Introduction
Les cellules immunitaires innées constituent une partie essentielle des cellules dans le microenvironnement de la tumeur et ont été associés à une tumeur maligne chez les patients et les modèles animaux de cancer 1. Récemment, il est devenu plus largement apprécié que les réponses immunitaires chroniques jouent un rôle crucial dans la promotion de la progression tumorale, les métastases et la résistance aux chimiothérapies 2. Les macrophages sont des cellules immunitaires innées importantes qui ont été montrés pour réguler directement la réponse des cellules tumorales à la chimiothérapie 3,4. Cependant, le rôle des neutrophiles, des acteurs clés dans le système immunitaire inné, dans la régulation de la réponse tumorale au traitement anti-cancéreux est inconnue. Les objectifs de ces protocoles sont d'utiliser une méthode rapide et crédible pour séparer les neutrophiles provenant des échantillons de sang CLL du patient et de différencier les cellules HL60 le long de la voie granulocytaire afin d'étudier leur rôle dans la régulation de la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome.
5 et agir comme une première ligne de défense contre les micro - organismes envahisseurs 6. Les neutrophiles ont un rôle essentiel dans la hausse des réponses immunitaires innées efficaces en plus de fonctions effectrices variables dans plusieurs états pathologiques 7. Par conséquent, un procédé rapide et fiable pour isoler neutrophiles à partir d' autres cellules sanguines, telles que la méthode de séparation par gradient de densité, est nécessaire pour des études in vitro. L' utilisation de cette méthode pour l' isolement des cellules neutrophiles facilitera de nouvelles recherches sur les fonctions immunologiques à médiation par les neutrophiles in vivo et ex vivo.
La capacité d'obtenir des populations pures de neutrophiles est une première étape importante pour l'étude des patients atteints de maladies immunologiques 8. Densité procédé de séparation par gradient est une technique idéale dans laquelle un rendement élevé de cellules est obtenue. La méthod comprend l'ajout d'une solution à gradient de densité dans le fond d'un tube contenant du sang humain dilué suivi par une centrifugation à 300 g pendant 35 min sans pause. L'anneau des cellules mononucléaires apparaît à l'interface et les neutrophiles réside en dessous de la première. Cette méthode possède des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes disponibles tels que des kits d'isolement neutrophiles qui sont beaucoup plus chers 9. En outre, l'isolement des neutrophiles du sang humain par des kits commerciaux utilisant des anticorps dirigés contre un marqueur de surface spécifique pour les neutrophiles humains, augmentent le risque d'une activation ou la différenciation cellulaire. Densité procédé de séparation par gradient permet l'isolement des neutrophiles dans un court laps de temps. Dans le même temps, les cellules mononucléaires sont également séparés et récupérés. C'est une technique fondamentale dans laquelle un rendement élevé de cellules pur est obtenu afin d'obtenir l'intégrité fonctionnelle.
Afin d'imiter le microenv tumoralironnement, des expériences 3D ont été réalisées. Compte tenu de la courte demi-vie des neutrophiles in vitro, les expériences en 3D avec des neutrophiles humains fraîches ne sont pas concluants. Pour cette raison, promyélocytaire (HL60), les cellules sont amenées à se différencier en cellules neutrophiles-like en utilisant les inducteurs de différenciation diméthylsulfoxyde (DMSO) et de l'acide rétinoïque (RA). En utilisant des cellules HL60 différenciées (HL60 diff) permettra d' éviter d' avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de l' isolement de différents donateurs.
En 3D vitro des modèles de culture représentent une étape intermédiaire entre les modèles 2D in vitro et dans des modèles in vivo. Dans la culture 2D, les cellules réparties sur une surface plastique formant des pièces jointes de cellules anormales aux protéines déposées qui sont dénaturées sur cette surface synthétique. A l'inverse, les cellules en forme de culture 3D cellule-cellule naturelle jointes depuis les cellules et la matrice extracellulaire sont elles synthétisent le matériau naturel auquel ils sont attachés.Pour cette raison, les modèles de co-culture en 3D, en particulier entre les cellules cancéreuses et d'autres types de cellules, ont été très utiles pour indiquer leur contribution à la croissance tumorale, l'angiogenèse et les métastases. Par conséquent, les cultures 3D rendent la culture cellulaire miment les conditions physiologiques qui existent in vivo 10.
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Protocol
1. neutrophiles isolement et co-culture avec des cellules leucémiques primaires
NOTE: Les procédures ont été menées sous l'approbation du comité d'éthique de l'Hôpital Lyon avec tous les patients signent un consentement éclairé.
- Isolement des cellules leucémiques primaires et neutrophiles
- Collecter des tubes de sang périphérique sur EDTA (1,8 mg EDTA par millilitre de sang) provenant de patients diagnostiqués avec la leucémie lymphocytaire chronique (CLL).
- Ajouter chaque 15 ml de sang dans un tube stérile de 50 ml et on dilue avec 15 ml de RPMI (dilution 1: 1), puis avec précaution et ajouter lentement 15 ml d'une solution à gradient de densité au fond du tube, sans mélanger les phases. Faire en sorte que la solution à gradient de densité à température ambiante pendant la préparation.
- Centrifuger à 300 xg pendant 35 min à température ambiante et sans frein. Le sang doit se séparer en quatre étapes distinctes comme représenté sur la figure 1A, de haut en bas: des plaquettes et du plasma, des cellules mononucléaires (white ring), solution de gradient de densité, granulocytes et érythrocytes.
- Collecter l'anneau blanc qui représente les cellules leucémiques primaires avec une pipette en plastique de Pasteur et le transfert à un nouveau tube de 50 ml.
- Remplir le tube avec du PBS (contenant du calcium et de magnésium) à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter du PBS à 50 ml au total et centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
- Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine) pour compter en utilisant la viabilité cellulaire compteur.
- Aspirer les phases supérieures laissant le granulocytes et érythrocytes phase et ajouter PBS jusqu'à 25 ml puis ajouter 3% dextran dans 0,9% NaClup à 50 ml au total. Mélanger les tubes 10 fois et les garder pendant 30 min à température ambiante sans mélange.
- Collecter la partie supérieure RBC-couche pauvre de neutrophiles uneD les placer dans un tube de ml stérile 50 propre et centrifuger les tubes à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Remettre en suspension chaque culot avec 5 ml de PBS, puis ajouter un tampon de lyse des globules rouges à 50 ml au total.
- Gardez les tubes dans l'obscurité pendant 15 min à température ambiante puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec du PBS (PBS ajouter jusqu'à 50 ml au total) puis centrifuger à 500 g pendant 10 min à température ambiante.
- Resuspendre les pastilles avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre. Conserver 3 x 10 5 de chaque type de cellule dans 50 ul de PBS-FBS (4%) dans des tubes de 5 ml en matière plastique pour déterminer la pureté de leur isolement par cytométrie de flux.
- Analyser les apparences morphologiques des populations de cellules isolées
- Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10 4 neutrophiles et 3 x 10 4 cellules mononucléaires dans 150 pi de milieu RPMI complet. Assembler les lames de verre, les cartes de filtrage et de chambres d'échantillons dans la centrifugeuse Cytospin, assurant que til centrifuger est bien équilibrée.
- Placer chaque type de cellule dans la chambre d'échantillon et cyto-centrifugation à 750 g pendant 10 min à température ambiante Retirer les lames, les cartes de filtrage et de chambres d'échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d'échantillon.
- Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X.
- Testez la pureté des cellules isolées par FACS
- Etiqueter les cellules leucémiques primaires isolées avec un anticorps anti-CD19 humain conjugué à APC (5 pi / 10 6 cellules). Etiqueter les neutrophiles purifiés avec un mélange d'anticorps anti-humains énumérés dans le tableau 1 (5 pi / 10 6 cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ° C
- Laver les cellules avec 500 ul de PBS-FBS (4%) de la centrifugeuse les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension chaque culot dans 200 pl de PBS-FBS (4%).
- Analyser un cytomètre de flux en utilisant la configuration optique suivante: 488 nm laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Veiller à la compensation de couleur.
- Coculture de cellules leucémiques primaires avec autologue neutrophiles
- Semences 2 x 10 5 cellules / ml de cellules leucémiques primaires seuls ou avec des neutrophiles autologues à 1:10 dans du milieu RPMI complet. Pour ce faire, d' ajuster le nombre de cellules par dilution de suspensions cellulaires et ajouter 2 x 10 5 cellules / ml de cellules leucémiques primaires à 2 x 10 6 cellules / ml neutrophiles. Mélanger soigneusement.
- Ajouter 25 pM de tyrosine-kinase (Btk) l'inhibiteur de Bruton (Ibrutinib) aux cellules. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Cellule de récolte et d' analyse FACS
- Collect les cellules dans des tubes en plastique de 5 ml pour l'analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Laver les pellets avec 1 ml de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- pellets Resuspendre dans Annexin V et PI en utilisant le kit commercial et incuber les cellules dans le noir pendant 10 min à température ambiante. Analyser sur un cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 2A et la configuration optique suivant: laser 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Veiller à la compensation de couleur.
2. Différenciation des cellules HL60 le long de la granulocytaire Pathway et leur coculture avec des cellules RL lymphome B dans le modèle 3D
- Différenciation des promyélocytaire humaine (HL60) cellules en cellules neutrophiles-like
- Ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 5 cellules / ml , puis ajouter 1 uM d' acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO pour induire leur différenciation. Seed chaque 3 x 10 5 2.
- Ensuite, recueillir les cellules et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre.
- Diluer la suspension cellulaire dans un milieu RPMI complet pour ajuster le nombre de cellules HL60 à 3 x 10 5 cellules / ml et induire leur différenciation à nouveau par addition de 1 uM d' acide rétinoïque (RA) et 1,25% de DMSO. Seed chaque 3 x 10 5 HL60 cellules par puits dans une plaque de 48 puits et incuber pendant encore 48 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Analyse de la différenciation des HL60 (HL60 diff)
- Recueillir les cellules et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Reprendre le culot avec un milieu RPMI complet pour le comptage en utilisant la viabilité des cellules contre.
- Pour analyser les variations des marqueurs de surface cellulaire d'expression par cytométrie de flux. Placez chaque 3 x 10 5 5 cellules HL60 diff dans des tubes en plastique de 5 ml pour l' analyse FACS et centrifuger les tubes à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les culots dans 50 ul de PBS-FBS (4%). Etiqueter les cellules avec CD11b anti-humain conjugué à AF700 ou CD38 anti-humain conjugué à APC (5 pi / 10 6 cellules). Incuber les cellules dans le noir pendant 30 min à 4 ° C
- Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%) puis centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension les granulés dans 200 ul de PBS-FBS (4%).
- Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 3A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- Pour tester les changements morphologiques dans HL60 diff, immobiliser les cellules sur des lames de verre pour l' examen microscopique.
- Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10
- Placer chaque type de cellule dans la chambre d'échantillon et cyto-centrifugation à 1500 tpm pendant 10 min à température ambiante. Retirez les diapositives, cartes de filtre et chambres d'échantillons de la centrifugeuse. Démonter avec soin, afin de ne pas endommager les cellules sur la lame. Jeter les cartes de filtre et chambres d'échantillon.
- Colorer les cellules en utilisant le kit de coloration Giemsa et de garder les lames pendant 1 heure à sécher. Examiner les cellules au microscope avec un grossissement de 100X.
- Pour ce faire, resuspendre chaque 3 x 10
- 3 dimensions (3D) Culture
REMARQUE: Veiller à ce que les matériaux utilisés dans cette expérience sont froids et l'expérience se déroule sur la glace.- Resuspendre chaque 5 x 10 4 cellules RL, que ce soit seul ou mélangé avec HL60 diff diff 01h10, avec 300 ul matrice de membrane basale en utilisant 1 ml pointe de pipette coupé avec des ciseaux stériles afin d'élargir l'ouverture à environ 2 à 3 mm. Éviter les bulles lors de cette étape.
- Graine chaque 300 pi de suspension de cellules / puits dans une plaque de 24 puits. Éviter les bulles lors de cette étape. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C avec 5% de CO 2 , puis ajouter 1 ml de milieu RPMI à chaque puits et laisser incuber pendant 7 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2. Changer le milieu tous les deux jours. Ajouter 10 nM vincristine au jour 5.
- Analyse FACS
- Après 7 jours de culture, aspirer le milieu et laver chaque puits avec 1 ml PBS glacé deux fois. Ajouter 3 ml / puits de PBS glacé-EDTA (5 mM). Détacher le gel à partir du fond du puits par grattage en utilisant la partie inférieure de la pointe de pipette de 200 pi. Agiter doucement la plaque sur la glace pendant 30 min.
- Transfert suspension cellulaire dans le tube de 15 ml stérile et agiter les tubes doucement sur ice pendant encore 30 min. Vérifiez l'apparence de la suspension cellulaire homogène. (Si ce n'est pas le cas, alors secouer les cellules pour plus de temps ou ajouter plus de PBS-EDTA).
- Centrifuger les tubes à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Laver les pastilles avec PBS puis centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante.
- Remettre en suspension avec du PBS-FBS (4%) et l' étiquette avec l' anticorps CD19 anti-humain conjugué à la PE-Cy7 , et un anticorps anti-CD38 humain conjugué à APC (5 pl / 10 6 cellules). Incuber dans l' obscurité pendant 30 min à 4 ° C
- Laver avec 500 pi de PBS-FBS (4%), puis Tubes centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre les cellules avec Annexin V et PI en utilisant un kit commercial.
- Analyser le cytomètre en flux en utilisant la stratégie de déclenchement de la figure 4A et la configuration optique suivant: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Veiller à la compensation de couleur.
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Representative Results
Densité procédé de séparation par gradient décrite ici fournit des cellules leucémiques primaires et des neutrophiles non stimulés isolés à partir du sang des patients atteints de LLC La figure 1A représente les différentes couches de sang obtenus après gradient de densité de centrifugation (de haut en bas. Plaquettes et de plasma, cercle blanc représente les cellules mononucléaires, solution à gradient de densité, les granulocytes et les globules rouges). la Figure 1B et 1C montrent des différences dans les apparences morphologiques entre les neutrophiles (cellules polylobés noyaux) et de cellules mononucléaires , respectivement.
Résultats de la figure 1D représentent les énoncés prospectifs, scatter (FSC) vs dispersion latérale (SSC) terrain de cellules leucémiques primaires (cellules mononucléaires). Étiquetage cette population avec CD19 anti-humain conjugué à APC montre un décalage à droite complète de l'histogramme (Figure 1E) avec un seulpic qui indique que cette population est positive pour CD19 et pur. Les neutrophiles sont également ≥90% pur comme vérifié par cytométrie de flux après marquage neutrophiles isolés avec un mélange d'anticorps monoclonaux conjugués à un fluorochrome énumérés dans le tableau 1. Figure 1F représente FSC vs tracé SSC de dispersion des neutrophiles isolés qui sont positifs pour CD45 (Figure 1G), positif pour CD15 et négatives pour CD14 (Figure 1 H), positive pour CD15 et CD16 (Figure 1I), positif pour CD16 et négatives pour CD56 (figure 1J).
Figure 1. Analyse des apparences morphologiques et de pureté des cellules leucémiques primaires et neutrophiles isolés à partir du sang des patients. (A) Vue schématique représente différentes couches de sang après gradi densitéent centrifuger. (BC) Giemsa représente les différences morphologiques entre les neutrophiles (B) et (C) des cellules leucémiques (cellules mononucléaires) primaire. Les photos ont été prises au microscope avec grossissement 100X. (D) Forward-scatter (FSC) et de dispersion latérale (SSC) tracé représente la population isolée de cellules leucémiques primaires. (E) , les cellules leucémiques primaires isolées ont été marquées avec anti-CD19-APC et analysés pour l'expression de CD19. La ligne rouge indique les cellules non marquées et la ligne bleue indique les cellules marquées avec des anticorps anti-CD19-APC. (F) FSC vs tracé SSC scatter représente la population de neutrophiles isolé. (GJ) neutrophiles isolés ont été marquées avec un mélange d'anticorps énumérés dans le tableau 1 et analysés pour l'expression de (G) , CD45 (H) , CD14 et CD15, (I) , CD15 et CD16, (J) un CD16d CD56. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Antigènes | Fluor | Cloner |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tableau 1. fluorochrome conjugués purifiées Anticorps monoclonaux utilisés pour tester la pureté des neutrophiles isolés. Tous les anticorps ont été obtenus à partir de Miltenyi biotech.
figure 2A représente les portes de neutrophiles et les cellules leucémiques primaires. Les neutrophiles sont beaucoup plus précis que les cellules leucémiques primaires afin qu'ils apparaissent avec SSC supérieur. Gating sur les cellules leucémiques primaires en co-culture avec des neutrophiles en présence de Ibrutinib, les résultats montrent le pourcentage plus élevé de cellules vivantes (figure 2C, 84,8%) par rapport aux cellules cultivées seules (figure 2B, 53,1%). La boîte graphique de la figure 2D montre que les dimie de la viabilité cellulaire induite par Ibrutinib a été significativement inhibée par la présence de neutrophiles (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 patients).
Figure 2. autologue neutrophiles protéger les cellules leucémiques primaires contre Ibrutinib. Sang a été prélevé chez des patients diagnostiqués avec la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). les cellules leucémiques primaires ont été isolés et cultivés seuls ou conjointement avec autologues neutrophiles (N) des cellules leucémiques primaires nratio 01:10 pendant 24 heures, en présence ou en l'absence de 25 pM Ibrutinib. Le pourcentage de cellules leucémiques primaires vivantes (AnnexeIV V négatif / PI négatif) a été mesurée par une double coloration avec l' annexine V-FITC et PI, suivie d' une analyse par cytométrie de flux. (A) Forward-scatter (FSC) et de dispersion latérale (SSC) parcelle représente les portes de neutrophiles et les cellules leucémiques primaires. (B) Bi-dimensionnel dot-blot montre les pourcentages de cellules leucémiques primaires vivantes et apoptotiques cultivées seules et traitées avec 25 uM Ibrutinib. (C) Bi-dimensionnel dot-blot montre les pourcentages de cellules leucémiques primaires vivantes et apoptotiques CO- cultivées avec des neutrophiles et traitées avec 25 uM Ibrutinib. (D) Box parcelle représente le pourcentage de cellules leucémiques primaires vivantes de 19 patients. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *** p <0,001 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La demi-vie courte de neutrophiles in vitro rend leur utilisation dans la culture 3D inefficace. La différenciation des cellules HL60 le long de la voie granulocytaire a été induite par inducteurs de différenciation. Deux paramètres différents (marqueurs de surface cellulaire expression et morphologique changes) ont été utilisés pour mesurer la différenciation des HL60. FSC vs SSC terrain de dispersion sur la figure 3A montrent que les cellules HL60 sont plus grandes en taille par rapport aux cellules HL60 diff avec FSC supérieur. Marquage des cellules HL60 (HL60 ou diff) avec un anticorps anti-humains CD11b conjugués à AF700 et CD38antibody anti-humain conjugué à de l' APC montre une augmentation de l' expression de CD11b et CD38 (figure 3B) lors de la différenciation qui est indicative de la différenciation granulocytaire. Les cellules HL60 diff montrent également des changements morphologiques détectées par l'apparition de noyaux polylobés (figure 3C).
Figure 3. Paramètres structurels de cellules différenciées HL60. (A) Forward-scatter (FSC) et de dispersion latérale (SSC) parcelles représentent HL60 et les cellules HL60 différenciées (HL60 diff). (B) HL60 et HCellules diff L60 ont été marquées avec anti-CD11b-AF700 ou anti-CD38-APC suivie par cytométrie de flux. Après gating sur chaque population de cellules dans le FSC-A vs SSC-Un diagramme de dispersion (A), les cellules ont été analysées pour les expressions de CD11b ou CD38. Cellules (C) HL60 montrent des changements morphologiques compatibles avec la différenciation vers granulocytes. Les photos ont été prises au microscope avec un grossissement de 100X. Gras flèche noire pointer le noyau multi-lobé. Les graphiques sont représentatifs de cinq expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour tester l'effet des cellules HL60 diff sur la régulation de la réponse des cellules RL à la vincristine dans le modèle 3D, les cellules ont été cultivées RL seul ou avec diff HL60 en sous - sol membrane - matrice en présence ou en l' absence de la vincristine à 10 nM. En utilisant la stratégie de déclenchement représentée sur la figure 4A, les deux populations ont discriminé sur la base de CD19 et CD38 expression; Cellules positives pour CD19 et les cellules HL60 diff positives pour CD38 RL. Gating sur les cellules RL en co-culture avec des cellules HL60 diff , en présence de la vincristine, les résultats montrent le pourcentage plus élevé de cellules vivantes (figure 4C, 35,9%) par rapport aux cellules RL cultivées seules (figure 4B, 19,7%). La barre graphique de la figure 4D montre une augmentation significative du pourcentage de cellules RL vivants (CD19 Annexin V positif / négatif PI négatif) en présence de cellules HL60 diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figure 4. HL60 Cellules diff neutrophiles-like à protéger les cellules RL Lymphome contre vincristine en 3D Culture. Cellules RL ont été cultivées seules ou ensemble avec des cellules HL60 diff à RL: HL60 ratio de diff 01h10 pendant 7 jours dans la matrice de la membrane basale. Au jour 5, la vincristine (VCR) a été ajouté à une concentration de 10 nM. Spheroids ont été dissociées au jour 7 et les cellules ont été marquées avec anti-CD19-PECy7 et anti-CD38-APC puis remis en suspension avec de l' annexine V-FITC et PI suivie d' une analyse par cytométrie de flux. (A) Forward-scatter (FSC) et de dispersion latérale (SSC) tracé représente les portes de cellules RL et des cellules diff HL60. (B) Bi-dimensionnel dot-blot montre les pourcentages de cellules RL vivantes et apoptotiques cultivées seules et traitées avec 10 nM vincristine. (C) point- Bi-dimensionnel blot montre les pourcentages de cellules RL vivants et apoptotiques co-cultivées avec HL60 diff et traitées avec 10 nM vincristine. (D) le graphique à barres représente le pourcentage de cellules RL vivants. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Décrite ici, un protocole efficace, simple, rapide et peu coûteux pour l'isolement des neutrophiles du sang humain avec une grande pureté en utilisant un gradient de densité approche de centrifugation et dans les mêmes cellules étape mononucléaires sont également séparés et valorisés. Les populations de cellules isolées sont ≥90% pur.
Plusieurs méthodes sont disponibles pour l'isolement des cellules neutrophiles du sang humain. Ceux - ci comprennent des procédés similaires en utilisant des gradients discontinus 11,12, ou en utilisant des kits commerciaux pour l' isolement des cellules neutrophiles par la sélection de l' immuno-magnétique positive au cours de laquelle les neutrophiles sont immuno-magnétiques marquées avec un anticorps spécifique tels que CD16 anti-humain enrichi neutrophiles puis par la liaison du CD16- cellules positives sur une colonne magnétique 13. Des kits commerciaux avec la sélection des immuno-magnétique négatif sont également disponibles au cours de laquelle le sang total ou granulocytes suspension sont marquées avec un cocktail d'anticorps qui se lient sur les cellules autres than neutrophiles 9 (ie, les complexes anticorps qui étiquettent hématies, des plaquettes et des cellules indésirables telles que CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glycophorine A et des particules magnétiques dextran revêtues), puis les neutrophiles sont enrichis par élution comme anticorps fraction négative des cellules qui ne se lient pas à la colonne magnétique. De plus, les neutrophiles peuvent être isolés par tri cellulaire activé par fluorescence 14.
Certaines techniques ont été montrés pour fournir des rendements élevés de neutrophiles purs, tels que la sélection de l'immuno-magnétique positive. Cependant, cette méthode présente des inconvénients par rapport à gradient de densité des procédés de centrifugation dus à des agents de marquage qui se lient à la surface de neutrophiles et cela pourrait altérer leur fonction en induisant leur activation ou de différenciation. Aussi à l'aide de la méthode de sélection des immuno-magnétique positive, l'anticorps marqué neutrophiles bind sur une colonne magnétique pour la séparation et cela peut aussi affecter leur fonction.Fluorescence tri cellulaire activé a une autre limitation dans la mesure où cette méthode nécessite plus de temps pour recueillir les cellules qui peuvent affecter négativement la survie des neutrophiles en raison de leur courte demi-vie.
procédé de centrifugation à gradient de densité sont très comparables et la pureté des neutrophiles peut être supérieure à 90% en utilisant les deux procédures, mais le premier est un gradient à deux couches qui est techniquement moins difficile par rapport à la stratification solution à gradient qui se composent de 40%, 60% et 80% en volume / vol dans du PBS. Il a été mentionné par Swamydas et al. 15 qui mélange des interfaces de la solution de gradient a souvent lieu en raison des petites différences de densité entre les trois couches. En ce qui concerne les approches de sélection négative immuno-magnétique, ils ont également été rapportés comme étant efficaces pour l' isolement des cellules neutrophiles avec une grande pureté et la viabilité 9. Leur avantage par rapport à la sélection des immuno-magnétique positive et Fluorescence tri cellulaire activé est que neutrophilesne sont pas marqués avec des agents de marquage et ne se lie pas à la colonne magnétique, évitant ainsi l'activation des cellules, mais cette méthode est beaucoup plus cher et plus de temps par rapport à la méthode de gradient de densité.
Neutrophiles subissent normalement une apoptose spontanée rapide à la fois in vitro et in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells conservent de nombreuses caractéristiques des progéniteurs de leucocytes humains, tels que le potentiel de se différencier en 18 neutrophiles. Contrairement à neutrophiles, les cellules diff HL60 ne le font pas rapidement l'apoptose et l' utilisation de ces cellules permet de résoudre le problème d'avoir des réponses différentes de neutrophiles en raison de leur isolement de différents donateurs.
Récemment, cultures 3D deviennent plus mature et pertinente à la physiologie humaine et animale, et un modèle attrayant pour la recherche biologique différente en particulier dans le domaine du cancer. Le changement de modèle de la 2D à la culture 3D progresse rapidement de Virence ce dernier est plus visible lors de l' étude de diverses pathologies telles que le cancer 19. Il y a une prise de conscience croissante des inconvénients de la culture 2D où l' ajout d' une troisième dimension à l'environnement d'une cellule est importante afin de regarder de plus près à l'importance des interactions cellulaires 20 et d'étudier les différences de comportement cellulaire et caractéristiques. La culture 3D crée un environnement similaire aux conditions dans un organisme vivant (par exemple., L' être humain) menant à des recherches plus pertinentes. Cependant, la culture 3D implique l'interaction complexe entre les différents partenaires tels que des cellules, des matrices extracellulaires et fluides interstitiels qui ne sont pas présents dans la culture 2D. Ainsi, les efforts seront nécessaires afin d'établir la méthode d'étalonnage et de compter sur les bonnes pratiques de laboratoire ainsi que des fournitures efficaces en particulier les marques commerciales qui sont largement testés et contrôlés.
Le microenvironnement tumoralse compose de plusieurs types de cellules, y compris de nombreuses populations de cellules immunitaires qui participent et régulent la tumorigenèse, les métastases et la réponse aux agents anti - cancéreux 21,22. Plusieurs études ont montré qu'une augmentation de l' infiltration de neutrophiles dans les tumeurs est significativement corrélée avec une résistance acquise à plusieurs agents anticancéreux tels que la thérapie anti-VEGF 23,24. En outre, l' élévation du neutrophile de prétraitement compte chez les patients présentant un carcinome métastatique des cellules rénales 25, ainsi que la présence d'un niveau élevé de neutrophiles intra-tumorales chez les patients ayant des tumeurs solides 26 ont été proposés en tant que facteurs pronostiques de survie médiocre. Notre étude suggère que les neutrophiles peuvent jouer un rôle dans la protection des cellules de lymphome B de anticancéreuse apoptose induite par agent.
En résumé, la méthode fiable et reproductible décrit ici peut être utilisé par tout laboratoire pour recueillir les neutrophiles et les cellules mononucléaires du ronflementun sang. De plus, la différenciation des cellules HL60 le long de la voie granulocytaire est présentée afin d'éviter des problèmes de neurophiles tels que l'apoptose spontanée rapide. Ces approches ont été utilisées pour étudier le rôle des neutrophiles sur la sensibilité des cellules de lymphome à des agents anti-lymphome où neutrophiles montrent un effet protecteur sur les cellules de lymphome contre ces agents en utilisant des systèmes de culture 2D et 3D. Ces approches peuvent être utilisées pour une variété d'études fonctionnelles neutrophiles qui devrait approfondir notre compréhension du rôle des neutrophiles dans la biologie du cancer. En particulier, cette méthode peut être utilisée pour mieux comprendre la diaphonie entre les neutrophiles et les cellules tumorales ou entre les neutrophiles et les autres composants de la micro-environnement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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