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Neuroscience

उपन्यास मेट्रिक्स निमेटोड के भ्रूण बढ़ाव विशेषताएँ Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53712
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

Introduction

अपने छोटे से जीवन चक्र: लगभग 50 वर्षों के लिए विकास, तंत्रिका जीव विज्ञान, विकास, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, आदि में महत्वपूर्ण प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में खुद को स्थापित निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस 1 विकास के अध्ययन में इस मॉडल की शक्ति में निहित है 3 दिन के; कितनी आसानी से इन पशुओं को आनुवंशिक रूप से परिवर्तित किया जा सकता है; इसकी पारदर्शिता कि रहने वाले जानवरों और इसके विकास ज्यादातर अतिरिक्त गर्भाशय है कि सेल में विस्थापन और आकृति विज्ञान के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है। निमेटोड के विकास के चरणों embryogenesis और चार लार्वा चरणों (L4 को एल 1), वयस्कता के द्वारा पीछा शामिल है। भ्रूण विकास के दौरान, एपिडर्मल morphogenesis कैसे उपकला कोशिकाओं एक समूह है, कैसे वे अपने जंक्शनों पुनर्निर्माण के रूप में पलायन का एक बेहतर समझ प्रदान करने और उनके व्यक्तिगत आकृति विज्ञान के साथ ही एक कार्यात्मक उपकला भीतर उनके रिश्तेदार स्थिति को संशोधित करने की क्षमता के लिए काफी ध्यान आकर्षित किया।एपिडर्मल morphogenesis चार चरणों में बांटा गया है: पृष्ठीय पृष्ठीय epidermal कोशिकाओं के पुनर्गठन में मिलकर मध्यनिवेश, हाइपोडर्मिस के रूप में भेजा; उदर बाड़े, उदर midline इस प्रकार एक उपकला सेल monolayer में भ्रूण encasing की ओर उदर hypodermal कोशिकाओं के प्रवास में मिलकर; जल्दी और देर बढ़ाव कीड़ा के रूप लार्वा में सेम के आकार भ्रूण बदलने। बाद morphogenesis, भ्रूण हैच और एल 1 लार्वा उनके तत्काल वातावरण में उपलब्ध बैक्टीरिया का उपयोग खिला शुरू करते हैं।

भ्रूण बढ़ाव इसलिए भ्रूण के विकास के लिए एक देर चरण है। यह अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ भ्रूण के विस्तार और इसके अनुप्रस्थ व्यास की कमी के होते हैं। इस hypodermal कोशिकाओं के आकार का एक नाटकीय संशोधन शामिल है। बढ़ाव एक जल्दी और देर चरण में बांटा गया है। प्रारंभिक चरण अल्पविराम स्तर पर शुरू होता है और समाप्त होता है जब शरीर दीवार की मांसपेशियों w में 1.75 गुना के स्तर पर करार शुरूआईएलडी प्रकार (डब्ल्यूटी) भ्रूण - भ्रूण है कि गैर-लम्बी भ्रूण की तुलना में लंबाई में 1.75 गुना कर रहे हैं करने के लिए इसी। Morphogenic प्रक्रियाओं है कि मंच पर होने वाली मुख्य रूप से filamentous actin बंडलों (एफबीएस) hypodermal कोशिकाओं के शिखर ध्रुव पर स्थित है कि भ्रूण 2 की Antero पीछे अक्ष के साथ उनकी बढ़ाव ड्राइव के संकुचन द्वारा संचालित कर रहे हैं। FBS के संकुचन तीन kinases लश्कर-502 / रॉक, MRCK -1 और पाक-1 5 से मायोसिन- प्रकाश चेन के फोस्फोराइलेशन द्वारा नियंत्रण है। बढ़ाव की देर चरण शुरू होता है, जब शरीर दीवार की मांसपेशियों कार्यात्मक हो जाते हैं और करार शुरू करते हैं। यह पृष्ठीय और उदर hypodermal कोशिकाओं को शरीर दीवार की मांसपेशियों से mechanotransduction संकेतन शामिल है और समाप्त होता है जब जानवरों पक्षियों के बच्चे 3।

और उन एल 1 लार्वा (लारवल गिरफ्तारी phenotype के रूप में उनके विकास को गिरफ्तार करने; बढ़ाव दोष आम तौर पर भ्रूण के रूप में मरने पशुओं का प्रतिशत (EMB भ्रूण मारक); की विशेषता है एल.वी.क) और गुम्मट की तुलना में काफी कम किया जा रहा। विकासात्मक गिरफ्तारी के मंच की पहचान मृत भ्रूण का सूक्ष्म अवलोकन की आवश्यकता है और लार्वा 3-6 गिरफ्तार कर लिया।

हाल ही में यह दिखाया गया था कि इस तरह के Cdc42 / आरएसी नियामक और प्रेरक PIX -1 और पाक-1, के रूप में कई जीन, दोनों जल्दी और देर बढ़ाव 3,7 दौरान morphogenic प्रक्रियाओं को नियंत्रित। हम यह भी हाल ही में पता चला है कि morphogenic प्रक्रियाओं जल्दी बढ़ाव 3 से 7 के दौरान भ्रूण के Antero पीछे अक्ष के साथ भिन्न होते हैं। इन निष्कर्षों उपन्यास मेट्रिक्स विशेष रूप से जल्दी या देर से बढ़ाव चरणों और अन्य मैट्रिक्स जल्दी बढ़ाव के दौरान उनके Antero पीछे अक्ष के साथ भ्रूण की आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन के लिए सक्षम करने को निशाना बनाने का विकास प्रेरित किया।

ये उपन्यास तरीकों उनकी की चौड़ाई के साथ ही शुरुआत में जल्दी और बढ़ाव के अंत में भ्रूण की लंबाई मापने में मिलकर बनता है वहविज्ञापन और पूंछ। 7 दो प्रोटोकॉल भी नव रची लार्वा की लंबाई, एल 1 चरण 7 पर सिंक्रनाइज़ को मापने के लिए विकसित किए गए।

भ्रूण की अनावश्यक कार्य क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार के खिलाफ उनकी रक्षा करते हुए लार्वा, वयस्कों और संस्कृति मीडिया में मौजूद बैक्टीरिया उपचार से भंग कर रहे हैं। इस इलाज तो एक गैर सिंक्रनाइज़ आबादी अच्छी तरह से खिलाया वयस्कों 8 के बहुमत से युक्त से भ्रूण को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है। खाद्य प्रतिबंध नव रची लार्वा सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। मापने इन लार्वा की लंबाई तो बढ़ाव दोष का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह माप संस्कृति प्लेटों पर गिरफ्तार किया गया लार्वा की माप से अधिक पसंद है क्योंकि लार्वा कि पक्षियों के बच्चे से पूरी तरह से गैर-लम्बी भ्रूण जब खिला "सामान्य लंबाई" के लिए ठीक हो सकता है लेकिन जब भोजन के अभाव में गिरफ्तार उनके कम आकार को बनाए रखने जाएगा।

यहाँ, हम le की माप को सक्षम करने विस्तृत प्रोटोकॉल पेशभ्रूण के साथ ही उनके सिर की चौड़ाई और पूंछ समय चूक डीआईसी माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण (1 प्रोटोकॉल) का उपयोग elongating के ngth। हम यह भी सिंक्रनाइज़ लार्वा छवि विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2) और प्रवाह Cytometry (प्रोटोकॉल 3) का उपयोग करने की लंबाई को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

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Protocol

1. WT और उत्परिवर्ती पशुओं के प्रारंभिक दिनों में बढ़ाव दोष की विशेषता

  1. Normarski डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते भ्रूण
    1. निम्नलिखित संस्कृति मीडिया और सामग्री तैयार:
      1. M9 बफर, भंग 12.8 छ / एल ना 2 HPO 4 • 7H 2 हे, 3 जी / एल एच 2 पीओ 4, 5 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड, 0.25 छ / एल MgSO 4 • 7H 2 आसुत जल और बाँझ आटोक्लेव में हे।
      2. एन जी एम प्लेटें, DDH 2 ओ में 3 जी / एल सोडियम क्लोराइड, 16 जी / एल अग्रवाल, 2.5 ग्राम / एल bactopeptone भंग आटोक्लेव और 1 मिमी MgSO 4, 1 मिमी CaCl 2, 1 मिमी फॉस्फेट बफर और 5 माइक्रोग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल जोड़ें। 60 मिमी व्यंजन प्रति एन जी एम के 6 मिलीलीटर डालो। मध्यम कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए जमना करने की अनुमति दें। ई की एक संतृप्त संस्कृति की कुछ बूँदें जोड़ें कोलाई बैक्टीरिया OP50 Luria शोरबा (पौंड) में वृद्धि हुई है। बैक्टीरिया 48 घंटे के लिए आगे बढ़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान करते हैं।
      3. कीड़ा गड़बड़ी उत्पन्न करने के लिएसी.के., एक छोटी पाश्चर विंदुक पर एक 0.01 "व्यास प्लैटिनम तार माउंट। एक बेंजीन बर्नर के साथ इस सिरा गर्म करके कांच pipet की छोर तक प्लैटिनम तार जकड़ना। तार का सिरा समतल फावड़ा का एक तरह से उत्पन्न करने के लिए।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर OP50 के साथ 60 मिमी एन जी एम प्लेटों पर कीड़ा तनाव बढ़ता है।
      नोट: थर्मल alleles अप करने के लिए 25.5 डिग्री सेल्सियस पर गैर अनुमोदक तापमान पर जानवरों से बढ़ आवश्यकता हो सकती है। प्लेट्स आदेश प्रोटोकॉल का पीछा करने में कई युवा वयस्कों और अभी भी भोजन का सेवन शामिल करना चाहिए।
    3. मास्किंग टेप (चित्रा 1 ए) की दो परतों द्वारा कवर दो स्पेसर स्लाइड्स के बीच एक खुर्दबीन स्लाइड रखें।
    4. 30 सेकंड के दौरान माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा 20 मिलीलीटर M9 बफर में agarose पाउडर के 0.6 ग्राम भंग करके M9 बफर में एक 3% agarose समाधान (वजन / मात्रा) तैयार करें। समाधान 5 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें।
      नोट: agarose समाधान एक माइक्रोवेव में पिघलने के बाद कुछ दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहयह भी aliquoted और हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    5. कांच दो स्पेसर के रूप में स्लाइड के बीच स्थित स्लाइड पर गर्म 3% agarose समाधान की एक बूंद रखें। बुलबुले के गठन से बचें।
    6. तेजी के रूप में चित्रा 1 बी में दिखाया गया है और धीरे नीचे प्रेस एक और स्लाइड के साथ agarose कवर। शीर्ष स्लाइड agarose ड्रॉप समतल और मास्किंग टेप की दो परतों की मोटाई के साथ एक पैड उत्पन्न होगा।
    7. agarose कमरे के तापमान पर कम से कम 1 मिनट के लिए या जब तक भ्रूण पैड करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए तैयार हैं जमना करने की अनुमति दें।
    8. एक कीड़ा लेने का उपयोग करना, M9 बफर के 400 μl युक्त एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में एन जी एम प्लेट से 30 अच्छी तरह से तंग आ चुके युवा वयस्कों के लिए 20 हस्तांतरण।
    9. कीड़े लगभग 5 मिनट के लिए गंभीरता से तलछट और एक micropipette का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला दूर करने के लिए अनुमति दें। यह कदम उठाया नेमाटोड के साथ बैक्टीरिया की अधिकतम दूर करने के लिए करना है।
    10. प्रत्येक ट्यूब M9 बफर के 200 μl जोड़ें।
    11. एक पाश्चर रंज का उपयोगकैसेट, एक घड़ी कांच के लिए ट्यूब (बफर और नेमाटोड) की सामग्री हस्तांतरण।
    12. मध्य शरीर धारा (spermatheca और योनी के बीच) में जानवरों कटौती करने के लिए एक या दो 25G 5/8 "सुई का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: एक स्केलपेल ब्लेड भी सुई (एस) के एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तैराकी नेमाटोड पर इस करते हैं और कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। विचार कैंची के रूप में या एक चाकू के आधार पर कितने सुइयों का इस्तेमाल किया जाता है के रूप में सुई का उपयोग करने के लिए है। एक बार जानवरों खुले में कटौती कर रहे हैं, hermaphrodites बफर में उनके भ्रूण जारी।
    13. तरल के भीतर एक परिपत्र भंवर की पीढ़ी के माध्यम से घड़ी का शीशा के केंद्र में भ्रूण ध्यान लगाओ।
    14. एक micropipette का उपयोग घड़ी का शीशा से M9 के सबसे निकालें। भ्रूण के साथ M9 के लगभग 30 μl छोड़ दें।
    15. यह पैड बंद फिसलने से agarose पैड (चित्रा 1 बी) को कवर स्लाइड निकालें।
    16. आदेश में एक धार के साथ पैड कट पूरी तरह से एक coverslip के साथ इसे कवर करने में सक्षम हो सकता है (चित्रा 1 सी)।
    17. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, agarose पैड पर सभी भ्रूण (और कीड़ा मलबे) हस्तांतरण।
    18. समूह पैड एक बरौनी 200 μl micropipettes के लिए इस्तेमाल एक टिप के छोर पर चिपके का उपयोग कर के केंद्र में भ्रूण।
    19. धीरे-धीरे पैड बुलबुला गठन से बचने पर एक coverslip जगह है और इसे सील।
      नोट: कई sealers इस्तेमाल किया जा सकता है। हम गम कला और शिल्प की दुकानों में पाया (आमतौर पर Aquarelle पेंटिंग के लिए गम मास्किंग के रूप में प्रयोग किया जाता) ड्राइंग का उपयोग करें। क्योंकि यह काफी तेजी से हाइड्रोफिलिक है और solidifies और कीड़े के लिए विषाक्त नहीं है यह गम प्रयोग किया जाता है। स्लाइड भी नेल पॉलिश या VALAP (वैसलीन, लानौलिन और Parafin मोम से बना मिश्रण) के साथ सील किया जा सकता है।
    20. लगभग 15 मिनट के लिए ड्राइंग गम सूखे की अनुमति दें।
  2. रिकॉर्डिंग का उपयोग अर्ली बढ़ाव चार आयामी Normarski डीआईसी माइक्रोस्कोपी
    नोट: इस कदम का उद्देश्य देर बढ़ाव की शुरुआत करने के लिए अल्पविराम से जल्दी बढ़ाव रिकॉर्ड करने के लिए है- जब शरीर दीवार की मांसपेशियों को करार शुरू पल के रूप में परिभाषित किया। हम यह भी समय में एक से अधिक भ्रूण रिकॉर्ड करने के लिए लक्ष्य। रिकॉर्डिंग के आठ घंटे आमतौर पर गैर सिंक्रनाइज़ भ्रूण के एक समूह के लिए जल्दी बढ़ाव रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक हैं।
    1. एक खुर्दबीन के मंच पर मुहिम शुरू की स्लाइड रखें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप 10X 60X और उद्देश्यों के साथ-साथ डीआईसी लेंस, चश्मे, कैमरा और कब्जा सॉफ्टवेयर समय चूक माइक्रोस्कोपी और जेड के ढेर की पीढ़ी (स्वचालित जेड मंच) के अनुरुप बनाने के साथ सुसज्जित है।
      नोट: यह सुनिश्चित तापमान माइक्रोस्कोपी कमरे में 20 और 23 डिग्री सेल्सियस के बीच स्थिर है। एक हीटिंग-शीतलन कक्ष खुर्दबीन मंच पर आवश्यक हो सकता है, खासकर जब थर्मल म्यूटेंट का उपयोग कर।
    2. पूर्व morphogenesis चरणों 10x उद्देश्य का उपयोग में भ्रूण के एक समूह को पहचानें।
    3. एक बार यात्रा के दौरान, 10X उद्देश्य बंद स्लाइड और स्लाइड पर तेल विसर्जन की एक बूंद जोड़ें।
    4. 60x उद्देश्य का उपयोग करना, शीर्ष और ई के नीचे की पहचानसेटअप करने के लिए mbryos Z ढेर इमेजिंग मापदंडों।
      नोट: Z ढेर भ्रूण की मोटाई से बड़ा सेट करने के लिए संकोच न करें। 0.8 माइक्रोन के रूप में दो आसन्न विमानों के बीच की दूरी निर्धारित करें। यह 35 से 50 जेड योजनाओं में भ्रूण की कुल गहराई को कवर करने के लिए सक्षम हो जाएगा।
      नोट: माइक्रोस्कोप एक स्वचालित XY मंच में शामिल है, तो पैड के विभिन्न स्थानों पर स्थित भ्रूण एक साथ दर्ज किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, रिकॉर्ड XY पैड आप प्रयोग के दौरान विश्लेषण करना चाहते हैं पर प्रत्येक स्थान का समन्वय करता है। जब रिकॉर्डिंग पैरामीटर सेटिंग XY का चयन करें और संकेत के रूप में प्रोटोकॉल के बाकी का पालन सुनिश्चित करें। पतला रिकॉर्डिंग के दौरान भ्रूण के जेड सेक्शनिंग जरूरी माप इस प्रोटोकॉल में विस्तृत के लिए आवश्यक नहीं है। अधिकतम संकल्प के साथ WT और उत्परिवर्ती जानवरों के भ्रूण के विकास रिकॉर्डिंग हालांकि आदेश रिकॉर्डिंग अतिरिक्त विश्लेषण समर्थन करने में सक्षम की एक पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है।
    5. सेटऊपर 8 घंटे तक चलने वाले दो अधिग्रहण के बीच 2 मिनट के अंतराल के साथ समय व्यतीत।
      नोट: जोखिम समय प्रकाश की तीव्रता माइक्रोस्कोप के लिए सेट पर निर्भर करेगा। जल्दी बढ़ाव के दौरान सेल आंदोलन बहुत धीमी गति से होता है; जोखिम-समय प्रति सेकंड या उससे कम लगभग एक फ्रेम हो सकता है। भ्रूण के शुरुआती चरणों morphogenesis (पृष्ठीय मध्यनिवेश, उदर बाड़े) पर कर रहे हैं, जल्दी बढ़ाव 1 घंटा के भीतर दर्ज किया जाएगा। सुनिश्चित करें कि प्रकाश शटर प्रत्येक अधिग्रहण के बीच बंद कर दिया है।
    6. अधिग्रहण चलाने के लिए और इसे बचाने के लिए।
  3. छवि विश्लेषण का उपयोग अर्ली बढ़ाव दोष का मापन
    1. ओपन फिजी-ImageJ सॉफ्टवेयर ( v1.48o - http://fiji.sc/Fiji )।
    2. मेनू में विश्लेषण / सेट माप का चयन करें, परिधि का चयन करें। प्रत्येक भ्रूण के लिए, के रूप में चित्रा 2A में दिखाया भ्रूण के ग्रसनी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए जेड पैमाने पर पट्टी को समायोजित। इससे यह सुनिश्चित होगा कि आप भ्रूण के केंद्र पर ध्यान केंद्रित। भ्रूण की लंबाई मापने के लिए, जल्दी बढ़ाव के शुरू में ब्याज की भ्रूण है करने के लिए समय के पैमाने पट्टी को समायोजित (अल्पविराम चरण, चित्रा 2A)। नोट समय ( "समय-शुरुआत")।
    3. खंडों लाइन उपकरण चुनें। भ्रूण (2A चित्रा) के midline के बाद अपनी पूंछ की नोक पर निर्भर भ्रूण के मुंह की नोक से एक खंडों लाइन ड्रा। का उपयोग कर मेनू टैब विश्लेषण / उपाय, खींची गई रेखा की लंबाई ( "लंबाई शुरुआत") प्राप्त करते हैं।
    4. जल्दी बढ़ाव के अंत में एक ही भ्रूण के लिए इस माप दोहराएँ (पल जब मांसपेशियों को ठेका शुरू)। नोट समय ( "समय के अंत") और भ्रूण ( "लंबाई के अंत") के रूप में ऊपर (चित्रा 2 बी) विस्तृत की लंबाई को मापने।
    5. इस प्रकार के रूप में इस चरण के दौरान जल्दी बढ़ाव और लंबाई वृद्धि (एल) की अवधि (डी) की गणना:
      डी = "समय के अंत" - "टाइम-शुरुआत"
      & #160; एल = "लंबाई के अंत" - "लंबाई शुरुआत"
    6. सिर चौड़ाई को मापने के लिए, ब्याज (1.2 गुना मंच या जल्दी बढ़ाव के अंत) के स्तर पर एक भ्रूण है करने के लिए समय के पैमाने बार समायोजित करें। सीधे-पंक्ति उपकरण का चयन करें। सिर के आड़ा (dorso उदर अक्ष) midline ड्रा। यह खंड भ्रूण (चित्रा -2) की बड़ी से बड़ी हिस्सा है। मेनू विश्लेषण / उपाय का प्रयोग, रेखा सिर चौड़ाई के लिए इसी की लंबाई प्राप्त करते हैं।
    7. एक ही समय बिंदु पर, पूंछ के आड़ा midline ड्राइंग द्वारा इस चरण को दोहराएँ (आंतों वाल्व और पूंछ की नोक के बीच मध्य लाइन, चित्रा -2) और पूंछ चौड़ाई प्राप्त करने के लिए यह उपाय।
      नोट: अलग phenotypes भर में एक ही चरण में भ्रूण तुलना करने के लिए इस माप का प्रयोग करें। इस माप के reproducibility सुनिश्चित करने, पशु की पूंछ की मध्य रेखा है कि आसानी से एक से एक पशु से पहचाना जा सकता है के आसपास स्थित एक स्थान खोजने के लिए सुनिश्चित करेंNother।
    8. पूंछ चौड़ाई के अनुपात में सिर की गणना करने के लिए, पूंछ चौड़ाई से सिर चौड़ाई विभाजित।

2. देर बढ़ाव दोष की विशेषता छवि विश्लेषण का उपयोग

  1. एल 1 लार्वा के तुल्यकालन क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार का उपयोग कर
    1. एक गैर की कमी से जूझ 60 मिमी कई सगर्भा वयस्कों युक्त थाली से, M9 बफर के 1 मिलीलीटर एक पाश्चर विंदुक का उपयोग के साथ थाली से दूर नेमाटोड धोने से एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी कीड़े इकट्ठा।
    2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3,500 XG पर और कीड़ा गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला एक micropipette का उपयोग हटाने तलछट नेमाटोड।
    3. प्रत्येक ट्यूब (0.4 मीटर हाइपोक्लोराइट, 0.5 एम NaOH) को हाइपोक्लोराइट समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए हिला।
      नोट: क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए और इस समाधान में भ्रूण धीरे उत्तेजित किया जाना चाहिए, लेकिन लगातार embr के वयस्कों के विघटन और ऑक्सीजन अनुकूलन करने के लिएyos। बाद 3 मिनट के आंदोलन, ज्यादातर वयस्कों के समाधान में अपने अंडे को रिहा कर देना चाहिए।
    4. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3,500 XG पर स्पिन और जल्दी से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला एक micropipette का उपयोग कर हटा दें।
    5. 3 मिनट के लिए 3,500 XG पर centrifugation द्वारा पीछा M9 बफर के 1 मिलीलीटर के साथ चार बार धोएं।
    6. चौथे धोने के बाद, अंडे (अंडे टिप के प्लास्टिक के लिए रहना होगा के रूप में) ऊपर pipetting बिना M9 बफर के 700 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend अंडे को हटा दें।
    7. एक 3 मिमी कक्षीय उचित विकास के तापमान पर एक इनक्यूबेटर में रखा प्रकार के बरतन पर ट्यूब टेप और रात में 600 rpm पर हिला।
  2. सिंक्रनाइज़ लार्वा की लंबाई माप
    1. अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3,500 XG पर एल 1 लार्वा को गिरफ्तार कर लिया और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। M9 बफर के 100 μl में लार्वा Resuspend और उन्हें एक agarose पैड एक पाश्चर विंदुक का उपयोग पर स्थानांतरित (agarose पैड तैयार किया जाना चाहिएडी के रूप में 1.1.8 धारा 1.1.2 में वर्णित)। पैड पर एक coverslip रखें।
      नोट: इस प्रयोग पैड है कि कम अधिग्रहण शामिल है के लिए गम के साथ सील करने की आवश्यकता नहीं है।
    2. अगर एक उच्च संकल्प कैमरा प्रयोग किया जाता है लार्वा की लंबाई मापने के लिए एक 10X उद्देश्य और चरण विपरीत रोशनी का प्रयोग करें। कुछ मिसे के भीतर छवियों पर कब्जा करने और फलस्वरूप प्राप्त लार्वा (चित्रा 2 डी) की एक स्पष्ट तस्वीर में सक्षम होना करने के लिए प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि।
      नोट: लार्वा की तैराकी trashes agarose पैड से कम कर रहे हैं, वे अभी भी बढ़ रहे हैं। इसलिए, तेजी से रिकॉर्डिंग एक साफ छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
    3. फिजी-ImageJ खोलें और कदम 1.3.1 दोहराएँ। लार्वा की लंबाई मापने के लिए, खंडों लाइन उपकरण का चयन करें। लार्वा (चित्रा 2 डी, सही पैनल) के midline निम्नलिखित पूंछ की टिप करने के लिए सिर को ऊपर की नोक से एक खंडों लाइन ड्रा।
    4. मेनू का उपयोग विश्लेषण / उपाय, की लंबाई प्राप्तखींची गई रेखा माइक्रोमीटर में लार्वा की लंबाई के लिए इसी।

3. देर बढ़ाव दोष की विशेषता से फ्लो का प्रयोग

  1. सिंक्रनाइज़ लार्वा
    1. अच्छी तरह से खिलाया युवा वयस्कों के पूर्ण 100 मिमी प्लेट से धारा 2.1 में वर्णित के रूप में क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार का उपयोग भ्रूण शुद्ध और भ्रूण हैच और एल 1 20 या 25.5 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा के लिए 16 के लिए M9 बफर में गिरफ्तारी तनाव के आधार पर करते हैं विश्लेषण किया।
      नोट: तनाव प्रति अच्छी तरह से खिलाया वयस्कों में से एक पूरी थाली के विश्लेषण के नीचे वर्णित के लिए पर्याप्त है।
  2. कृमि सॉर्टर की कैलिब्रेशन
    नोट: प्रवाह यहां इस्तेमाल कोशिकामापी एक बड़े कण प्रवाह कोशिकामापी (इसके बाद कीड़ा सॉर्टर के रूप में) है। कीड़ा सॉर्टर एक 670 एनएम लाल डायोड लेजर, जो एक विलुप्त होने डिटेक्टर के सामने स्थित है। कीड़ा सॉर्टर भी फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए एक बहु-लाइन आर्गन लेजर शामिल हैं। रोंtandard वाद्ययंत्र तीन photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम के हरे, पीले, लाल और क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया डिटेक्टरों की है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, TOF लार्वा के आकार को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, लाल चैनल मृत कीड़े कि Propidium आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग हो जाएगा की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। जीपी (सामान्य प्रयोजन) उच्च प्रतिदीप्ति नियंत्रण कणों साधन जांचना करने के लिए इस्तेमाल किया है और हमारे प्रयोग में एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में, हरे, पीले और लाल रंग में उच्च प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करते हैं। वे नमूना उच्च उत्सर्जन ग्रीन चैनल में पता चला के साथ विश्लेषण में केवल वस्तुओं होगा और बाद में इस विशेषता के आधार पर पहचान की जाएगी।
    नोट: रहने वाले जानवरों ग्रीन और रेड चैनल में के रूप में अच्छी तरह से TOF पर प्रतिदीप्ति के अभाव के आधार पर पहचाने जाते हैं। लार्वा के पेट से autofluorescent उत्सर्जन एल 1 चरण में पता लगाने योग्य नहीं है।
    1. लेजर ब्लॉक, कंप्यूटर, कंप्रेसर एक पर स्विचकीड़ा सॉर्टर साधन घ। के रूप में साधन की अनुदेश पुस्तिका में संकेत खोला कीड़ा सॉर्टर सॉफ्टवेयर पर शुरू बटन दबाएँ।
    2. आर्गन लेजर नियंत्रण पॉप-अप विंडो का निरीक्षण करें। चलाने मोड का चयन करें और इंतजार के रूप में लेजर शक्तियों 10 ± 1 मेगावाट तक पहुँचने। लेजर नियंत्रण खिड़की पर किया चयन करें।
    3. म्यान और 5.10 ± 0.02 और 5.51 ± 0.01 क्रमशः के लिए नमूना दबावों सेट करें। दबाव कम से कम 15 मिनट के लिए संतुलित और दबाव ठीक चेक बॉक्स क्लिक करने के लिए अनुमति दें।
      नोट: प्रवाह दर म्यान और नमूना के दबाव पर निर्भर करता है।
    4. नमूना कप और विश्लेषण कक्ष के बीच प्रवाह चैनल नलिकाओं में मौजूद सभी बुलबुले को खत्म करने के लिए सुनिश्चित करें। ऐसा करने के लिए, अधिग्रहण क्लिक करें और धीरे छोटी नली झटका तक कोई बुलबुला अर्जित कर रहे हैं (जैसा कि अधिग्रहण खिड़की में देखा)।
    5. फ्लोरोसेंट और TOF माप और पता लगाने के रूप में इस प्रकार के लिए सभी मापदंडों का सेटअप:
      1. TOF, एक्सटेंशन, हरे, पीले और लाल रंग के लिए तराजू सेट256 सेट लाभ के लिए हरे और पीले और लाल के लिए 900 के लिए तालिका में वर्णित के रूप में 700 से कम 1। सेट पीएमटी नियंत्रण।
        नोट: दो उत्तेजना फिल्टर उपलब्ध (488 एनएम और 514 एनएम) कर रहे हैं और या तो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) या बहु आर्गन लेजर के साथ इन तरंग दैर्ध्य पर उत्साहित किसी भी fluorochromes उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उपयुक्त फिल्टर उपकरणों की फिल्टर कक्ष में डाला जा करने की जरूरत है। हम निम्नलिखित प्रयोग के लिए 488 एनएम फिल्टर का इस्तेमाल किया।
    6. कीड़ा सॉर्टर जांचना, "चलाने के नियंत्रण कणों" उपकरण मेनू में चयन करें। 1x जीपी (सामान्य प्रयोजन) कप में उच्च प्रतिदीप्ति नियंत्रण कणों के 20 मिलीलीटर (इन कणों सटीक आकार के फ्लोरोसेंट कणों, cytometry निर्माता द्वारा बेचा उनके साधन जांचना करने के लिए कर रहे हैं) रखो।
    7. म्यान और नमूना प्रवाह शुरू प्राप्त करने के लिए बटन पर क्लिक करें।
      नोट: 21 ± 6 और एसी नियंत्रण कण वितरण से संबंधित एक मतलब अपेक्षामतलब (सीवी) ≤11 आसपास भिन्नता के oefficient। सीवी> 11 है और इसका मतलब है> 27 स्वच्छ बटन पर कई बार क्लिक करके या प्रवाह चैनल flicking द्वारा नलिकाओं साफ करने की कोशिश करते हैं।
  3. पशु TOF का अधिग्रहण
    नोट: प्रकाश scatters एक वस्तु लेजर स्रोत और विलुप्त होने डिटेक्टर के बीच प्रवाह सेल में गुजरता है। समय यह प्रकाश के लिए लेता फ्लाइंग ऑब्जेक्ट (उड़ान के समय, TOF) वस्तु का अक्षीय लंबाई मापने के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा तितर-बितर करने के लिए। वस्तु (विलुप्त होने, EXT) द्वारा नकाबपोश प्रकाश की हद तक अपनी अस्पष्टता / ऑप्टिकल घनत्व के एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है।
    1. सिंक्रनाइज़ जंगली प्रकार के 10 μl की जगह (डब्ल्यूटी) एल 1 एक घड़ी गिलास में और एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग मृत अंडे का प्रतिशत का अनुमान है।
      नोट: सिंक्रनाइज़ एल 1 गुम्मट में उच्च Emb (अधिक से अधिक 20%) प्रदर्शित आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
    2. स्थानांतरण microcentrifuge से सिंक्रनाइज़ एल 1 (एकpproximately एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब M9 एल 1 से युक्त के 700 μl)। 10 माइक्रोग्राम / एमएल (कमजोर पड़ने एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से 1/100 वें) की एक अंतिम एकाग्रता में propidium आयोडाइड (पीआई) जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: मृत अंडे और लार्वा पीआई का उपयोग दाग हो जाएगा और लाल चैनल का उपयोग अत्यधिक फ्लोरोसेंट वस्तुओं के रूप में पता चला।
    3. M9 बफर के 10 मिलीलीटर दाग आबादी को कमजोर करने के लिए जोड़ें। पतला आबादी के 5 मिलीलीटर ले लो और उन्हें M9 के 15 मिलीलीटर जोड़कर चार गुना पतला। नमूना कप में यह कमजोर पड़ने रखें।
    4. क्लिक अधिग्रहण से नमूना प्रवाह चलाने के लिए और प्रवाह की दर निरीक्षण करते हैं।
      नोट: आदेश में सही माप करने के लिए, प्रवाह की दर 15 और 25 के बीच वस्तुओं रहना चाहिए / सेक।
    5. यदि आवश्यक हो, वांछित प्रवाह की दर तक पहुंचने के लिए कप में जानवरों की राशि को समायोजित।
      नोट: प्रवाह दर होगी दबावों (म्यान और नमूना) के रूप में है कि लगातार 3.2.3 में और लार्वा मैं की एकाग्रता पर संकेत कर रहे हैं पर निर्भर करता हैn कप। प्रवाह की दर की तुलना में अधिक 25 वस्तुओं है / सेकंड कप में कुछ बफर जोड़ें। यदि यह तुलना में कम 15 वस्तुओं / सेकंड कप में (कदम 3.3.3 से) केंद्रित एल 1 जोड़ना है।
    6. एक बार वस्तु की उचित एकाग्रता तक पहुँच जाता है, कप में मात्रा का मूल्यांकन करने और उच्च फ्लोरोसेंट जीपी नियंत्रण कणों 4x समाधान में इस मात्रा का 1/4 वें जोड़ें।
    7. gating और छँटाई पैरामीटर समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, 'गेटिंग' मेनू पर क्लिक करें और 'TOF बनाम' और 'ग्रीन'। मेनू पर 'छंटनी' पर क्लिक करें और 'TOF बनाम' और 'लाल'। तो गेटिंग और छँटाई ग्राफिक्स के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया दिखाई देगा।
      नोट: यह (हरे और लाल रंग में उत्सर्जन) नियंत्रण कणों के दृश्य की अनुमति होगी, (ग्रीन लाल रंग में नहीं है और उत्सर्जन) पीआई और बुलबुले से सना हुआ मृत जानवरों और रहने वाले जानवरों (न ग्रीन और न ही लाल चैनलों में कोई उत्सर्जन) (चित्रा 3 ए )।
    8. ACQ क्लिक करके प्रयोग भागोUire।
      नोट:, करीब 10,000 वस्तुओं, इसलिए लगभग 8,000 जानवरों लार्वा के बीच छोटे आकार मतभेद की पहचान विश्लेषण करने के लिए। प्रयोग बंद करें और दुकान पर क्लिक करके .txt प्रारूप के रूप में डेटा निर्यात।
  4. के सिंक्रनाइज़ आबादी में रहने वाले जानवरों के सापेक्ष आकार मापन
    1. एक सॉफ्टवेयर बड़े डेटा तालिकाओं का प्रबंधन करने में सक्षम का उपयोग कर .txt फ़ाइल खोलें।
    2. से विश्लेषण वस्तुओं नियंत्रण कणों कि 100 मनमाना इकाइयों की तुलना में अधिक ग्रीन चैनल में उत्सर्जन की विशेषता है के साथ जुड़े TOF मूल्यों को निकालने (इस मूल्य मापदंडों के खंड 3.2.5 में सेट पर निर्भर करता है)। एक नया स्तंभ बनाएँ और इसे 'नियंत्रण कणों' कहते हैं। एक स्तंभ नियंत्रण कणों 'नमूना' कहा जाता है को छोड़कर अन्य सभी वस्तुओं से युक्त बनाएँ। नोट: नए कण बैच की जरूरत है की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अधिग्रहण शुरू करने से पहले सत्यापित किया जाना है। इस फ्लोरोसेंट सीमा की पहचान के लिए सक्षम करने की स्थापना की जाएगीL1s पर नियंत्रण कणों।
    3. प्रत्येक विश्लेषण किया तनाव के लिए प्रयोग में जहां प्रवाह की दर बदल दिया गया है (उदाहरण के लिए अंडे की एक प्लग की उपस्थिति के कारण) के हिस्से की पहचान। ऐसा करने के लिए:
      1. समय का एक पहलू (चित्रा 3 बी) के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए 'नियंत्रण' कणों की TOF प्लॉट।
      2. रेखीय ट्रेंडलाइन ट्रेंडलाइन उपकरण का उपयोग ड्रा और चार्ट पर समीकरण प्रदर्शित करते हैं।
        नोट: कंट्रोल कणों की TOF समय के साथ लगातार होना चाहिए (क्षैतिज रेखा, चित्रा 3 बी)। रेखीय ट्रेंडलाइन डेटा y = कुल्हाड़ी + बी पर तैयार की समीकरण को देखते हुए, यह सुनिश्चित करें कि 'ए' मूल्य कम है कि 10 -4 है। नियंत्रण कण के संरेखण में एक टूटना प्रदर्शित समय वर्गों के भीतर किए गए सभी मापन के विश्लेषण से हटाया जाना चाहिए।
    4. मृत भ्रूण और बुलबुले (लाल रंग में उत्सर्जन में 15 से अधिक है) के रूप में अच्छी तरह से छोटे मलबे और बड़ा अंडा प्लग (निकालें TOF से कम 10 और उच्च70 क्रमशः से ईआर) 'नमूना' माप से।
    5. प्रत्येक तनाव का विश्लेषण के लिए 'नियंत्रण' कणों वितरण प्लॉट। जैसा कि चित्र -3 सी में देखा इन वितरण लगभग पूरी तरह से उपरिशायी चाहिए। यह है कि विभिन्न प्रकारों के लिए प्राप्त TOF माप तुलना में किया जा सकता है। नोट: TOF पर अगर एक नमूने में नियंत्रण कणों का वितरण नियंत्रण के नमूनों की है कि से मढ़ना नहीं है नियंत्रण कणों इस्तेमाल किया जा सकता नमूना तत्वों को सामान्य बनाने। सामान्यीकृत TOF गणना कर रहे हैं के रूप में पीछा:
      1. जीनोटाइप जी = (जी के लिए नमूना TOF) / (औसत 'नियंत्रण कण' जी के लिए TOF) एक्स (औसत 'नियंत्रण कण' गुम्मट के लिए TOF) जहां गुम्मट नियंत्रण नमूना है के लिए TOF मानक के अनुसार।
    6. नियंत्रण नमूना सहित प्रत्येक तनाव के लिए लार्वा TOF वितरण साजिश, जानवरों के गुम्मट हमारे मामले (चित्रा 3 डी) में। प्रत्येक आबादी के लिए मतलब है और मतलब (SEM) के मानक त्रुटि उपाय ( बी)।

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Representative Results

सिर, Tail- और सिर / पूंछ-चौड़ाई का अनुपात मजबूत मीट्रिक हैं।

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सफलतापूर्वक नियामकों और रो GTPases PIX-1 के प्रभावोत्पादक के समारोह में, पाक-1 विशेषताएँ और जल्दी बढ़ाव 7 के दौरान जाने-502 के लिए इस्तेमाल किया गया है। PIX -1 और क्रमश: पाक -1 कोड एक गुआनिन-विनिमय कारक के लिए (जीईएफ) और एक प्रेरक आरएसी / Cdc42 GTPases के लिए विशिष्ट और रो-1 से 7 के लिए एक प्रेरक के लिए जाने-502 कोड। इस अध्ययन में, PIX -1 और पाक-1 जल्दी बढ़ाव के दौरान 7 एपिडर्मल morphogenesis नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है। मेट्रिक्स के रूप में इस अध्ययन में इस्तेमाल किया सिर और पूंछ चौड़ाई माप पहली बार के लिए प्रदर्शन, कि hypodermal पूर्वकाल EMB में स्थित कोशिकाओंरियो इसके पीछे 7 में स्थित उन से अलग morphogenic कार्यक्रमों का पालन करें। Reproducibility और इन मेट्रिक्स की मजबूती की स्थापना करने के लिए, सिर चौड़ाई स्वतंत्र रूप से 1.2 गुना के स्तर पर 12 प्रकार के जंगली (डब्ल्यूटी) भ्रूण पर पांच बार मापा गया था। सुझाव है कि एक समूह के लिए माप; माप के पाँच विभिन्न समूहों के बीच प्रसरण की तुलना में थे तो ब्राउन Forsythe टेस्ट (आर सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग) के मापन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर (चित्रा -4 ए एफ पी परीक्षण मूल्य> 0.5) का उपयोग मूल्यांकन खुलासा भ्रूण की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। इन मापों के साथ जुड़े reproducibility और बैच प्रभाव का आकलन 4D डीआईसी तीन अलग-अलग दिन (एन = 12 भ्रूण) पर किया इमेजिंग से 1.2 गुना के स्तर पर गुम्मट भ्रूण के सिर चौड़ाई की माप के माध्यम से किया गया था। इन तीनों माप समूहों के उस पार, विचरण काफी अलग नहीं था और कोई महत्वपूर्ण प्रभाव बैच सिर-W प्रभावित करने के लिए पाए गएidth माप परिणाम (एफ परीक्षण पी -value> 0.5, चित्रा 4 बी)।

इसी तरह के परिणाम पूंछ चौड़ाई माप के लिए और जल्दी बढ़ाव के विभिन्न चरणों में किया मापन के लिए प्राप्त किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। ये आंकड़े मजबूत मैट्रिक्स जल्दी बढ़ाव दोषों को चिह्नित करने के रूप में सिर-चौड़ाई, पूंछ-चौड़ाई और सिर / पूंछ चौड़ाई का अनुपात की स्थापना की।

मापने सिर और पूंछ चौड़ाई के साथ ही भ्रूण की लंबाई भ्रूण की Antero पीछे अक्ष के साथ प्रारंभिक बढ़ाव को नियंत्रित जीन की विशेषता के लिए अनुमति देता है।

भ्रूण की लंबाई, साथ ही उनके सिर और पूंछ की चौड़ाई की माप ले जाने WT और उत्परिवर्ती भ्रूण पर किया गया था अशक्त या थर्मल जल्दी बढ़ाव को नियंत्रित करने के लिए जीन मजबूत समारोह alleles घाटे की: PIX-1 (gk416);पाक-1 (ok448) और दो-502 (sb118ts) 7। हम सिर / पूंछ (एच / टी) शुरुआत में WT और उत्परिवर्ती भ्रूण की चौड़ाई का अनुपात (1.2 गुना चरण) मापा जाता है और गैर-अनुमोदक तापमान पर जल्दी बढ़ाव के अंत में (चित्रा 4C छोड़ दिया और क्रमश: सही पैनल)। जबकि जल्दी बढ़ाव की शुरुआत में वहाँ कोई change- या एक कम एच था / टी अनुपात PIX-1 में मनाया गया, पाक -1 और जाने-502 म्यूटेंट जब गुम्मट जानवरों (1.2 गुना चरण, चित्रा -2, बाएं पैनल की तुलना चित्रा 4C; सही पैनल)), जल्दी बढ़ाव के अंत में सभी तीन म्यूटेंट गुम्मट भ्रूण की तुलना में काफी अधिक एच / टी अनुपात (टी पी -Test -values ​​<0.006 दिखाया। यह दिखा दिया है कि PIX-1, पाक -1 और जाने-502 उत्परिवर्ती भ्रूण जल्दी बढ़ाव के अंत में असामान्य Antero पीछे आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। आगे के विश्लेषण से सिर चौड़ाई की तुलना और पूंछ betwee चौड़ाईn 1.2 गुना मंच और जल्दी बढ़ाव के अंत में, एक ही माप मानकों का उपयोग कर कि सिर चौड़ाई कम PIX-1 में कम हो जाता है, पाक -1 और जाने-502 म्यूटेंट जबकि पूंछ चौड़ाई let-502 म्यूटेंट में काफी कम कम कर देता है का पता चला केवल 7। यह है कि जाने-502 नियंत्रण morphogenic प्रक्रियाओं, भ्रूण के Antero पीछे अक्ष के साथ इसी तरह का पता चला है, जबकि PIX -1 और पाक-1 नियंत्रण morphogenic प्रक्रियाओं भ्रूण 7 के पूर्वकाल भाग में मुख्य रूप से होने वाली। जल्दी बढ़ाव (चित्रा 4D) की शुरुआत बनाम अंत में भ्रूण के बीच की लंबाई का अंतर भी मापा गया था। हमने पाया है कि जल्दी बढ़ाव काफी PIX -1 और पाक-1 म्यूटेंट में पूर्वकाल morphogenesis की है कि परिवर्तन का सुझाव गुम्मट के लिए, PIX-1 में कम हो गया था पाक-1 और जाने-502 म्यूटेंट जब तुलना में अकेले काफी elongatio कम करने के लिए पर्याप्त हैभ्रूण के एन।

प्रोटोकॉल 2 और 3 WT और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में गिरफ्तार किया गया लार्वा की लंबाई का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। (; अप्रकाशित डेटा प्रोटोकॉल 3) इन लार्वा की लंबाई दोनों छवि विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2) 7 और प्रवाह cytometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। लार्वा लंबाई का माप एक मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ढंग (चित्रा 5 ए) में माइक्रोमीटर में 'जानवरों की लंबाई का पूर्ण माप में छवि विश्लेषण परिणामों का उपयोग। इस विश्लेषण से पता चला है कि सिंक्रनाइज़ उत्परिवर्ती लार्वा प्रदर्शन काफी कम लंबाई जब गुम्मट (चित्रा 5 ए) की तुलना में 7। इन प्रवाह cytometry आधारित प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 3) का उपयोग लार्वा का मापन तुलनीय परिणाम (चित्रा 5 ब) दे दी है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लार्वा की बड़ी संख्या के बाद दृष्टिकोण का उपयोग करके मापा काफी जीनोटाइप तुलना (टी के सांख्यिकीय मजबूती वृद्धि हुई - परीक्षण पी -values ​​<10 -24)। इन निष्कर्षों के आधार पर, प्रवाह cytometry दृष्टिकोण बहुत सूक्ष्म बढ़ाव दोष प्रदर्शित उत्परिवर्ती पशुओं को चिह्नित करने में छवि विश्लेषण पर एक बेहतर विकल्प हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. एक agarose पैड की तैयारी। ए, माइक्रोस्कोप स्लाइड दो स्पेसर के रूप में स्लाइड मास्किंग टेप। बी की दो परतों द्वारा कवर के बीच रखा, agarose पैड दो स्पेसर के रूप में स्लाइड के द्वारा समर्थित एक और स्लाइड के साथ कवर किया जाता है। सी, अंतिम आकार और agarose पैड के आकार के साथ काटने के बाद एक रेजर ब्लेड coverslip फिट करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

g2.jpg "/>
। चित्रा 2. जल्दी और देर से बढ़ाव दोष का माप एक - बी, अल्पविराम मंच (ए) में एक भ्रूण की लंबाई की और जल्दी बढ़ाव (बी) के अंत में मापन। लाल रेखा, भ्रूण को मापने के लिए इस्तेमाल किया 1.2 गुना चरण (बाएं) पर और जल्दी बढ़ाव (दाएं) के अंत में ImageJ। सी, सिर और पूंछ चौड़ाई के खंडों लाइन उपकरण भ्रूण में मापा जाता है का उपयोग कर तैयार किया गया था। तीर मापा क्षेत्रों के स्थानीयकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं (मार्टिन एट अल से संशोधित।, 2014)। स्केल पट्टी:। 20 माइक्रोन डी, लार्वा की लंबाई सिंक्रनाइज़ एल 1-लार्वा के लिए मापा जाता है। राइट पैनल कब्जा कर लिया छवि (बाएं) के एक बढ़े हुए दृश्य है। लाल रेखा ImageJ के खंडों लाइन उपकरण का उपयोग कर तैयार किया गया था। यह लार्वा की लंबाई मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। स्केल पट्टी:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. सिंक्रनाइज़ लार्वा की लंबाई की माप प्रवाह cytometry। ए, गेटिंग और हरे और नियंत्रण कणों का उत्सर्जन लाल दिखा Copas Biosort की छँटाई खिड़की का प्रयोग, बुलबुले, मृत और अपने समय की उड़ान के लिए सम्मान के साथ जानवरों के रहने वाले (TOF )। बी, एक प्रतिनिधि प्रयोग के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर नियंत्रण कणों की TOF। समय बनाम TOF के रैखिक समारोह की ढलान लगभग 10 -5, सी, वितरण के लिए अधिक से अधिक मूल्य का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त नियंत्रण कण TOFs का वितरण है। यह दर्शाता है कि नियंत्रण कणों की TOF प्रयोग भर में समय के साथ स्थिर है। गैर सामान्यीकृत और सामान्यीकृत नियंत्रण कण वितरण के लिए प्रतिनिधित्व कर रहे हैं पाक-1 (ok448)। अन्य वितरण सामान्यीकृत नहीं हैं। डी, जीने के लिए TOFs का वितरणजानवरों के वितरण के लिए अधिक से अधिक मूल्य का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। TOFs पाक-1 (ok448) को छोड़कर नियंत्रण कणों पर सामान्यीकृत संकेत के रूप में नहीं कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. PIX-1, पाक -1 और दो-502 म्यूटेंट वर्तमान प्रारंभिक बढ़ाव दोष। एक - बी, reproducibility और मजबूती सिर के आकलन माप चौड़ाई एक, 1.2 गुना मंच (एन = 12 भ्रूण) पर गुम्मट भ्रूण के लिए सिर चौड़ाई के पांच स्वतंत्र माप।। इसका मतलब है और मानक विचलन (त्रुटि सलाखों) संकेत कर रहे हैं। गैर महत्वपूर्ण (एनएस) मापन के बीच मतभेद ब्राउन Forsythe परीक्षण का उपयोग कर गणना कर रहे थे हमें (आईएनजी आर सांख्यिकीय पैकेज) (एफ परीक्षण पी मूल्य> 0.5)। बी, तीन अलग-अलग दिन (एन = 12 भ्रूण पर गुम्मट भ्रूण के लिए सिर चौड़ाई माप)। इसका मतलब है और मानक विचलन के रूप में अच्छी तरह से संकेत कर रहे हैं; वहाँ माप भर में विचरण में कोई महत्वपूर्ण अंतर था (एनएस; ब्राउन Forsythe एफ परीक्षण पी मूल्य> 0.5) सी, सिर / पूंछ चौड़ाई का अनुपात का वितरण 1.2 गुना चरण (बाएं पैनल), जल्दी के अंत में। गुम्मट में बढ़ाव (सही पैनल), PIX-1 (gk416), पाक-1 (ok448) और दो-502 (sb118ts), 23 पर म्यूटेंट - 24 डिग्री सेल्सियस। ध्यान दें कि चलो-502ts इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल भ्रूण की माताओं में 25.5 डिग्री सेल्सियस। डी, गुम्मट में बढ़ाव, PIX-1 (gk416), पाक-1 (ok448) के वितरण बड़े हो रहे थे और दो-502 (sb118ts) के बीच म्यूटेंट अल्पविराम मंच और देर बढ़ाव की शुरुआत। बॉक्स-भूखंडों न्यूनतम, अधिकतम, 25 वें, 50 वें (औसत) और 75 का प्रतिनिधित्वआबादी का वें शतमक। * टी -Test पी -value <0.05, ** टी -Test पी -value <0.006 (मार्टिन एट अल से संशोधित।, 2014)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. PIX-1 (gk416), पाक-1 (ok448) और एल एट-502 (sb118ts) लार्वा वर्तमान लंबाई दोष। ए, लार्वा की लंबाई गुम्मट में मापा जाता है, PIX-1 (gk416), पाक-1 (ok448) और दो-502 (sb118ts) पशु छवि विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2)। बी, सापेक्ष लार्वा लंबाई प्रवाह कोशिकामापी का उपयोग करके मापा (का उपयोग करके मापा प्रोटोकॉल 3)। कोष्ठक में नंबर वीं के लिए प्रयुक्त जानवर की संख्या के अनुरूपई माप। लंबाई और मतलब की मानक त्रुटि के साधन (SEM; त्रुटि सलाखों) प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। पी मूल्यों -Test छात्र टी संकेत कर रहे हैं (पी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल जल्दी को चिह्नित करने के उपन्यास मैट्रिक्स और भ्रूण बढ़ाव की देर चरणों का वर्णन है।

धारा 1 में महत्वपूर्ण कदम पैड पर बैक्टीरिया की संभावित उपस्थिति है। भ्रूण भली भांति बंद करके पैड और छवि अधिग्रहण के दौरान coverslip के बीच संलग्न हैं। स्लाइड सील अधिग्रहण है कि दो घंटे से अधिक समय तक रहता है के दौरान पशुओं के सुखाना से बचने के लिए आवश्यक है। हमारे ज्ञान करने के लिए, स्लाइड और coverslip के बीच agarose पैड माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया sealers में से कोई भी हवा-प्रवेश के योग्य हैं। इसके परिणामस्वरूप, जब बैक्टीरिया (या भ्रूण) की एक बड़ी राशि पैड पर मौजूद है, वे ऑक्सीजन की उनकी समय से पहले मौत के लिए अग्रणी कुछ घंटों के बाद वंचित किया जा सकता। तीन गुना भ्रूण होने - भ्रूण है कि गैर-लम्बी भ्रूण की तुलना में लंबाई में 3 गुना कर रहे हैं करने के लिए इसी - हित के भ्रूण के साथ दर्ज की संभावित कमी वाली स्थिति का एक अच्छा संकेत हो सकता है, के बाद से उन भ्रूण उनके व्यापार में आगे बढ़ बंद हो जाएगाऑक्सीजन के अभाव में आर अनावश्यक कार्य। कोई रूपात्मक माप की कमी वाली स्थिति पर या मृत भ्रूण पर किया जाना चाहिए।

एक और महत्वपूर्ण कदम जब समय चूक इमेजिंग का उपयोग पर जो भ्रूण के विकास होता है तापमान है। थर्मल म्यूटेंट वर्तमान में सी में इस्तेमाल कर रहे हैं एलिगेंस। तापमान पारी की जैविक प्रभाव तत्काल हो या प्रोटीन के आधे जीवन और उत्परिवर्तन अपनी किया जाता है की प्रकृति के आधार पर देरी हो सकती है। नतीजतन, जिस पर तापमान भ्रूण सामने आ रहा है समय के साथ लगातार होना चाहिए और माइक्रोस्कोपी कमरे या खुर्दबीन मंच पर एक हीटिंग-शीतलन कक्ष के उचित वेंटीलेशन के द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए।

धारा 2 क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार का उपयोग लार्वा तुल्यकालन पर निर्भर है। कुछ परिस्थितियों में, इस इलाज भ्रूण मारक (EMB) को जन्म दे सकता है। गुम्मट जनसंख्या में 20% से ऊपर EMB हाइपोक्लोराइट इलाज के दौरान एक ऊंचा विषाक्तता का सुझावजाहिर है कि नकारात्मक morphogenesis प्रभाव हो सकता है। सिंक्रनाइज़ गुम्मट पृष्ठभूमि में उच्च Emb प्रदर्शित एल 1 आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। यह प्रतिबंध भी प्रोटोकॉल 3 पर लागू होता है।

हम लार्वा स्थिर करने के लिए संवेदनाहारी दवाओं के इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है। Levamisol विशेष रूप से, लार्वा प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह शुरू हटना करने के लिए जाता है कि मांसपेशियों Tetany की प्रेरण के माध्यम से निमेटोड immobilizes। अगर जोखिम समय माइक्रोस्कोप की सीमाओं का एक परिणाम के रूप में जल्दी पर्याप्त नहीं है, हम पैड में agarose की एकाग्रता बढ़ती है और पैड और coverslip के बीच तरल की मात्रा को कम करने से लार्वा की गतिशीलता को कम करने की सिफारिश। जॉब हालांकि लिया जाना चाहिए, लार्वा सूखना करने के लिए नहीं है, क्योंकि सुखाना उनके आकार कम हो जाएगा।

धारा 3 में, लार्वा की लंबाई की माप का विश्लेषण किया नमूनों के बीच प्रवाह की दर की तुलना में इस्तेमाल किया। ऐसा करने के लिए, नियंत्रण कणों का वितरण कंपनियों की जरूरत हैलाल। वितरण के लिए पूरी तरह से ओवरले हैं, TOF (समय की उड़ान) इसी नमूने के लिए प्राप्त मूल्यों की तुलना की जा सकती है यदि नहीं, तो इन मूल्यों सामान्यीकृत किए जाने की जरूरत है। नियंत्रण कणों-TOF से अधिक नमूना-TOF को सामान्य बनाने (के रूप में 3.4.5.1 में विस्तृत) सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के रूप में पाक-1 (ok448) (चित्रा 3 सी और चित्रा 5 ब) के लिए दिखाया गया है। WT बनाम पाक-1 (ok448) के सापेक्ष लंबाई के साथ या सामान्य बनाने के बिना कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों में समान होना पाया गया (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि, हम अनुशंसा करते हैं, इसके बिना प्राप्त उन लोगों के साथ सामान्य बनाने के साथ प्राप्त परिणामों की पुष्टि, खासकर जब छोटे आकार मतभेदों के साथ लार्वा की तुलना। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रवाह cytometry का उपयोग कर लार्वा लंबाई की माप, इस मामले में, एक नियंत्रण नमूना करने के लिए लंबाई रिश्तेदार प्रदान करता है छवि विश्लेषण के लिए के रूप में माइक्रोमीटर में एक पूर्ण लंबाई लार्वा बजाय गुम्मट। यह है कि स्वतंत्र प्रयोगों से माप नहीं कर सकते निकलता हैजब तक गुम्मट से अधिक आकार के अनुपात की गणना के संयुक्त किया।

नमूना कप में कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया बफर प्रवाह की दर पर असर पड़ेगा। हमने देखा है कि म्यान बफर निर्माता से सिफारिश की है कि डिटर्जेंट अधिग्रहण के दौरान उत्पन्न बुलबुले की मात्रा बढ़ जाती है शामिल हैं। M9 बफर का उपयोग करना, जो डिटर्जेंट शामिल नहीं है, काफी बुलबुले के गठन को कम किया लेकिन नमूने के प्रवाह की दर को प्रभावित करता है जो सॉर्टर, की नलिकाओं में अंडे की plugging से बचने में कम कुशल था। अंडे plugging आसानी से कुछ ही सेकंड के लिए भी एक ऊंचा TOF- के बाद एक कुछ सेकंड के लिए नियंत्रण कणों की नमूदार TOF की एक उल्लेखनीय कमी द्वारा अधिग्रहण के दौरान पता चला है। अंडे plugging भी चैनल की बाधा और कण प्रवाह (प्रति सेकंड कम है कि 5 वस्तुओं) की पूरी गिरफ्तारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यदि यह हो जाना चाहिए, जब तक प्रवाह दर को बहाल कर रहा है साफ बटन पर क्लिक करें। इन घटना के दौरान होने वाली किसी भी मापडेटा विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। म्यान बफर मृत अंडे की उच्च दर की विशेषता उपभेदों से जुड़े प्रयोगों के लिए सिफारिश की जा सकती है।

नमूना और म्यान दबाव (कदम 3.2.3 पर सेट), (थोड़ा) समय के साथ बदल सकता है और आदेश में एक बहुत निरंतर प्रवाह की दर सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान मैन्युअल रूप से समायोजित किया जाना चाहिए। कमी या कम दर की वृद्धि नमूदार जब परिणामों का विश्लेषण करने के लिए और समय (चित्रा 3 सी) पर नियंत्रण कणों की TOFs साजिश रचने के लिए किया जाएगा। प्रवाह की दर में कमी के समय के साथ कणों की औसत TOFs की वृद्धि का परिणाम देगा, जबकि प्रवाह की दर की वृद्धि विपरीत में परिणाम होगा। प्रवाह की दर में परिवर्तन नकारात्मक लार्वा की आबादी के बीच मतभेद छोटे आकार का पता लगाने में विधि की संवेदनशीलता को प्रभावित करेगा।

बढ़ाव को नियंत्रित करने के जीनों की पहचान करने के लिए लक्ष्य और समय चूक माइक्रोस्कोपी रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है तरीकों आम तौर पर उच्च रहे हैंLy समय लेने वाली और थकाऊ जब कई जीनोटाइप phenotyping। प्रवाह कोशिकामापी आधारित दृष्टिकोण है, जबकि उपकरण सभी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं की आवश्यकता होती है, कम समय लेने वाली और फलस्वरूप अधिक कुशल जब कई उपभेदों होती जा करने की जरूरत है। इस विधि छवि विश्लेषण का उपयोग माप की तुलना में भी अधिक सांख्यिकीय मजबूत है (छात्र की टी परीक्षण द्वारा मूल्यांकन उत्परिवर्ती और गुम्मट TOF वितरण की तुलना, चित्रा 5 ए और बी)। इस विधि को तो कम expressivity / penetrance साथ बढ़ाव दोष व्यक्त उपभेदों के लिए अत्यधिक उपयुक्त हो सकता है।

प्रवाह cytometry का उपयोग कर कई तरीकों नेमाटोड 9-12 की फिटनेस को मापने के लिए अतीत में विकसित किया गया है। इन तरीकों में एक 96 अच्छी तरह प्लेटें और कीड़ा सॉर्टर 'के पलटा मॉड्यूल में तिरस्कृत जानवरों का उपयोग करें। पलटा मॉड्यूल 96 अच्छी तरह प्लेटें भीतर तिरस्कृत निमेटोड आबादी के प्रत्यक्ष विश्लेषण सक्षम बनाता है। नतीजतन, इन तरीकों characte करने में सक्षम हैंप्रति दिन की स्थिति के सैकड़ों राइज़ और एक मजबूत जिस तरीके से एक गैर सिंक्रनाइज़ जनसंख्या की फिटनेस को मापने के लिए बनाते हैं। वे हालांकि, अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ एल 1 के बीच छोटे आकार मतभेद की पहचान करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। एल 1 लार्वा के बीच छोटे मतभेदों के मापन जानवरों की एक बड़ी संख्या है, जो 96 अच्छी तरह से प्लेटों की और पलटा मॉड्यूल है कि कुशलता से अच्छी तरह से प्रति सबसे कम 100 वस्तुओं को चिह्नित कर सकते हैं के उपयोग के साथ असंगत है भर में माप की आवश्यकता है। विधि यहाँ वर्णित throughput, जो काफी कम हो जाता है की कीमत पर इस उद्देश्य के लिए बनाया गया है। यह प्रति घंटे 3 से 4 की स्थिति के लक्षण वर्णन एक बार साधन calibrated है, जो प्रोटोकॉल 2 में छवि विश्लेषण का उपयोग करने पर एक उल्लेखनीय सुधार है सक्षम बनाता है।

सिर और पूंछ चौड़ाई का अनुपात का मापन पहली विधि है कि भ्रूण 7 की Antero पीछे अक्ष के साथ असमान होने वाली morphogenic प्रक्रियाओं को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया था। कबजल्दी बढ़ाव को नियंत्रित करने के लिए दिखाया जीनों के लिए आवेदन किया है, इन तरीकों में उस स्तर पर morphogenesis को नियंत्रित करने के रास्ते संकेतन के स्थानिक वितरण स्पष्ट करेंगे। गिरफ्तार किया गया लार्वा या तो छवि विश्लेषण या जल्दी बढ़ाव के अंत में भ्रूण की लंबाई की माप के साथ संयोजन में प्रवाह cytometry का उपयोग की लंबाई की माप या तो जल्दी या देर से बढ़ाव या दोनों उच्च संवेदनशीलता और परिशुद्धता के साथ नियंत्रित करने के जीन की पहचान के लिए सक्षम हो जाएगा। इन प्रक्रियाओं तो सी में भ्रूण बढ़ाव को नियंत्रित करने के रास्ते संकेतन के स्थानिक और लौकिक विनियमन के भविष्य को समझने के लिए काफी योगदान कर सकते हैं एलिगेंस। इसके अलावा, इन तरीकों में भी इस तरह इंसुलिन और TGF-बीटा के रूप में शरीर की लंबाई को नियंत्रित करने के संकेत दे रास्ते का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 13, 14 और पुरानी पर्यावरण दूषित पदार्थों को 15, 16 के लिए जोखिम रास्ते। इन मापों अलग लार्वा चरणों में या usin वयस्कों में किया जा सकता हैएल 1 में प्रोटोकॉल 2 और 3 मापने आकार मतभेद के छ मामूली बदलाव ऐसे L3, L4 लार्वा या वयस्क के रूप में बड़ा वस्तुओं की तुलना में कीड़ा सॉर्टर के साथ और अधिक चुनौतीपूर्ण है। प्रोटोकॉल 3 तो आसानी से इन मापन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar  BioShop AGR001.500
Agarose Bioshop AGA001.500
CaCl2 (Calcium Chloride) Bio Basic Inc. CT1330
Cholesterol Sigma-aldrich C8667
Cleaning solution  union Biometrica 300-5072-000
Glass coverslips Fisherbrand 12-542B
Glass slides Fisherbrand 12-552-3
High fluorescent control particles union Biometrica 310-5071-001
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. PB0447
K2HPO4 (potassium phosphate, monobasic) Bio Basic Inc. PB0445
MgSO4 (magnesium sulfate) Sigma-aldrich 230391
Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) Bio Basic Inc. SDB0487
NaCl (sodium chloride) Bio Basic Inc. DB0483
Pebeo Drawing Gum 45 ml pébéo PDG033000 any art/craft store
Peptone BioShop PEP403.500
Sheath buffer union Biometrica 300-5070-100
COPAS Biosort union Biometrica

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 109 morphogenesis, बढ़ाव 4-डी माइक्रोस्कोपी प्रवाह cytometry भ्रूण विकास
उपन्यास मेट्रिक्स निमेटोड के भ्रूण बढ़ाव विशेषताएँ<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em
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Martin, E., Rocheleau-Leclair, O.,… More

Martin, E., Rocheleau-Leclair, O., Jenna, S. Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (109), e53712, doi:10.3791/53712 (2016).

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