Abstract
Протоколы для генерации популяции кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток, были разработаны, но они обычно дают клетки смешанных фенотипов. Исследователи, заинтересованные в проведении исследований с участием конкретных миоцитов подтипов требуют более направленной дифференцировки подход. Обрабатывая мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток со Grem2, секретируемого антагониста BMP , который необходим для формирования мерцательной камеры в естественных условиях, большое количество клеток сердца с мерцательной фенотипа может быть сгенерирован. Использование сконструированной Myh6-DsRed-Nuc плюрипотентные линии стволовых клеток позволяет идентифицировать, отбора и очистки кардиомиоцитов. В этом протоколе эмбриональные органы формируются из клеток Myh6-DsRed-NUC с использованием метода висящий капли и выдерживают в суспензии до дифференцировки день 4 (d4). В d4 клетки обрабатывают Grem2 и высевают на покрытые желатином пластин. Между d8-d10 крупные подрядные участки наблюдаются в культурах и продолжают расширяться и мратура через D14. Молекулярный, гистологические и electrophysiogical анализы показывают клетки в Grem2-обработанных клеток приобретают предсердные подобные характеристики , обеспечивающие модель в пробирке для изучения биологии предсердных кардиомиоцитов и их реакцию на различных фармакологических агентов.
Introduction
Плюрипотентные стволовые клетки являются мощным инструментом для создания и изучения клетки от хозяина трудно тканей доступа для фундаментальных исследований и доклинических исследований, особенно у людей 1-5. Правильная модуляция развития путей передачи сигналов может направлять дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток к желаемой фенотипической судьбы. Многие протоколы были разработаны для создания кардиомиоцитов (КМВ) из плюрипотентных стволовых клеток 6-14. Эти протоколы обычно включают в себя модуляцию TFGβ надсемейство (активин, BMP и TGF - beta) и Wnt путей распространения приурочено добавления экзогенных факторов роста и / или малых молекул 10,12-15. Эти протоколы, как правило, эффективны при увеличении процента клеток, которые становятся КМВ, но не имеют специфичности, создавая смешанную популяцию клеток, представляющих предсердий, желудочков, и система узловой / проводимости родословных. Для изучения конкретных кардиологические подтипы более направленной дифференцировки APPROACH требуется.
Gremlin2 (Grem2, называемый также протеин , относящиеся к Дэну и Cerberus или PRDC для краткости) представляет собой секретируемый антагонист BMP , который необходим для правильной сердечной дифференциации и формирования мерцательной камеры во время остановки развития в данио 16. Лечение дифференцирующие эмбриональных стволовых клеток с Grem2 при разграничении 4 -й день, сразу после пика экспрессии мезодермальных маркеров Т-Brachyury и Cerberus , как 1, увеличивает выход КМВ и формирует пул клеток преимущественно предсердия линии 14.
Рекомбинантный Grem2 используется для лечения дифференцирующие клетки и могут быть изготовлены с использованием технологии производства стандартного белка 17 или могут быть приобретены на коммерческой основе . Он хорошо растворим в водных растворах и могут быть добавлены к экзогенно культур в желаемый момент времени.
Разграничение можно отслеживать с помощью RT-КПЦР для количественного определения экспрессии маркеров представителясердечно-сосудистых клеток-предшественников, сердечные клетки-предшественники, совершенные CMs. Иммунофлуоресценции также могут быть использованы для идентификации и визуализации пространственного распределения сердечных типов клеток.
Приложения, которые требуют чистых популяций более легко осуществляется при использовании репортерной системы для идентификации и выделения CMs. Для этого мы ввели αMHC-DsRedNuc построить в клеточную линию мышей CGR8 ES 14. CGR8 клетки растут и остаются плюрипотентные без фидерных клеток, что способствует расширению и дифференциации анализов 18. Клеточная линия ES содержит флуоресцентный белок DsRed кодирующую последовательность с сигналом ядерной локализации при сердечной суммарной альфа тяжелой цепи миозина (альфа MHC или Myh6) , промотор гена. Используя эти клетки, КМВ можно легко идентифицировать и выделить для количественной оценки, сортировки клеток, электрофизиологии, экраны наркотиков, а также изучения механизмов мерцательной дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка среды для культивирования клеток, растворов и реактивов.
- Приготовьте 500 мл мышиных эмбриональных стволовых клеток (MESC) средств массовой информации путем смешивания и стерильной фильтрации (размер пор 0,2 мкм) 445 мл Глазго Minimum Essential Medium (GMEM), 50 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл 100X концентрировали L- замена глутамина, 5 мкл рекомбинантного мыши ингибирующий лейкоз фактор (LIF) в количестве 1 × 10 7 единиц на мл и 1,43 мкл ß-меркаптоэтанола (конечная концентрация 50 мкМ). Храните при 4 ° С до готовности к использованию.
- Приготовьте 500 мл эмбриоида органа (EB) дифференцировки путем смешивания и стерильной фильтрации 391 мл Исков Модифицированная Дульбекко Medium (IMDM), 100 мл инактивированной нагреванием FBS, 5 мл 100X концентрировали L-Глютамин замены, 5 мл 100X концентрируют Non-незаменимые аминокислоты (NEAA), и 2,86 мкл бета-меркаптоэтанола (конечная концентрация 100 мкМ). Хранить при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
- Готовят 0,2% мас/ об раствора желатина путем смешивания 1 г порошка свиную кожу желатин 500 мл фильтруется, дистиллированную H 2 O. Стерилизовать автоклавированием. Обратите внимание, что желатин не может быть полностью растворим в воде при комнатной температуре. После автоклавирования желатин должен быть полностью растворен. Храните при комнатной температуре до готовности к использованию.
- Подготовка Grem2 рекомбинантного белка аликвоты путем растворения 50 мкг гранул лиофилизированного Grem2 в 100 мкл фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы сделать 0,5 мкг / мкл маточного раствора. Алиготе 20 мкл этого исходного раствора в пять стерильным 1,5 мл центрифужные пробирки и хранят при температуре -80˚ С до готовности к использованию.
- Подготовить PBS согласно опубликованным протоколам или покупку как запас 10X и разбавить в соотношении 1:10 с фильтрованной, дистиллированной H 2 O , чтобы сделать 1X разбавление 19 работает. Стерилизовать PBS автоклавированием перед использованием. Храните при комнатной температуре до готовности к использованию. В некоторых шагов, ДЗФР без Са 2+ и Mg 2+ используется. Это пуrchased как раствор 1X. Информация для заказа включена в таблицу реагентов.
2. Приготовление Желатин с покрытием 10 см тканевой культуры Посуда
- В стерилизованные культуры ткани капюшон добавляют 5 мл 0,2% раствора желатина на каждые 10 см блюдо культуры ткани для покрытия. Место блюда в инкубаторе при 37 ° С в течение не менее 30 мин или до 4-х дней.
3. Получение покрытые желатином 6-луночных планшетах Культура
- В стерилизованные культуры ткани капюшоном прибавляют 1 мл 0,2% желатина в каждую лунку планшета для культуры ткани 6-луночного. Место пластин в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение не менее 30 мин или до 4-х дней.
4. эмбриональных стволовых клеток культуры
- Размораживание mESCs
- Подготовка MESC СМИ при нагревании до комнатной температуры в стерилизованную капот культуры ткани. Добавьте 10 мл RT СМИ в желатин покрытием 10 см блюдо.
- Удалить 1 флакон из mESCs , содержащих приблизительно 1 × 10 6 клеток изcryostorage. Проведение криопробирку с щипцами, место в водяной бане при 37 ° С. Аккуратно водоворот, пока клеточная суспензия не оттаивали и лишь небольшой кристалл льда остается в центре флакона. Вытрите флакон одноразового использования без ворса протрите и стерилизовать с 70% этанола.
- В стерильной капот культуры ткани удалить размороженные клетки с использованием наконечника P1000 от криопробирку и передачи до 10 см блюдо, полученного в 4.1.1).
- Поместите 10 см блюдо в 37 ° С увлажненным культивирования клеток инкубаторе с 5% CO 2 и равномерно распределить клетки, осторожно перемещая пластину спереди назад, затем из стороны в сторону. Разрешить клеткам прикрепляться к пластине O / N или, по меньшей мере, 6 ч.
- Первое, на следующее утро контрольные клетки для крепления с использованием светлого поля микроскопа. Некоторые остатки клеток и мертвые клетки будут наблюдаться в средствах массовой информации. Это нормально. Аспирируйте средств массовой информации из блюд и заменить 10 мл свежей средой MESC.
- Продолжайте менять СМИ на клетки каждый день, чтобы предотвратить дифференцировку.
- Пассаж клетки при 60-70% сплошности. Подготовка клеток для пассирования аспирационных СМИ и промывкой 5 мл стерильного 1X ДЗФР без MgCl 2 и CaCl 2. Добавить 2 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
- В то время как клетки инкубирования, готовят новый 10 см блюдо аспирационных раствор желатина и добавлением 10 мл RT MESC сред. Через 5 мин проверить клетки для отряда. Если клетки остаются прикрепленными, продолжают инкубировать при 37 ° С в течение 2 мин, в то время, пока полностью не отсоединена.
- Quench трипсин-ЭДТА, добавив 3 мл мЭСК сред. Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужную пробирку и спина при 200g в течение 5 минут, чтобы осадить. Аспирируйте средств массовой информации из гранул и повторно приостанавливать в 10 мл MESC СМИ.
- В зависимости от желаемого соотношения разделенному добавить 0.5-1.0 мл суспензии клеток в каждую чашку, полученного на стадии 4.2.2). Поместите блюдо в инкубаторе и равномерно распределить клетки, осторожно двигая задом наперед, то из стороны в сторону. ВсеOW клеткам прикрепляться O / N или, по крайней мере, 12 ч.
Примечание: Раскол отношение 1:10 - 1:20 является общим для большинства линий MESC. Это соотношение может изменяться в зависимости от используемой линии, номер пассажа, и желанной впадения на новое блюдо. Для передачи в 1:10 разделенного соотношении 1 мл суспензии клеток в 9 мл МЕСК сред и пластины в свежеприготовленной желатин покрытием 10 см чашку.
5. Получение эмбриональных телец
Примечание: Все операции, за исключением центрифугирования выполняются в стерильной капот культуры ткани.
- Получение суспензии клеток в EB СМИ
- При 70% сплошности (обычно 24-48 ч после прохода), используют клетки для образования EB. Подготовка клетки для формирования EB, отсоединив и гранулирование в соответствии с разделами 4.2.1) - 4.2.3).
Примечание: (. , Например, очень маленькая смерть клеток, не загрязняются, собственно морфологии) Лучше всего прохождения клеток по меньшей мере один раз после оттепели и проверки здоровья и устойчивый рост (е.г., население удвоений , происходящие каждые 24-48 ч) перед использованием для изготовления ЭТ. - Повторное приостановить осадок в 5 мл EB средах. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Развести клеточной суспензии в требуемом объеме EB СМИ , чтобы получить конечную концентрацию 25 клеток / мкл (или 2,5 × 10 3 клеток / мл). Обратите внимание, что каждая крышка чашки Петри содержит около 60 ЭТ и требует приблизительно 1,3 мл суспензии клеток. На этом этапе, подготовить достаточный объем клеточной суспензии, чтобы сформировать нужное количество ЭТ. Например, если 240 ЭТ необходимы для эксперимента, подготовить 5,2 мл на 2,5 х 10 3 клеток / мл.
Примечание: mESCs, которые не используются для формирования EB могут быть использованы для будущих экспериментов, крутя вниз, ресуспендирования в MESC средах и металлизированный, как описано в разделе 4.2.
- При 70% сплошности (обычно 24-48 ч после прохода), используют клетки для образования EB. Подготовка клетки для формирования EB, отсоединив и гранулирование в соответствии с разделами 4.2.1) - 4.2.3).
- Создание эмбриональных тельцах
- Готовят стерильные 10 см бактериальных чашках Петри для навешивания образования капель путем добавления 2 мл 1X PBS на дно еACH.
- Передача EB суспензии со стадии 5.1) в стерильную бассейне раствора.
- Удалить крышку с подготовленной чашек Петри и осторожно депонировать шестьдесят, 20 мкл капель ЕВ подвески на внутреннюю поверхность. Достигнуть это эффективно используя пипетку многоканальный оснащен 6 подсказок. Каждая капля 20 мкл теперь имеет 500 ячеек.
- Аккуратно поставьте крышку на нижнюю половину бактериальной чашку Петри, стараясь не смещать висячей капли. Поместите посуду в клеточной культуральной инкубаторе при температуре 37 С. После 2-х дней, клетки готовы запивать, как это описано в пункте 5.3).
- Смывных эмбриональных телец
Примечание: Все смывных этапы выполняются в стерильной капот культуры ткани.- Через 2 дня Е.Б. готовы к запивая и передавать до 6 см бактериальных чашках Петри. Предварительно теплые 3 мл ЕВ сред на чашку Петри до комнатной температуры. Каждый 6 см бактериальная чашку Петри может эффективно держать 2 крышки на сумму свисающих капель.
Примечание: Обязательно использовать непокрытые чашку Петри пили этот шаг (см таблицу материалов). Не используйте блюдо культуры ткани или любой другой поверхности, которая способствует клеточной адгезии. ЭТ должна оставаться взвешенными в средствах массовой информации, пока готов к высевают, как описано в разделе 6. - Удалить 10 см чашки Петри из инкубатора и помещают в стерильную капот культуры ткани. Осторожно снимите крышку с ЭТ и наклонить под углом 45 градусов.
- С помощью 5 мл серологической пипеткой, содержащую 3 мл РТ ЕВ сред, аккуратно мыть ЭТ в бассейн в нижней части крышки. Тщательно осмотрите крышку для ЭТ, скопившихся на поверхности и при необходимости вновь сполоснуть.
- После промывки все передачи ЭТ до 6 см чашку Петри.
- Повторите шаги 5.3.2) -5.3.4) для всех ЭТ. Каждый 6 см чашку Петри должна содержать ЭТ из двух 10 см крышками. Поместите все блюда обратно в инкубатор при 37 ° С в течение еще двух дней.
Примечание: ЭТ, которые слишком близко друг к другу в виде суспензии может держаться вместе и образуют крупные агрегаты. Это может негативно сказаться на эффективности сердечной дифференциацииа также значительно сократить число доступных ЭТ. Для предотвращения агрегации, ЭТ следует проверять каждый день и отделенный, осторожно двигая взад и вперед, а затем из стороны в сторону. Использование бактериальных блюд на ранних стадий дифференцировки необходимо, чтобы предотвратить прикрепление EB к блюду и позволит ЭТ расти в суспензии.
- Через 2 дня Е.Б. готовы к запивая и передавать до 6 см бактериальных чашках Петри. Предварительно теплые 3 мл ЕВ сред на чашку Петри до комнатной температуры. Каждый 6 см бактериальная чашку Петри может эффективно держать 2 крышки на сумму свисающих капель.
6. Покрытие и лечение ЭТ С Grem2
- Подготовка Grem2 среду обработки путем добавления достаточного объема запаса (0,5 мкг / мкл) Grem2 до комнатной температуры EB среды для окончательного разведения 1-5 мкг / мл.
Примечание: эффективная концентрация для лечения ЭТ варьирует в зависимости от клеточной линии и удельной активности текущей партии Grem2. Рекомендуется, чтобы перед использованием дозы титруют, чтобы найти максимальную эффективность. Для линии CGR8 MESC мы обычно используем 3-5 мкг / мл Grem2. Эффективные концентрации Grem2 для мерцательной поколения миоцитов будет производить быстро договаривающиеся клетки междудней 7-8, которые широко распространены во всем каждую лунку. Если заказчик фенотип не наблюдается в обработанных культурах рекомендуется Grem2 дозу титруют в пределах диапазона, указанного. - Подготовка 6-луночные планшеты для культуры ткани аспирацией желатиновый раствор для нанесения покрытия из каждой лунки и добавляя 2 мл RT Grem2 обработки сред. Удалить ЭТ из инкубатора и помещают в стерильную капот культуры ткани.
- Использование P1000 устанавливается на 100 мкл передаточных 30 ЭТ от 6 см чашках Петри в каждую лунку. Место ЭТ в инкубатор и равномерно расходиться, осторожно перемещая пластину задней стенки к передней, то из стороны в сторону.
- После того, как ЭТ присоединили к покрытые желатином скважин, заменить Grem2 СМИ каждые два дня до 10-й день После 10-й день, не прекратить лечение Grem2 и добавить свежие СМИ EB каждые два дня, чтобы сохранить здоровые клетки.
Примечание: После установки ЭТ будет выравниваться вдоль поверхности пластины с покрытием.
- После того, как ЭТ присоединили к покрытые желатином скважин, заменить Grem2 СМИ каждые два дня до 10-й день После 10-й день, не прекратить лечение Grem2 и добавить свежие СМИ EB каждые два дня, чтобы сохранить здоровые клетки.
7. Ячейка диссоциация для RT-КПЦР Analyсестренка
- Cell диссоциация с трипсин-ЭДТА
- Аспирируйте СМИ из каждой лунки и промыть в два раза с 1 мл на лунку стерильной ДЗФР минус Са 2+ и Mg 2+.
- Добавить 0,5 мл 0,25% стерильного раствора трипсина-ЭДТА в каждую лунку, из которой будут собраны клетки.
- Поместите планшет в инкубаторе при 37 ° С в течение 5 мин.
- Через 5 мин контрольных клеток для диссоциации. Если клетки по-прежнему остаются прикрепленными к нижней части крана так осторожно, чтобы ослабить. Если постукивание не ослабляет клетки, поместить обратно в инкубатор и контролировать каждые 2 мин до тех пор, пока клетки не полностью отсоединена.
- Нейтрализовать раствор трипсин-ЭДТА, добавляя 0,5 мл ЭБ носитель в каждую лунку.
- Передача целых 1 мл клеточной суспензии в центрифужную пробирку на 1,5 мл микро.
- Гранул клетки, крутя в настольной центрифуге в течение 5 мин при 300 х г.
- Аспирируйте средств массовой информации из гранул и переходите к лизису немедленно или магазин гранулы при температуре -70 ° С до готовности к лизису. Long-терм для хранения гранул не рекомендуется, поскольку это может привести к деградации РНК.
- Лизис клеток и Молекулярный анализ
- В этот момент клетки готовы к выделения РНК с использованием набора для промышленного извлечения колонки или с использованием реагента для экстракции РНК в соответствии с протоколами, поставляемых производителями (см таблицу материалов). После выделения, обратной транскрипции РНК и используют кДНК для анализа RT-КПЦР с использованием стандартных методик 20, 21.
Примечание: праймеры, используемые этой лаборатории для RT-КПЦР приведены в таблице 1. Мерцательная идентичности подтверждается с помощью комбинации RT-КПЦР посмотреть на экспрессию предсердных и желудочковых генов и электрофизиологии для записи продолжительности потенциала действия (см раздел 8). Выбор генов включен в данном протоколе в качестве примера надежных предсердных и желудочковых маркеров. Более подробную информацию о предсердной и желудочковой экспрессии генов в контексте плюрипотентных дифференцировки стволовых клеток находится в ссылке 14. </ Li>
- В этот момент клетки готовы к выделения РНК с использованием набора для промышленного извлечения колонки или с использованием реагента для экстракции РНК в соответствии с протоколами, поставляемых производителями (см таблицу материалов). После выделения, обратной транскрипции РНК и используют кДНК для анализа RT-КПЦР с использованием стандартных методик 20, 21.
8. Электрофизиологические анализ
- Cell диссоциация с коллагеназы
- Вытяжку СМИ из каждой лунки и дважды полоскание с 1 мл на лунку стерильной PBS.
- Добавить 0,5 мл 1 мг / мл раствора коллагеназы в каждую лунку.
- Поместите планшет в инкубаторе при 37 ° С в течение 10 мин.
- Через 5 мин контрольных клеток для диссоциации. Если клетки по-прежнему остаются прикрепленными друг к другу или в нижней части крана хорошо осторожно, чтобы ослабить. Далее диссоциируют клетки нежным растиранием с P1000.
Примечание: Для облегчения патч зажим клетки короткую запись должна быть тщательно растирают до одноклеточного подвеска не будет достигнута. - Добавить 0,5 мл EB СМИ в каждую лунку и перемешать с помощью пипетки.
- Передача целых 1 мл клеточной суспензии в центрифужную пробирку на 1,5 мл микро.
- Гранул клетки, крутя в настольной центрифуге в течение 5 мин при 300 х г.
- Аспирируйте средств массовой информации из клеточных гранул.
- Повторное приостановить клетки в 500мкл PBS с добавлением 10% FBS, будучи уверенным, что растирают в суспензии отдельных клеток.
- Электрофизиологические характеристика.
Примечание: Многие отличные протоколы были опубликованы в журнале об использовании одного зажима ячейки патч для измерения клеточной мембраны потенциалов. Для получения более подробной информации о том , как выполнить один патч ячейки зажать начинающему отсылаем читателя к этим протоколам 21-24. Ниже содержится конкретная информация по этому протоколу, который поможет опытный электрофизиолог подготовить и обработать MESC полученные CMs для подтипа характеристик.- Подготовить внутриклеточный решение для записи, состоящий из следующих действий: 10 мМ HEPES буфера, 5 мМ MgATP, 2 мМ EGTA, 110 мМ глутамата калия, 10 мМ KCl и 10 мМ NaCl. Отрегулировать раствор до рН 7,2 с использованием NaOH.
- Готовят внеклеточном отведении (Bath) раствор , состоящий из следующих действий : 2 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5,4 мМ КСl, и 137мМ NaCl. Отрегулировать раствор до рН 7,4 с использованием NaOH.
- Приготовьте стеклянную пипетку, который измеряет 2-5 сопротивление МОм при заполняли раствором записи с использованием стандартного боросиликатного стекла с нитью.
- Передача 100 мкл взвешенных клеток в записи камеру, содержащую внеклеточный раствор записи с помощью Р200.
Примечание: Ячейки могут быть исправлен в суспензии или, чтобы облегчить обработку и использование для лечения наркозависимости и / или перфузионных анализов, могут быть посеяны на покровное покрытием желатина, как указано в 8.2.5). - Подготовить желатин покрытием покровные стекла, помещая 10 мм диаметр покровного стекла в каждую лунку 6-луночного планшета и покрытие раствора желатина, как описано в разделе 3.1) этого протокола.
- После того, как по меньшей мере 30 мин раствор аспирата желатина и добавляют 100 мкл взвешенных клеток непосредственно в покровное и поместить всю 6-луночного планшета в инкубаторе в течение по крайней мере 2 ч или до клетки прилагается. После того, как клетки прикреплены, галить крышка скольжения и место в записи камеры с внеклеточной решение для записи.
Примечание: При использовании αMHC-DsRed флуоресцентный сердца репортер MESC линии, КМВ могут быть идентифицированы по их красных флуоресцентных ядер. Если не использовать сердечный репортер линии, спонтанно договаривающиеся клетки можно наблюдать и изолированы для измерений. Плюрипотентных стволовых клеток, полученную CMs, как правило, меньше и более округлые, не имеющего характерного прямоугольной морфологии полностью сформированным взрослых кардиомиоцитов.
- После того, как по меньшей мере 30 мин раствор аспирата желатина и добавляют 100 мкл взвешенных клеток непосредственно в покровное и поместить всю 6-луночного планшета в инкубаторе в течение по крайней мере 2 ч или до клетки прилагается. После того, как клетки прикреплены, галить крышка скольжения и место в записи камеры с внеклеточной решение для записи.
- Сделайте все записи при 37 ° С. Заплата отдельные клетки, используя весь зажим ячейки в режиме ток-зажим с боросиликатного стекла пипеткой 2-5 МОм сопротивления. Используйте нежный отрицательного давления для достижения gigaohm уплотнения до начала получения доступа всей клетки. Применяют быстрое отрицательное давление для разрыва мембраны и получить весь доступ клеток до записи мембранных потенциалов.
- Вызывание потенциалы действия с использованием 4 мс деполяризующими текущие инъекции.
ЗАМЕТКА:Для PSC-производного CMs количество ток, необходимый для запуска воспроизводимо потенциалы действия могут различаться. Для того чтобы найти оптимальный пороговый ток, начинают при относительно низком токе и увеличение амплитуды тока срабатывания ступенчато до тех пор, пока не будут получены воспроизводимые потенциалов действия.
Примечание: Действие потенциальные длительностей Grem2-индуцированных предсердных миоцитов обычно находятся в диапазоне 20-40 мс и отсутствие фазы плато (Фиг.6В).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
До дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток должен быть компактным и свободным от спонтанной дифференцировки. Клетки , показанные на рисунке 1А будут готовы к singularized и используется для подвешивания капель , как описано в 5.1 раздела протокола. Клетки , показанные на фигуре 1В спонтанно дифференцирующий и не должны быть использованы для приготовления висячей капли.
Панели На Рисунке 2 показаны успешно образовавшиеся ЭТ при разграничении день 2. ЭТ качества обычно образуют лучшее в пределах равномерно, хорошо округлены висячей капли , как показано на рисунке 2. Дифференциацией день 2, ЭТ должна быть видна невооруженным глазом в виде сферических механизмов дифференцироваться стволовые клетки на концах свисающих капель (рисунок 2). Эти ЭТ готовы к смывных, как описано в пункте 5.3 раздела протокола.
В течение 2-4 дней, промывают вниз ЭТ в виде суспензии должна продолжать увеличиваться в размерах. На 4 -й день, хорошо образованные ЭТ должны быть свободно плавающие и однородные по размеру и форме (рисунок 3). В ЭТ , показанные на рисунке 3 готовы к передаче на предварительно покрытых пластин и обрабатывают Grem2 , как описано в 6.1-6.3 раздела протокола.
После того, как гальваническим, ЭТ должна выравниваться, как клетки мигрируют из ЭБ на поверхность тканевой культуры пластины. Показанный на рисунке 4 приведены примеры правильно присоединенными ЭТ при разграничении дни 8 (левая панель) и 10 (правая панель). Клетки должны продолжать контролировать ежедневно, чтобы убедиться, что они остаются прикрепленными и для проверки сердечной дифференциации, как описано ниже.
Договаривающиеся клетки, что указывает на присутствие КМВ, может наблюдаться уже в день6 и, как в конце дня 9. Как правило, договаривающиеся клетки будут присутствовать на 8-й день дифференцировки. Числа договаривающаяся клеток в каждую лунку должны продолжать расти через дифференциацию день 14. В необработанной контрольные лунки наблюдаются небольшие, медленно договаривающиеся патчи (видео S1), а в Grem2 обработанных скважин большие участки с относительно высокой скоростью заключения контрактов являются общими ( Видео S2). Время от времени, сердечной дифференциации не происходит. В таких случаях выбор времени лечения Grem2, активность белка, и состояние клеток, предшествующих дифференциации должны быть пересмотрены, чтобы быть уверенным, что каждое из этих условий оптимизируется, как описано в данном протоколе (обсуждение см).
На рисунке 5 показаны результаты , типичные для Grem2 обработанных культур и необработанных контрольных. RT-КПЦР анализ экспрессии генов в клетках, собранных и лизированных, как описано в 7,1-7,2 секции протокола, как правило, показывают высокую LevELS сердечных структурных и регуляторных генов в Grem2 обработанных культур (рис 5А). Если клеточная линия αMHC-DsRed-Nuc используется, повышенный выход CMs можно наблюдать визуально как более высокие количества DsRed-меченых ядер в Grem2-обработанных скважин (Фиг.5В, нижняя панель).
В дополнение к генерации увеличение числа КМВ, лечение Grem2 также смещает дифференциации по отношению к предсердной как фенотипа. Предсердия фенотип обычно подтверждается двумя способами. Во- первых, RT-КПЦР анализ клеток , собранных как описано в 7,1-7,2 секции протокола должен показать , что гены , характерные для мерцательной КМВ активируются в то время как гены желудочков являются подавляются (рис 6А). Во-вторых, измерения патч зажим клеточного потенциала действия (как описано в 8,1-8,2 секции протокола) показывает, что короткий, мерцательная-подобный потенциал действия преобладает среди Grem2 treate D - клетки (рис. 6б)
Рисунок 1. Типичные Эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs). Плюрипотентных Эмбриональные стволовые клетки мыши до образования EB с характерным крупным ядром, компактной колониеобразующих морфологии (А, черные стрелки), и белые фазовые границы (A, оранжевые стрелки). Спонтанную дифференцировку ЭС клеток мыши обозначается более крупными, отдельных клеток , выделенных из колоний (B, черные стрелки) и потери фазовой границы вокруг колоний (B, оранжевая стрелка). Изображения получены с помощью перевернутого фазово-контрастного микроскопа. Масштабные столбики представляют 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. эмбриональных телец (ЭТ) на 2 -й день дифференцировки. Висячей капли , подвешенных в чашке Петри крышки (левая, Шкалы составляет 2 см) равномерно распределены и однородные по размеру. ЭТ в висячей капли наблюдаются в виде компактных сфер в центре каждой капли (справа, Шкалы составляет 1 мм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. ЭТ в виде суспензии в 4 -й день дифференцировки. Идеально ЭТ должна быть однородной по размеру и форме с минимальным соблюдением друг с другом или в нижней части пластины. Изображения были получены с использованием рассекает сферу в стерильных условиях. Шкала бар составляет 100 мкм.нагрузка / 53919 / 53919fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Типичная морфология EB после металлизации. Plated ЭТ в дни 8 (слева) и 10 (справа) дифференциации. Как ЭТ прикрепляются к желатинированная пластин, они сглаживаются и выглядят как плотные центры, окруженными все более сливающийся монослой клеток. Небольшие очаги заражения клеток, как правило, наблюдается около 6-8 дней дифференцировки вблизи центра EB. Эти карманы продолжают расширяться по всему протоколу дифференцировки, чтобы сформировать большие листы договаривающаяся клеток в окружающих монослоев. Изображения, снятые с использованием инвертированного микроскопа фазового контраста и. Масштабные столбики представляют 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.
Рисунок 5. Сердечная дифференциация в Grem2 обработанных и не обработанных контрольных лунок. КПЦР анализ кардиомаркеров указывает на увеличение экспрессии гена в сердечной ЭТ , обработанных Grem2 уже в шестой день и продолжается через 10 -й день дифференциации (А). Инженерных клеточная линия αMHC-DsRed-Nuc показывает большие бассейны DsRed-меченого CMs в культурах , обработанных Grem2 (B, внизу) против необработанными управления (B, вверху). Цифры адаптированы с разрешения 14. Усы представляют собой SEM по меньшей мере 3 экспериментов дублированных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
6 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Характеристика сердечной фенотипа мерцательной типа. Анализ КПЦР указывает на увеличение экспрессии генов предсердия и понижающей регуляции генов , ассоциированных с желудочковой CMs в Grem2 обработанных образцах (А). Контрольные культуры производят CMs с длительности потенциала действия характеристикой предсердных и желудочковых клеток в то время как лечение с Grem2 генерирует популяции клеток с короткой продолжительности потенциала действия характеристика предсердных миоцитов (В). Образцы сравнивали с использованием критерия Стьюдента. *, Р <0,05; *** Р <0,001 Цифры адаптированы с разрешения 14. Усы представляют собой SEM по меньшей мере 3 экспериментов дублированных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Видео S2. Grem2-обработанных скважин (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить) . Типичные результаты, наблюдаемые в Grem2-обработанных клетках. Большие участки быстро сокращающихся клеток наблюдаются по всему гальванопокрытием EB. Видео было принято на 10-й день дифференцировки.
| Ген | | Обратный праймер (5 'к 3') | |
| актин | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Таблица 1. Перечень последовательностей праймеров КПЦР. Грунтовка последовательности перечислены в алфавитном порядке по названию гена. Последовательности , при условии 5 'к 3' для всех проанализированных генов на рисунках 5 и 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обычно производит культур с высоким процентом CMs, которые характерны межпредсердной линии. Как и в случае с любым протоколом дифференциации, качество mESCs предшествующих дифференциации следует уделять особое внимание. mESCs необходимо регулярно контролировать для правильной морфологии (рис 1А). Любое спонтанной дифференцировки , что происходит до формирования ЭТ будет серьезно ограничить эффективность кардиогенеза и должны быть удалены до пересева (рис 1В). Размер EB также влияет на кардиогенез. Стартовые номера ячеек от 200 до 1000 в EB были протестированы и 500 клеток на ЕВ обычно производит наибольшее количество КМВ. Клетки, которые пассируют день до образования EB также, как правило, более эффективно дифференцировать.
Метод "висячей капли" используется для генерации ЭТ в этом протоколе 25. Другие способы изготовления ЭТ, используемых для сердечной дифференциации гаве было зарегистрировано 26-29. Метод "висячей капли" является простым и недорогим, легко приняты в любой лаборатории с оборудованием общей культуры клеток и материалов, и может быть проведена любым с опытом культивирования клеток. Кроме того, универсальный, производя ЭТ, которые могут быть легко манипулировать, перенесенные, с гальваническим или собранные для РНК-анализа в соответствии с потребностями исследователей. Кроме того, масштабируемая, производя маленькие или большие количества ЭТ по мере необходимости.
Протокол диктует покрытие ЭТ на желатиновых пластин, покрытых на 4-й день дифференцировки. Этот шаг преобразует дифференциации ЭТ в более типичном формате монослоя общей для культуры ткани. В некоторых случаях это может быть более удобным и или необходимо оставить ЭТ в виде суспензии, а не покрытие. Если суспензия ЭТ являются предпочтительными для последующих применений клетки могут быть оставлены в виде суспензии в течение всего процесса дифференцировки вместо посевом день 4. При лечении остроумиеч Grem2, то ЭТ помещают в 1,5 мл центрифужные пробирки и давали осесть под действием силы тяжести. Носитель затем осторожно удалить с помощью P1000, оставляя небольшое количество позади, чтобы предотвратить стремление к ЭТ, и 1,5 мл Grem2 носитель добавляют в пробирку. Эту суспензию затем переносили в 6 см чашку Петри и помещают обратно на 37 ° С. Средства массовой информации изменяется с использованием метода микро центрифуге трубки, указанной выше каждые два дня.
Дифференцировка день 4 был выбран для обработки клеток Grem2 на основе анализа экспрессии генов, как правило, связанных с основными событиями в развитии. Добавление Grem2 после пика экспрессии генов-маркеров гаструляции Т Brachyury и Cerberus, как 1, а в начале экспрессии кардиомаркеров клеток-предшественников, таких как Nkx2-5 имеет решающее значение для обоих кардиогенеза и предсердной спецификации. Поскольку пик экспрессии этих генов могут незначительно меняться в зависимости от клеточных линий рекомендуется контролировать экспрессию этих генов во время гifferentiation, чтобы определить оптимальные сроки для Grem2 добавления. Из линий испытываемых для этого протокола, наиболее поддавались лечению с Grem2 между днями 4 и 5 дифференциации.
Как и с любым рекомбинантного белка, активность Grem2 меняется от партии к партии. Поэтому рекомендуется Grem2 из той же партии используется для каждого набора экспериментов для обеспечения согласованности. Когда новый лот куплен, эффективность может быть оценена с помощью титрованием дозы в диапазоне 1-5 мкг / мл. Этот протокол дает CMs от мерцательной линии достаточного количества для анализа и культуры. Клетки, полученные с использованием этого протокола, могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, электрофизиологическое, РТ-КПЦР, или повторно культивируют для использования в анализах живых клеток. Для облегчения идентификации и выделения CMs после культивирования репортер линии αMHC-DsRed-Nuc был разработан и обычно используется нашей лабораторией.
Этот протокол использует сыворотку для поддержания здорового CEЛ.Л. культуры на протяжении всего процесса дифференциации. Хотя этот протокол обычно производит надежные, предсердия, как сердечная дифференциация, использование сыворотки вводит неопределенный элемент в процессе дифференцировки. Это может ограничить полезность протокола в тех случаях, когда требуется более определенной информации. Если требуется более определенный препарат средств массовой информации, в сыворотке крови может быть заменен KnockOut Serum Replacement 30. При переключении на определенной медиакультуру рекомендуется время и концентрация лечения Grem2 быть повторно оптимизированы, как уже описано в этом разделе.
RT-КПЦР используется для количественного определения экспрессии генов, специфичных для предсердных и желудочковых миоцитов. Лечение Grem2 приводит к индукции предсердных специфических генов, в то время как вниз регулирования или не влияя на экспрессию генов, желудочковые. Этот результат является типичным для Grem2-индуцированных CMs. Предлагаемый набор генов для оценки предсердии идентичности включен в данном протоколе. Расширенный набор геновs и обсуждение их значимости можно найти в работах , на которые ссылается этим протоколом 14,16. По мере того как поле продолжает развиваться и наше понимание сердечной дифференциации улучшает рекомендуется, чтобы этот список предсердных и желудочковых маркеров идентичности оценивается и пересматривается по мере необходимости.
Генерирующие однородные культуры КМВ будет способствовать клинических исследовательских усилий, направленных на заболеваниях как известно, влияют специфические подтипы сердечные и обеспечивают модели системы для фундаментальных исследований, направленных на понимание механизмов спецификации камеры в сердцах позвоночных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH гранты HL083958 и HL100398 (АХ) и 2T32HL007411-33 "Программа в Сердечно-сосудистые механизмы: Обучение в расследовании" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
