 웜 분류기의 교정
    주 : 여기에서 사용되는 사이토 흐름 세포 계측기 (이하 웜 분류기라고 함) 큰 입자 흐름이다. 웜 분류기는 멸종 검출기의 전면에 위치한 670 nm의 적색 다이오드 레이저가 포함되어 있습니다. 웜 분류기는 형광 여기에 대한 여러 줄 아르곤 레이저가 포함되어 있습니다. 의 Standard 장비는 세 광전자 증 튜브 스펙트럼의 녹색, 노란색 및 빨간색 영역에서 형광 방출을 감지하는 데 사용 (PMT) 형광 검출기가있다. 여기에 설명 된 프로토콜에 TOF는 유충의 크기를 측정하는 데 사용되며, 적색 채널 프로피 듐 요오다 이드 (PI)로 염색한다 죽은 벌레를 식별하는 데 사용된다. GP (일반용) 높은 형광 제어 입자가 악기를 교정하는 데 사용하고 실험에서 내부 통제로, 녹색, 노란색, 빨간색으로 높은 형광을 표시합니다. 그들은 녹색 채널에서 검출 높은 발광 분석 시료의 유일한 목적이 될 것이며, 이후 이러한 특성을 기반으로 식별됩니다.
    주 : 살아있는 동물 녹색 및 적색 채널에서뿐만 아니라 TOF에 대한 형광의 유무에 기초하여 식별된다. 유충의 장에서 Autofluorescent 방출 L1 단계에서 검출되지 않습니다.
    1. 레이저 블록, 컴퓨터, 압축기의 온 스위치웜 분류기 악기를 거라고. 기기의 사용 설명서에 표시된 열린 웜 분류기 소프트웨어의 START 버튼을 누릅니다.
    2. 아르곤 레이저 제어 팝업 창을 관찰한다. RUN 모드를 선택하고 레이저 힘은 10 ± 1 mW에 도달으로 기다립니다. 레이저 제어 창에서 완료를 선택합니다.
    3. 시스 각각 5.10 ± 0.02 및 5.51 ± 0.01 시료 압력을 설정합니다. 압력이 최소 15 분 동안 평형 압력 OK 체크 박스를 클릭 할 수 있습니다.
      주 : 유량 시스 샘플 압력에 의존한다.
    4. 샘플 컵과 분석 챔버 사이의 유동 채널 세관에있는 모든 거품을 제거해야합니다. 이렇게하려면 ACQUIRE를 클릭하고 (인수 창에서 볼 수 있듯이) 더 거품이 획득되지 않을 때까지 부드럽게 가느 다란 관을 가볍게.
    5. 형광 및 TOF 측정 및 검출 다음의 모든 매개 변수의 설정 :
      1. TOF, 내선, 녹색, 노란색 및 빨간색에 대한 스케일을 설정녹색과 노란색과 빨간색 900 700에서 1. 설정 PMT 제어 표에 설명 된대로 256 세트 이득.
        주 : 두 여기 필터 (488 내지 514 ㎚) 가능하고 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 여러 아르곤 레이저와 이러한 파장에서 여기 된 임의의 형광체를 여기 시키는데 사용될 수있다. 적절한 필터 장치의 필터 챔버 내에 삽입 될 필요가있다. 우리는 다음과 같은 실험을 위해 488 nm의 필터를 사용했다.
    6. 웜 정렬을 교정하려면 도구 메뉴에서 "실행 제어 입자"를 선택합니다. 컵에 1 배 GP (일반용) 높은 형광 제어 입자의 20 ㎖를 (이 입자가 악기를 교정하기 위해 세포 계측법 제조업체에서 판매 정확한 크기의 형광 물질이다) 넣습니다.
    7. 외장 및 샘플 흐름을 시작 ACQUIRE 버튼을 클릭합니다.
      참고 : 21 ± 6과 AC 제어의 입도 분포에 관한 평균 기대그 평균 (CV) ≤11 주위에 변화의 oefficient. 이력서는> (11)이며, 평균은 깨끗한 버튼을 여러 번 클릭하거나 유동 채널을 쓸어 넘겨 세관 청소> (27) 시도하는 경우.
  3. 동물 TOF의 취득
    참고 목적은 레이저 소스 및 흡광 검출기의 플로우 셀에서 통과 할 때 빛을 산란시킨다. 이 광 걸리는 시간은 대상물의 축 방향 길이를 측정하는 데 사용되는 비행 물체 (비행 시간 TOF)에 의해 산란된다. 오브젝트 (멸종 EXT)에 의해 마스크되는 빛의 범위는 불투명도 / 광학 밀도의 척도로서 사용된다.
    1. 동기화 야생형의 10 μl를 배치 ​​(중량) L1 시계 유리 및 해부 현미경을 사용하여 죽은 계란의 비율을 추정한다.
      참고 : 중량에 높은 EMB (이상 20 %)를 표시 동기화 L1은 추가 분석을 위해 사용해서는 안됩니다.
    2. 전송이 미세 원심에서 L1 동기화 (approximately 15 ML 원뿔 튜브에 L1을 포함하는 M9의 700 μL). 10 μg의 / ㎖ (희석 1 ㎎ / ㎖ 원액으로부터 1/100 번째)의 최종 농도로 요오드화 프로피 디움 (PI)을 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
      참고 : 죽은 계란과 애벌레 PI를 사용하여 염색 빨강 채널을 사용하여 높은 형광 물체로 감지됩니다.
    3. 스테인드 인구를 희석 M9 버퍼의 10 ML을 추가합니다. 희석 인구 5 mL를 취하여 M9 15 mL로 추가하여 네 번 희석한다. 샘플 컵이 희석을 놓습니다.
    4. 클릭의 ACQUIRE하여 샘플 흐름을 실행하고 유량을 관찰합니다.
      주 : 정확한 측정을 위해, 유량 / 초 15 ~ 25 개체를 유지한다.
    5. 필요하다면, 소정 유량에 도달하기 위해 컵에 동물의 양을 조정한다.
      참고 : 유량 뜻은 3.2.3와 애벌레 난의 농도에 나타낸 바와 같이, 일정한 압력 (외피와 샘플)에 따라 달라집니다n은 컵. 유량이 25 이상이면 개체 / 초 컵 일부 버퍼를 추가한다. 그것은 미만 15 개체 / 초는 컵 (단계 3.3.3에서) 농축 L1을 추가 할 경우.
    6. 대상의 적절한 농도에 도달하면, 컵의 부피를 평가 높은 형광 GP 제어 입자 4X 용액이 용적의 1/4 번째의 추가.
    7. 게이팅 및 정렬 매개 변수를 조정합니다. 이렇게하려면 메뉴에서 '게이팅'을 클​​릭하고 'TOF 대'를 선택 와 '녹색'. 메뉴에서 '정렬'을 클릭하고 'TOF 대'와 '레드'를 선택합니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이, 게이팅 및 정렬 그래픽은 나타날 것이다.
      참고 :이 (녹색과 적색의 발광)를 제어 입자의 시각화를 허용, PI 거품으로 얼룩진 죽은 동물 (발광 녹색 빨강 및되지 않음) 사는 동물 (녹색이나 붉은 어느 채널에서 더 배출) (그림 3A ).
    8. ACQ을 클릭하여 실험을 실행UIRE.
      참고 : 약 10,000 개체, 그래서 약 8,000 동물, 애벌레 사이의 작은 크기의 차이를 식별 분석합니다. 실험을 중지하고 STORE를 클릭하여이 .txt 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  4. 동기화 인구의 생활 동물의 상대 크기 측정
    1. 대용량 데이터 테이블을 관리 할 수​​ 소프트웨어를 사용하여 .txt 파일을 엽니 다.
    2. 분석 된 객체 (100)보다 높은 임의 단위 녹색 채널에 발광을 특징으로 조정 입자와 관련된 TOF 값 추출물 (이 값은, 섹션 3.2.5에 설정된 파라미터들에 의존한다). 새 열을 생성하고 통제 입자 '이라고 부른다. '샘플'라는 제어 입자를 제외한 다른 모든 개체를 포함하는 열을 만듭니다. 참고 : 새 입자 배치 요구의 형광 방출은 인수를 시작하기 전에 확인해야합니다. 이것의 식별을 가능하게하는 형광 임계 값을 설정한다L1s 제어 입자.
    3. 각 분석 균주 유량 (인해 예컨대 계란의 플러그의 존재)가 변경 한 실험의 부분을 식별한다. 이렇게하려면 :
      1. 시간의 인자 (도 3B)와 같은 각각의 샘플에 대해 '조정 입자'의 TOF 플롯.
      2. 추세선 도구를 사용하여 선형 추세선을 그리고 차트에서 식을 표시합니다.
        주 : 조정 입자의 TOF 시간 이상 일정하게한다 (수평 라인,도 3B). 데이터 Y = AX + B에 그려진 선형 추세선의 방정식을 고려하여, 'A'값이 낮은 것을 10-4 있는지 확인하십시오. 제어 입자의 배향 파열 표시 시간 구간 내에서 모든 측정 분석에서 제거되어야한다.
    4. 보다 낮은 10과 높은 TOF 죽은 태아와 거품 (빨간색에서 방출 이상 15)과 작은 파편과 큰 계란 플러그 (제거어)는 각각 70보다 '샘플'측정에서.
    5. 분석 된 각 변형에 대한 통제 입자 '분포를 플롯. 도 3c에서 보는 바와 같이 이러한 분포는 거의 완벽 오버레이한다. 이것은 다른 균주 수득 TOF 측정을 비교할 수있는 것을 보장한다. 주 : 샘플 조정 입자의 분포가 제어 된 샘플의 것과 중첩되지 않는 경우도 조정 입자를 사용할 수있다 위에 TOF 샘플 소자 정규화. 다음으로 정규화 TOF가 계산된다 :
      1. 중량이 제어 샘플입니다 유전자형 G = (G에 대한 샘플 TOF) / (G 평균 통제 입자 'TOF) × (평균 통제 입자'중량에 대한 TOF)에 대한 TOF를 정상화.
    6. 동물 중량 우리의 경우 (그림 3D)에서, 제어 샘플을 포함하여 각 변형에 대한 애벌레 TOF 분포를 플롯. (각각의 집단에 대한 평균, 평균 (SEM)의 표준 오차를 측정 도 5A와 B).

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결과

헤드폰, Tail- 및 헤드 / 테일 폭 비율은 강력한 지표입니다.

여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 조절기와의 Rho GTP 아제 PIX-1의 이펙터 기능, 박-1 특성화 렛 502 초 신장 7 동안 사용되어왔다. 구아닌 교환 인자 PIX-1 각각 박 -1- 코드 (GEF)과 RHO-1 7 이펙터에 대한 라 세미 / Cdc42 GTP 아제에 대한 구체적이고 할 수-502 코드 ...

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토론

이 프로토콜은 초기 특성화하는 새로운 메트릭 및 배아 신장의 후반 단계에 대해 설명합니다.

섹션 1에서 중요한 단계는 패드 박테리아의 잠재적 인 존재이다. 배아는 밀봉 패드와 이미지 수집시 커버 슬립 사이에 동봉되어 있습니다. 슬라이드를 씰링하는 두 시간 이상 지속 취득 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 필요하다. 우리의 지식, 슬라이드와 커버 슬립 사이의 아가로 오스 패드를 장착하는 데 사용되는 실러의 아무도는 통기성 없습니다. 박테리아 (또는 배아) 다량의 패드 상에 존재하는 경우에 결과적으로, 그들은 그들의 조기 사망에 이르는 몇 시간 후, 산소를 박탈 할 수있다. 3 배 배아를 갖는 - 비 신장 배아에 비해 길이가 3 배입니다 배아에 해당하는 - 잠재적 인 저산소 조건의 좋은 지표가 될 것이다 관심의 배아와 함께 기록, 그 배아가 파묻혀 이동을 중지하기 때문에산소가없는 상태에서의 R 달걀 껍질. 어떤 형태 학적 측정은 저산소 조건 또는 죽은 배아에서 수행 될 수 없습니...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)와 캐나다 혁신 재단의 보조금으로 지원되었습니다. let-502 (sb118ts) 균주에 대해 Paul Mains 박사 (캐나다 캘거리 대학교)에게 감사드립니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천 BioShopAGR001.500
아가로스BioshopAGA001.500
CaCl2 (염화칼슘)Bio Basic Inc.CT1330
콜레스테롤시그마-알드리치C8667
세척 용액 union Biometrica300-5072-000
유리 커버슬립Fisherbrand12-542B
유리 슬라이드Fisherbrand12-552-3
고형광 제어 입자union Biometrica310-5071-001
K2HPO4(인산칼륨, 이염기성)Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4(인산칼륨, 일염기성)Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4(황산마그네슘)Sigma-aldrich230391
Na2HPO4(인산나트륨, 이염기성)Bio Basic Inc.
NaCl (염화나트륨)Bio Basic Inc.DB0483
Pebeo 드로잉 껌 45  mlpé bé o모든 예술/공예품 매장PDG033000
PeptoneBioShopPEP403.500
Sheath bufferunion Biometrica300-5070-100
COPAS Biosortunion Biometrica
SDB0487

참고문헌

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