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Developmental Biology

बीएमपी विरोधी Grem2 का प्रयोग pluripotent स्टेम सेल से अलिंद cardiomyocytes के भेदभाव

Published: March 10, 2016 doi: 10.3791/53919
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

Abstract

स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes की आबादी पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, लेकिन ये आम तौर पर मिश्रित phenotypes की कोशिकाओं निकलेगा। विशिष्ट myocyte उपप्रकार को शामिल पढ़ाई में दिलचस्पी शोधकर्ताओं ने एक अधिक निर्देशित भेदभाव दृष्टिकोण की आवश्यकता है। Grem2, एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी विवो में आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है कि के साथ माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) का इलाज करके, एक आलिंद phenotype के साथ हृदय कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उत्पन्न किया जा सकता है। इंजीनियर Myh6-DsRed-Nuc स्टेम सेल लाइन का उपयोग पहचान, चयन, और cardiomyocytes की शुद्धि के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में embryoid निकायों फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग Myh6-DsRed-Nuc कोशिकाओं से उत्पन्न होता है और भेदभाव दिन 4 (D4) तक निलंबन में रखा जाता है। D4 कोशिकाओं को Grem2 के साथ इलाज किया और जिलेटिन लेपित प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। बीच D8-D10 बड़े करार क्षेत्रों और संस्कृतियों में मनाया जाता है और विस्तार करने के लिए जारी कर रहे हैं MD14 के माध्यम से ature। आण्विक, ऊतकीय और electrophysiogical विश्लेषण से संकेत मिलता Grem2 इलाज कोशिकाओं में कोशिकाओं आलिंद की तरह आलिंद cardiomyocytes के जीव विज्ञान और विभिन्न औषधीय एजेंटों के लिए उनकी प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल उपलब्ध कराने विशेषताओं के अधिग्रहण।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने और कोशिकाओं को विशेष रूप से मानव 1-5 में बुनियादी अनुसंधान और पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल ऊतकों की एक मेजबान से अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। विकास के संकेत दे रास्ते के समुचित मॉडुलन वांछित प्ररूपी भाग्य के लिए स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव प्रत्यक्ष कर सकते हैं। कई प्रोटोकॉल स्टेम कोशिकाओं 6-14 से cardiomyocytes (सीएम) उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है। इन प्रोटोकॉल आम तौर पर TFGβ superfamily (Activin, बीएमपी, और TGFβ) और Wnt बहिर्जात वृद्धि कारक है और / या छोटे अणुओं 10,12-15 के समय पर इसके माध्यम से रास्ते के मॉडुलन शामिल है। इन प्रोटोकॉल कोशिकाओं है कि मुख्यमंत्रियों बनने का प्रतिशत बढ़ाने के आम तौर पर प्रभावी रहे हैं, लेकिन विशिष्टता की कमी है, आलिंद, वेंट्रिकुलर, और नोडल / चालन प्रणाली प्रजातियों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी पैदा होता है। विशिष्ट हृदय अध्ययन करने के लिए एक अधिक निर्देशित भेदभाव appro उपप्रकारACH आवश्यक है।

Gremlin2 (Grem2, यह भी कहा जाता प्रोटीन दान और Cerberus या PRDC कम करने के लिए से संबंधित) एक स्रावित बीएमपी प्रतिपक्षी zebrafish 16 में हृदय के विकास के दौरान उचित हृदय भेदभाव और आलिंद चैम्बर गठन के लिए आवश्यक है। भेदभाव दिन 4 में Grem2 के साथ फर्क भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इलाज, बस mesodermal मार्कर टी Brachyury और 1 की तरह Cerberus के शिखर अभिव्यक्ति के बाद, सीएमएस की पैदावार बढ़ जाती है और आलिंद वंश 14 के मुख्य रूप से कोशिकाओं का एक पूल उत्पन्न करता है।

संयोजक Grem2 फर्क कोशिकाओं के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है और मानक प्रोटीन के उत्पादन की तकनीक 17 का उपयोग किया जा सकता है या व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है। यह जलीय समाधान में अत्यधिक घुलनशील है और वांछित समय बिंदु पर संस्कृतियों के लिए exogenously जोड़ा जा सकता है।

भेदभाव RT-qPCR का उपयोग कर मार्करों प्रतिनिधि की अभिव्यक्ति यों तो लगाया जा सकता हैहृदय progenitors, हृदय progenitors, और प्रतिबद्ध मुख्यमंत्रियों की। इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी पहचान करने और हृदय प्रकार की कोशिकाओं के स्थानिक वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अनुप्रयोग है कि शुद्ध आबादी की आवश्यकता होती है और अधिक आसानी से जब एक संवाददाता प्रणाली का उपयोग करते हुए की पहचान करने और मुख्यमंत्रियों को अलग-थलग करने के लिए किया जाता है। इस प्रयोजन के लिए, हम αMHC-DsRedNuc माउस CGR8 ते सेल लाइन का निर्माण 14 में शुरू की है। CGR8 कोशिकाओं के विकास और फीडर कोशिकाओं के बिना pluripotent रहते हैं, विस्तार और भेदभाव assays 18 की सुविधा। ते सेल लाइन हृदय-विशिष्ट अल्फा मायोसिन भारी चेन (एमएचसी या Myh6 α) जीन प्रमोटर के तहत एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत के साथ एक DsRed फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम में शामिल है। इन कोशिकाओं का उपयोग करना, सीएमएस आसानी से पहचान की और मात्रा का ठहराव, सेल छँटाई, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, दवा स्क्रीन, आलिंद और भेदभाव के तंत्र के अध्ययन के लिए अलग किया जा सकता है।

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Protocol

1. सेल संस्कृति मीडिया, समाधान, और अभिकर्मकों की तैयारी।

  1. (MESC) मिश्रण और बाँझ छानने (0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार) 445 मिलीलीटर ग्लासगो न्यूनतम आवश्यक मध्यम (GMEM), 50 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) द्वारा मीडिया माउस भ्रूणीय स्टेम सेल की 500 मिलीलीटर की तैयारी 5 मिलीलीटर 100X केंद्रित एल glutamine प्रतिस्थापन, 5 μl पुनः संयोजक माउस लेकिमिया निरोधात्मक कारक (LIF) मिलीलीटर प्रति 1 10 x 7 इकाइयों, और 1.43 μl एसएस Mercaptoethanol (अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोन है) पर। 4 सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।
  2. 391 मिलीलीटर मिश्रण और बाँझ छानने से embryoid शरीर (ईबी) भेदभाव मीडिया की 500 मिलीलीटर की तैयारी Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM), 100 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय FBS, 5 मिलीलीटर 100X एल Glutamine प्रतिस्थापन ध्यान केंद्रित किया, 5 मिलीलीटर 100X केंद्रित गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), और 2.86 μl एसएस Mercaptoethanol (अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन है)। तैयार है जब तक 4˚ सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग करने के लिए।
  3. 0.2% w तैयारफ़िल्टर के 500 मिलीलीटर के साथ 1 ग्राम सुअर त्वचा जिलेटिन पाउडर के मिश्रण से जिलेटिन की / वी समाधान, आसुत एच 2 ओ autoclaving द्वारा जीवाणुरहित। ध्यान दें कि जिलेटिन आरटी पर पानी में पूरी तरह से घुलनशील नहीं हो सकता। जिलेटिन autoclaving के बाद पूरी तरह से भंग कर दिया जाना चाहिए। आरटी पर दुकान का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।
  4. 100 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 0.1% BSA के साथ पूरक एक 0.5 माइक्रोग्राम / μl शेयर समाधान बनाने के लिए lyophilized Grem2 के 50 माइक्रोग्राम गोली भंग द्वारा Grem2 पुनः संयोजक प्रोटीन aliquots तैयार करें। पर -80˚ सी अशेष पांच बाँझ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में इस शेयर समाधान के 20 μl और दुकान तैयार है जब तक का उपयोग करने के लिए।
  5. प्रकाशित प्रोटोकॉल या एक 10X शेयर के रूप में खरीद के अनुसार पीबीएस को तैयार है और फ़िल्टर, आसुत एच 2 ओ के साथ काम कर रहा 01:10 पतला कमजोर पड़ने 19 एक 1X बनाने के लिए। उपयोग करने से पहले autoclaving द्वारा पीबीएस जीवाणुरहित। आरटी पर दुकान का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक। कुछ चरणों में, DPBS सीए 2 और 2 + मिलीग्राम बिना प्रयोग किया जाता है। इस पु हैएक 1X समाधान के रूप में rchased। आदेश की जानकारी अभिकर्मकों की तालिका में शामिल है।

2. जिलेटिन की तैयारी लेपित 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन

  1. एक निष्फल टिशू कल्चर हुड में कोटिंग के लिए प्रत्येक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश के लिए 0.2% जिलेटिन समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए या 4 दिनों के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में रखें व्यंजन।

3. जिलेटिन की तैयारी लेपित 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें

  1. एक निष्फल टिशू कल्चर हुड में एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए 0.2% जिलेटिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए या 4 दिनों के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में जगह प्लेटें।

4. भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति

  1. विगलन mESCs
    1. एक निष्फल टिशू कल्चर हुड में आरटी के लिए वार्मिंग से mESC मीडिया तैयार करें। एक जिलेटिन लेपित 10 सेमी डिश के लिए 10 मिलीलीटर आरटी मीडिया जोड़ें।
    2. लगभग 1 एक्स 10 6 से कोशिकाओं से युक्त mESCs की 1 शीशी निकालेंcryostorage। चिमटे, एक 37 सेल्सियस पानी के स्नान में जगह के साथ cryovial पकड़े। भंवर धीरे जब तक सेल निलंबन thawed किया है और केवल एक छोटा सा बर्फ क्रिस्टल शीशी के केंद्र में रहता है। साथ शीशी बंद सूखी एक डिस्पोजेबल प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे और 70% EtOH के साथ बाँझ।
    3. एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में cryovial से एक P1000 टिप का उपयोग कर thawed कोशिकाओं को हटाने और 4.1.1 में तैयार 10 सेमी पकवान) के लिए स्थानांतरण।
    4. 10 सेमी पकवान 5% सीओ 2 के साथ 37 सी humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें और समान रूप से धीरे वापस करने के लिए प्लेट सामने ले जाकर कोशिकाओं को वितरित, तो पक्ष की ओर। कोशिकाओं थाली करने के लिए हे / एन या कम से कम 6 घंटा संलग्न करने की अनुमति।
    5. पहली बात कुर्की के लिए अगली सुबह चेक कोशिकाओं को एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग। कुछ सेल मलबे और मृत कोशिकाओं को मीडिया में मनाया जाएगा। यह सामान्य बात है। व्यंजन से महाप्राण मीडिया और 10 मिलीलीटर ताजा mESC मीडिया के साथ बदलें।
    6. कोशिकाओं पर हर दिन मीडिया को बदलने के भेदभाव को रोकने के लिए आगे बढ़ें।
  2. पारित होने कोशिकाओं जब 60-70% मिला हुआ। मीडिया aspirating और 2 MgCl और 2 CaCl बिना 5 मिलीलीटर बाँझ 1X DPBS के साथ rinsing द्वारा passaging के लिए कोशिकाओं को तैयार। 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin EDTA समाधान जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में रखें।
  3. कोशिकाओं incubating रहे हैं, जिलेटिन समाधान श्वास और आरटी mESC मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़कर नया 10 सेमी पकवान तैयार करते हैं। 5 मिनट के बाद सेना की टुकड़ी के लिए कोशिकाओं की जाँच करें। कोशिकाओं संलग्न रहते हैं, तो एक बार में 2 मिनट के लिए 37 सेल्सियस पर सेते हैं जब तक पूरी तरह से अलग जारी है।
  4. mESC मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़कर बुझाना trypsin-EDTA। 5 मिनट के गोली के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण। गोली से महाप्राण मीडिया और 10 मिलीलीटर mESC मीडिया में फिर से निलंबित।
  5. वांछित विभाजन अनुपात पर निर्भर करता है,) चरण 4.2.2 में तैयार प्रत्येक पकवान सेल निलंबन के 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर में पकवान प्लेस और समान रूप से धीरे आगे से पीछे तो पक्ष की ओर ले जाकर कोशिकाओं वितरित। सबओउ कोशिकाओं संलग्न करने के लिए हे / एन या कम से कम 12 घंटे के लिए।
    नोट: 1:10 के अनुपात विभाजन - 1:20 सबसे mESC लाइनों के लिए आम बात है। इस अनुपात इस्तेमाल लाइन, बीतने संख्या, और नए पकवान पर वांछित संगम के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। 1:10 विभाजन अनुपात एक नया तैयार जिलेटिन लेपित 10 सेमी पकवान में 9 मिलीलीटर mESC मीडिया में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर हस्तांतरण और थाली के लिए।

5. embryoid निकायों की तैयारी

नोट: centrifugation को छोड़कर सभी चरणों का एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. ईबी मीडिया में सेल निलंबन की तैयारी
    1. 70% confluency (आमतौर पर 24-48 घंटे बाद पारित होने) पर, ईबी गठन के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें। 4.2.3) - detaching और वर्गों 4.2.1) के अनुसार pelleting द्वारा ईबी गठन के लिए कोशिकाओं को तैयार।
      नोट: (। उदाहरण के लिए, बहुत कम कोशिका मृत्यु, कोई प्रदूषण, उचित आकृति विज्ञान) यह पारित होने कोशिकाओं कम से कम एक समय के बाद पिघलना करने के लिए सबसे अच्छा है और स्वास्थ्य के लिए जाँच करें और मजबूत वृद्धि (ई।जी।, जनसंख्या दोहरीकरण हर 24-48 घंटा होने वाली) से पहले ईबीएस बनाने के लिए उपयोग करने के लिए।
    2. 5 मिलीलीटर ईबी मीडिया में गोली फिर से निलंबित। एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    3. ईबी मीडिया के लिए आवश्यक मात्रा में सेल निलंबन पतला 25 कोशिकाओं / μl (या 2.5 x 10 3 कोशिकाओं / एमएल) के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए। ध्यान दें कि एक पेट्री डिश में से प्रत्येक के ढक्कन के बारे में 60 ईबीएस रखती है और सेल निलंबन के बारे में 1.3 मिलीलीटर की आवश्यकता है। इस चरण में, सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा तैयार ईबीएस की वांछित संख्या उत्पन्न करने के लिए। उदाहरण के लिए, यदि 240 ईबीएस प्रयोग के लिए आवश्यक हैं, 2.5 x 10 3 कोशिकाओं / एमएल में 5.2 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
      नोट: mESCs कि ईबी गठन के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे नीचे कताई, mESC मीडिया में फिर से निलंबित और धारा 4.2 में वर्णित के रूप में चढ़ाना द्वारा भविष्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. Embryoid निकायों के निर्माण
    1. ई की तह तक 1X पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़कर बाँझ 10 सेमी बूंद गठन फांसी के लिए जीवाणु पेट्री डिश तैयारआक।
    2. एक बाँझ समाधान बेसिन के लिए 5.1 कदम से ईबी निलंबन) हस्तांतरण।
    3. तैयार पेट्री डिश से ढक्कन निकालें और ध्यान भीतरी सतह पर साठ, 20 ईबी निलंबन की μl बूँदें जमा। यह पूरा कुशलता से एक मल्टी चैनल pipet 6 सुझावों के साथ फिट का उपयोग कर। प्रत्येक 20 μl बूंद अब 500 कोशिकाओं है।
    4. धीरे बूँदें फांसी को बेदखल करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा, बैक्टीरियल पेट्री डिश के नीचे आधे पर ढक्कन की जगह। 37˚ सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में बर्तन रखें 2 दिनों के बाद, कोशिकाओं नीचे धोने के लिए 5.3 में वर्णित के रूप में तैयार कर रहे हैं)।
  3. Embryoid निकायों के वाश-नीचे
    नोट: सभी को धो-नीचे चरणों का एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं।
    1. 2 दिनों के बाद ईबी और नीचे धोने के लिए तैयार कर रहे हैं और 6 सेमी बैक्टीरियल पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। आरटी के लिए पेट्री डिश प्रति ईबी मीडिया के पूर्व गर्म 3 मिलीग्राम। प्रत्येक 6 सेमी बैक्टीरियल पेट्री डिश को प्रभावी ढंग से बूंदों की फांसी के लायक 2 पलकों पकड़ कर सकते हैं।
      नोट: एक गैर लेपित पेट्री डिश एफ का उपयोग सुनिश्चित करेंया इस कदम (सामग्री तालिका देखें)। एक टिशू कल्चर पकवान या किसी अन्य सतह कि कोशिका आसंजन को प्रोत्साहित करती प्रयोग न करें। धारा 6 में वर्णित के रूप में ईबीएस तैयार है जब तक मीडिया में निलंबित रहना चाहिए चढ़ाया जा सके।
    2. इनक्यूबेटर से 10 सेमी पेट्री डिश निकालें और बाँझ टिशू कल्चर हुड में जगह है। ध्यान से ईबीएस के साथ ढक्कन हटाने और एक 45 डिग्री के कोण पर झुकाव।
    3. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक आर टी ईबी मीडिया के 3 मिलीग्राम से युक्त pipet का प्रयोग, धीरे ढक्कन के नीचे एक पूल में ईबीएस धो लें। ध्यान से ईबीएस है कि सतह के लिए अटक कर रहे हैं और फिर से कुल्ला के लिए यदि आवश्यक हो तो ढक्कन का निरीक्षण किया।
    4. एक 6 सेमी पेट्री डिश के लिए सभी ईबीएस हस्तांतरण धोने के बाद।
    5. दोहराएँ सभी ईबीएस के लिए कदम 5.3.2) -5.3.4)। प्रत्येक 6 सेमी पेट्री डिश दो 10 सेमी पलकों से ईबीएस शामिल करना चाहिए। दो दिन के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में वापस सब बर्तन रखें।
      नोट: ईबीएस वह भी निलंबन में करीब एक साथ हैं एक साथ रहना और बड़े समुच्चय के रूप में हो सकती है। यह नकारात्मक हृदय भेदभाव दक्षता को प्रभावित कर सकतासाथ ही काफी उपलब्ध ईबीएस की संख्या कम हो। एकत्रीकरण को रोकने के लिए, ईबीएस प्रत्येक दिन की जाँच की जानी चाहिए और धीरे आगे और पीछे ले जाकर अलग कर दिया, तो पक्ष की ओर। जल्दी भेदभाव चरणों में बैक्टीरियल व्यंजन का उपयोग करने के लिए पकवान ईबी लगाव को रोकने और ईबीएस निलंबन में विकसित करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है।

6. चढ़ाना और Grem2 साथ ईबीएस का उपचार

  1. 1-5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए Grem2 आरटी ईबी मध्यम करने के लिए स्टॉक की पर्याप्त मात्रा (0.5 माइक्रोग्राम / μl) जोड़कर Grem2 उपचार के माध्यम से तैयार।
    नोट: ईबीएस के उपचार के लिए प्रभावी एकाग्रता सेल लाइन और Grem2 की वर्तमान बहुत की विशिष्ट गतिविधि पर निर्भर करता है। यह सिफारिश की है कि खुराक का उपयोग करने से पहले अधिक से अधिक प्रभावशीलता को खोजने के titrated है। CGR8 mESC लाइन के लिए हम नियमित रूप से 3-5 माइक्रोग्राम / Grem2 मिलीलीटर का उपयोग करें। आलिंद myocyte पीढ़ी के बीच तेजी से करार कोशिकाओं का उत्पादन होगा के लिए Grem2 के प्रभावी सांद्रतादिन में 7-8 कि अच्छी तरह से प्रत्येक भर में व्यापक हैं। ठेका phenotype इलाज संस्कृतियों में नहीं मनाया जाता है, तो यह सिफारिश की है कि Grem2 सीमा के भीतर संकेत दिया titrated जा खुराक।
  2. अच्छी तरह से प्रत्येक से जिलेटिन कोटिंग समाधान श्वास और आरटी Grem2 उपचार मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़कर 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें तैयार करें। इनक्यूबेटर से ईबीएस निकालें और बाँझ टिशू कल्चर हुड में जगह है।
  3. एक P1000 में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 6 सेमी पेट्री डिश से 100 μl हस्तांतरण 30 ईबीएस के लिए सेट का उपयोग करना। इनक्यूबेटर में और समान रूप से जगह ईबीएस धीरे से फैलाने थाली तो पक्ष की ओर आगे से पीछे घूम रहा है।
    1. बाद ईबीएस जिलेटिन लेपित कुओं से जुड़ी है, Grem2 मीडिया हर दो दिन में स्वस्थ कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए हर दो दिन की जगह 10 दिन के बाद से 10 दिन तक, Grem2 उपचार बंद करने और नए सिरे से ईबी मीडिया जोड़ें।
      नोट: संलग्न करने के बाद, ईबीएस लेपित थाली की सतह के साथ बाहर समतल करना होगा।

7. RT-qPCR analy के लिए सेल हदबंदीबहन

  1. Trypsin-EDTA के साथ सेल हदबंदी
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से महाप्राण मीडिया और बाँझ DPBS शून्य से सीए 2 और 2 मिलीग्राम + का अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं को एकत्र किया जाएगा, जिसमें से 0.5 मिलीलीटर 0.25% बाँझ Trypsin-EDTA समाधान जोड़ें।
    3. 5 मिनट के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में थाली रखें।
    4. हदबंदी के लिए 5 मिनट के चेक कोशिकाओं के बाद। धीरे ढीला करने के लिए कोशिकाओं को अभी भी अच्छी तरह से नल के नीचे से जुड़े रहते हैं। दोहन ​​कोशिकाओं को ढीला नहीं है, इनक्यूबेटर में वापस जगह और हर 2 मिनट पर नजर रखने के लिए जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 0.5 मिलीलीटर ईबी मीडिया जोड़कर Trypsin-EDTA समाधान बेअसर।
    6. एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन के पूरे 1 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    7. 300 x जी 5 मिनट के लिए एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में कताई द्वारा गोली कोशिकाओं।
    8. महाप्राण गोली से मीडिया और -70 सेल्सियस पर तुरंत सेल या दुकान गोली के लिए आगे बढ़ना सेल के लिए तैयार है जब तक। लंबे समय से आतंकवादछर्रों का मीटर भंडारण के रूप में इस शाही सेना की गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सिफारिश नहीं है।
  2. सेल और आणविक विश्लेषण
    1. इस बिंदु पर कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक स्तंभ निकासी किट का उपयोग कर या प्रोटोकॉल निर्माताओं द्वारा आपूर्ति के अनुसार शाही सेना निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें) आरएनए अलगाव के लिए तैयार हैं। एक बार अलग, रिवर्स लिखित शाही सेना और, मानक तकनीक का उपयोग करते हुए 20 21 RT-qPCR विश्लेषण के लिए सीडीएनए का उपयोग करें।
      नोट: RT-qPCR के लिए इस प्रयोगशाला द्वारा इस्तेमाल के लिए प्राइमर तालिका 1. अलिंद पहचान में सूचीबद्ध रिकॉर्ड कार्रवाई संभावित अवधि (धारा 8 देखें) आलिंद और निलय जीनों की अभिव्यक्ति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को देखने के लिए RT-qPCR का एक संयोजन का उपयोग कर पुष्टि की है। जीन का विश्वसनीय आलिंद और निलय मार्कर का एक उदाहरण के रूप में इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है। आलिंद और स्टेम सेल भेदभाव के संदर्भ में वेंट्रिकुलर जीन अभिव्यक्ति के बारे में अधिक जानकारी के संदर्भ में 14 पाया जाता है। </ Li>

8. electrophysiological विश्लेषण

  1. कोलेजिनेस साथ सेल हदबंदी
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से और बाँझ पीबीएस के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला से महाप्राण मीडिया।
    2. 1 मिलीग्राम प्रत्येक के लिए / एमएल collagenase समाधान के 0.5 मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें।
    3. 10 मिनट के लिए 37 सी में इनक्यूबेटर में थाली रखें।
    4. हदबंदी के लिए 5 मिनट के चेक कोशिकाओं के बाद। धीरे ढीला करने के लिए कोशिकाओं को अभी भी एक-दूसरे को अच्छी तरह से या नल के नीचे से जुड़े रहते हैं। इसके अलावा एक P1000 के साथ कोमल विचूर्णन द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना।
      नोट: जब तक एक एकल कोशिका निलंबन हासिल की है पैच दबाना रिकॉर्डिंग की सुविधा के लिए कोशिकाओं triturated किया जाना चाहिए।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर ईबी मीडिया जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण।
    6. एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन के पूरे 1 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    7. 300 x जी 5 मिनट के लिए एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में कताई द्वारा गोली कोशिकाओं।
    8. सेल छर्रों से महाप्राण मीडिया।
    9. फिर से निलंबित 500 में कोशिकाओं10% FBS के साथ पीबीएस μl, एक एकल कक्ष निलंबन में triturate के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है।
  2. Electrophysiological विशेषता।
    नोट: कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल एकल कोशिका पैच दबाना का उपयोग कोशिका झिल्ली क्षमता को मापने के लिए पर इस पत्रिका में प्रकाशित किया गया है। कैसे एक सेल पैच नौसिखिया पाठक दबाना प्रदर्शन करने के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए इन प्रोटोकॉल 21-24 में जाना जाता है। निम्नलिखित इस प्रोटोकॉल में मदद मिलेगी कि अनुभवी electrophysiologist तैयार करने और संभाल mESC उपप्रकार लक्षण वर्णन के लिए निकाली गई सीएमएस के लिए विशिष्ट जानकारी शामिल है।
    1. 10 मिमी HEPES बफर, 5 मिमी MgATP, 2 मिमी EGTA, 110 मिमी पोटेशियम ग्लूटामेट, 10 मिमी KCl, और 10 मिमी NaCl: intracellular रिकॉर्डिंग समाधान निम्न की रचना तैयार करें। NaOH का उपयोग 7.2 के पीएच का हल समायोजित करें।
    2. बाह्य रिकॉर्डिंग (स्नान) के बाद से बना समाधान तैयार: 2 मिमी HEPES, 10 मिमी ग्लूकोज, 1 मिमी MgCl 2, 2 मिमी 2 CaCl, 5.4 मिमी KCl, और 137मिमी NaCl। NaOH का उपयोग 7.4 के पीएच का हल समायोजित करें।
    3. एक गिलास pipet कि उपायों 2-5 MΩ प्रतिरोध जब रिकॉर्डिंग समाधान रेशा के साथ मानक borosilicate ग्लास का उपयोग कर के साथ backfilled तैयार करें।
    4. स्थानांतरण कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान के लिए एक P200 का उपयोग कर युक्त रिकॉर्डिंग कक्ष में निलंबित कोशिकाओं के 100 μl।
      नोट: कोशिकाओं को निलंबन में से समझौता होना सकता है या, हैंडलिंग सुविधा और दवा इलाज और / या छिड़काव assays के लिए उपयोग करने के लिए, एक जिलेटिन लेपित coverslip 8.2.5 में उल्लिखित के रूप में) onto वरीयता प्राप्त किया सकता है।
    5. 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक 10 मिमी व्यास गिलास coverslip रखने और इस प्रोटोकॉल की धारा 3.1 में वर्णित) जिलेटिन समाधान के साथ कवर द्वारा जिलेटिन लेपित गिलास coverslips तैयार करें।
      1. बाद में कम से कम 30 मिनट के महाप्राण जिलेटिन समाधान और सीधे निलंबित कोशिकाओं के 100 μl जोड़ने coverslip और कम से कम 2 घंटे के लिए या जब तक कोशिकाओं संलग्न है इनक्यूबेटर में पूरे 6 अच्छी तरह से थाली जगह है। बाद कोशिकाओं संलग्न है, rनिकालें कवर पर्ची और बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान के साथ चैम्बर की रिकॉर्डिंग में जगह है।
        नोट: αMHC-DsRed फ्लोरोसेंट हृदय संवाददाता mESC लाइन का उपयोग करते हैं, सीएमएस उनके लाल फ्लोरोसेंट नाभिक से पहचाना जा सकता है। एक हृदय संवाददाता लाइन का उपयोग नहीं करते हैं, तो अनायास करार कोशिकाओं मनाया और माप के लिए अलग किया जा सकता है। स्टेम सेल व्युत्पन्न मुख्यमंत्रियों आमतौर पर छोटे और अधिक गोल कर रहे हैं, पूरी तरह से बनाई वयस्क हृदय myocytes की विशेषता आयताकार आकृति विज्ञान कमी।
    6. 37 सी में सभी रिकॉर्डिंग बनाओ। 2-5 MΩ प्रतिरोध का एक borosilicate ग्लास pipet के साथ वर्तमान दबाना मोड में पूरे सेल दबाना का उपयोग एकल कक्षों पैच। gigaohm मुहर पूरे सेल पहुँच पाने के लिए पहले प्राप्त करने के लिए कोमल नकारात्मक दबाव का प्रयोग करें। झिल्ली टूटना और पूरे सेल पहुँच झिल्ली क्षमता रिकॉर्डिंग से पहले हासिल करने के लिए तेजी से नकारात्मक दबाव लागू करें।
    7. वर्तमान इंजेक्शन depolarizing 4 मिसे का उपयोग कर कार्रवाई की क्षमता आह्वान।
      ध्यान दें:पीएससी व्युत्पन्न सीएमएस के लिए वर्तमान की राशि reproducibly कार्रवाई क्षमता भिन्न हो सकते हैं गति प्रदान करने की आवश्यकता है। आदेश में इष्टतम सीमा वर्तमान खोजने के लिए, एक stepwise फैशन में एक अपेक्षाकृत कम मौजूदा और वृद्धि ट्रिगर वर्तमान आयाम पर शुरू होने तक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार्रवाई की क्षमता प्राप्त कर रहे हैं।
      नोट: कार्रवाई Grem2 प्रेरित आलिंद myocytes के लिए संभावित durations 20-40 एमएस की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं और एक पठार चरण (चित्रा 6B) की कमी है।

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Representative Results

भेदभाव करने से पहले, स्टेम कोशिकाओं कॉम्पैक्ट और सहज भेदभाव से मुक्त होना चाहिए। चित्रा 1 ए में दिखाया कोशिकाओं singularized और प्रोटोकॉल खंड के 5.1 में वर्णित के रूप में बूँदें फांसी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। चित्रा 1 बी में दिखाया कोशिकाओं अनायास फर्क कर रहे हैं और फांसी बूंदों की तैयारी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।

पैनलों भेदभाव दिन 2. गुणवत्ता ईबीएस में 2 शो सफलतापूर्वक गठन ईबीएस चित्रा में शामिल आम तौर पर सबसे अच्छा फार्म के भीतर समान रूप से स्थान दिया गया है, अच्छी तरह गोल फांसी के रूप में चित्रा 2 में दिखाया जाता है। भेदभाव दिन 2, ईबीएस गोलाकार व्यवस्था के रूप में नंगी आंखों से दिखाई जानी चाहिए फांसी बूँदें (चित्रा 2) के सुझावों पर स्टेम कोशिकाओं का फर्क। ये ईबीएस प्रोटोकॉल खंड के 5.3 में वर्णित के रूप में धोने से नीचे के लिए तैयार हैं।

दिन के दौरान 2-4, निलंबन में धोया-नीचे ईबीएस आकार में विकसित करने के लिए जारी रखना चाहिए। 4 दिन में, अच्छी तरह से बनाई ईबीएस मुक्त अस्थायी और आकार और आकृति (चित्रा 3) में सजातीय होना चाहिए। 3 चित्रा में दिखाया गया ईबीएस पूर्व में लिपटे करने के लिए प्लेटें और प्रोटोकॉल खंड के 6.1-6.3 में वर्णित के रूप में Grem2 साथ इलाज स्थानांतरित किया जा करने के लिए तैयार रहे।

एक बार चढ़ाया, ईबीएस के रूप में कोशिकाओं टिशू कल्चर प्लेट की सतह पर ईबी से बाहर की ओर पलायन को समतल करना चाहिए। भेदभाव दिन 8 (बाएं पैनल) और 10 (सही पैनल) पर ठीक से जुड़ी ईबीएस के उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है। प्रकोष्ठों दैनिक नजर रखी जा करने के लिए यकीन है कि वे संलग्न रहते हो सकता है और नीचे के रूप में वर्णित हृदय भेदभाव के लिए जाँच करने के लिए जारी रखना चाहिए।

कोशिकाओं करार, सीएमएस की मौजूदगी का संकेत है, दिन के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता है6 और 9 दिन आमतौर पर के रूप में के रूप में देर से, करार कोशिकाओं भेदभाव के 8 दिन पर उपस्थित रहेंगे। प्रत्येक में कोशिकाओं करार की संख्या में अच्छी तरह से भेदभाव दिन 14 के माध्यम से बढ़ाने के लिए गैर इलाज नियंत्रण कुओं छोटे, धीरे-धीरे करार पैच मनाया जाता है (वीडियो एस 1) Grem2 में जबकि कुओं बड़े धब्बे अपेक्षाकृत तेजी से करार दर के साथ इलाज आम हैं जारी रखना चाहिए ( वीडियो S2)। कभी कभी, हृदय भेदभाव घटित करने में विफल रहता है। ऐसे मामलों में Grem2 उपचार, प्रोटीन की गतिविधि, और कोशिकाओं भेदभाव करने से पहले की अवस्था के समय सुनिश्चित करें कि इन शर्तों में से प्रत्येक के इस प्रोटोकॉल (चर्चा देखने के लिए) में वर्णित के रूप में अनुकूलित है होना करने के लिए फिर से मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

चित्रा 5 शो Grem2 इलाज संस्कृतियों और अनुपचारित नियंत्रण के विशिष्ट परिणाम है। एकत्र की है और lysed कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की RT-qPCR विश्लेषण प्रोटोकॉल अनुभाग के 7.1-7.2 में वर्णित के रूप में आम तौर पर उच्च लेव का पता चलता हैGrem2 इलाज संस्कृतियों (चित्रा 5 ए) में हृदय संरचनात्मक और नियामक जीन की एल्स। ΑMHC-DsRed-Nuc सेल लाइन का इस्तेमाल किया जा रहा है, मुख्यमंत्रियों की वृद्धि की उपज Grem2 इलाज कुओं (चित्रा 5 ब, नीचे पैनल) में DsRed लेबल नाभिक की अधिक संख्या के रूप में नेत्रहीन मनाया जा सकता है।

मुख्यमंत्रियों की संख्या में वृद्धि पैदा करने के अलावा, Grem2 इलाज भी फेनोटाइप की तरह एक आलिंद के प्रति भेदभाव biases। आलिंद phenotype आमतौर पर दो तरह से पुष्टि की है। सबसे पहले, प्रोटोकॉल अनुभाग के 7.1-7.2 में वर्णित के रूप में प्रकट करना चाहिए कि आलिंद मुख्यमंत्रियों की विशेषता जीन जबकि वेंट्रिकुलर जीन downregulated कर रहे हैं (चित्रा 6A) upregulated रहे हैं एकत्र कोशिकाओं की RT-qPCR विश्लेषण। दूसरा, सेलुलर कार्रवाई संभावित अवधि (प्रोटोकॉल अनुभाग का 8.1-8.2 में वर्णित) के पैच दबाना माप से पता चलता है कि एक छोटी, आलिंद की तरह कार्रवाई संभावित Grem2 treate बीच predominates डी कोशिकाओं (चित्रा 6B)।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रतिनिधि माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs)। Pluripotent माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं विशेषता बड़े नाभिक, कॉम्पैक्ट कॉलोनी के गठन आकृति विज्ञान (ए, काला तीर), और सफेद चरण सीमाओं (ए, नारंगी तीर) के साथ ईबी गठन से पहले। माउस ES कोशिकाओं की सहज भेदभाव कालोनियों (बी, काला तीर) से अलग हो बड़ा, एकल कक्षों और कालोनियों के आसपास चरण सीमा के नुकसान (बी, नारंगी तीर) ने संकेत दिया है। छवियाँ एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 "> चित्र 2
चित्रा 2. embryoid निकायों (ईबीएस) भेदभाव के 2 दिन में। एक पेट्री डिश ढक्कन से निलंबित कर दिया बूँदें फांसी (बाएं, पैमाने बार 2 सेमी है) समान रूप से स्थान दिया गया है और आकार में सजातीय रहे हैं। फांसी बूंदों में ईबीएस एक बूंद के केंद्र में कॉम्पैक्ट क्षेत्रों के रूप में मनाया जाता है (सही, पैमाने बार 1 मिमी) है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. भेदभाव के 4 दिन में निलंबन में ईबीएस। आदर्श ईबीएस आकार में सजातीय हो सकता है और एक दूसरे के लिए न्यूनतम पालन या प्लेट के नीचे के साथ आकार चाहिए। छवियाँ बाँझ शर्तों के तहत एक विदारक गुंजाइश का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।लोड / 53919 / 53919fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
दिन पर। मढ़वाया ईबीएस चढ़ाना 8 (बाएं) और 10 भेदभाव के (दाएं) के बाद चित्रा 4. ठेठ ईबी आकृति विज्ञान। ईबीएस gelatinized प्लेटों के लिए देते हैं, वे बाहर समतल और कोशिकाओं की एक तेजी से मिला हुआ monolayer से घिरा के रूप में घने केन्द्रों दिखाई देते हैं। कोशिकाओं करार के छोटे जेब आम तौर पर ईबी के केंद्र के पास के आसपास भेदभाव दिनों 6-8 मनाया जाता है। इन इलाकों भेदभाव प्रोटोकॉल भर में विस्तार करने के लिए आसपास के monolayers में कोशिकाओं से ग्रस्त होने का बड़ा चादरें फार्म जारी है। छवियाँ एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया और। स्केल सलाखों 200 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

चित्रा 5
चित्रा 5. कार्डिएक Grem2 का इलाज और गैर इलाज नियंत्रण कुओं में भेदभाव। कार्डियक मार्कर की qPCR विश्लेषण के रूप में जल्दी छह दिन और भेदभाव (ए) के 10 दिन के माध्यम से जारी रखने के रूप Grem2 के साथ इलाज किया ईबीएस में हृदय जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि को दर्शाता है। इंजीनियर αMHC-DsRed-Nuc सेल लाइन Grem2 (बी, नीचे) बनाम गैर इलाज नियंत्रण (बी, ऊपर) के साथ इलाज संस्कृतियों में DsRed लेबल मुख्यमंत्रियों के बड़े पूल से पता चलता है। आंकड़े 14 से अनुमति के साथ अनुकूलित। त्रुटि सलाखों कम से कम 3 दोहराने के प्रयोगों से SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 6 आलिंद की तरह हृदय phenotype की विशेषता। QPCR विश्लेषण आलिंद जीन और Grem2 इलाज के नमूने (ए) में वेंट्रिकुलर सीएमएस के साथ जुड़े जीन के डाउनरेगुलेशन की अभिव्यक्ति में वृद्धि को दर्शाता है। नियंत्रण संस्कृतियों आलिंद और निलय कोशिकाओं की कार्रवाई संभावित अवधि विशेषता के साथ मुख्यमंत्रियों की उपज है, जबकि Grem2 के साथ इलाज के आलिंद myocytes (बी) के छोटे से कार्रवाई संभावित अवधि विशेषता के साथ सेल आबादी उत्पन्न करता है। नमूने छात्र टी परीक्षण का उपयोग की तुलना में थे। *, पी <0.05; ***, पी <0.001 आंकड़े 14 से अनुमति के साथ अनुकूलित। त्रुटि सलाखों कम से कम 3 दोहराने के प्रयोगों से SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो एस 1। गैर इलाज नियंत्रण कुओं (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। छोटे, धीरे-करार जेब या ईबी (सफेद तीर) की परिधि के आसपास हृदय myocytes के धब्बे। वीडियो भेदभाव दिन 10 में लिया गया।

वीडियो S2
वीडियो S2। Grem2 इलाज कुओं (Right डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) । ठेठ परिणाम Grem2 इलाज कोशिकाओं में मनाया। जल्दी से करार कोशिकाओं के बड़े धब्बे चढ़ाया ईबी भर में मनाया जाता है। वीडियो भेदभाव दिन 10 में लिया गया।

जीन रिवर्स प्राइमर (5 '3' के लिए)
एक्टिन CTACGAGGGCTATGCTCTCCC CCGGACTCATCGTACTCCTGC
GAPDH CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG
Gata4 ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA CTGCGATGTCTGAGTGACAGG
Gja1 ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG
Gja5 ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG
Myh6 TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT CACTATCTTCTTGAACTCAATGC
Myl2 AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT
Myl7 AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC
Nkx2.5 GTCTCAATGCCTATGGCTAC CTACGTCAATAAAGTGGGATG
Tnnt2 CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG CTCCATCGGGGATCTTGGGT

तालिका 1 qPCR प्राइमर दृश्यों की सूची। प्राइमर दृश्यों जीन नाम से वर्णानुक्रम में सूचीबद्ध हैं। दृश्यों आंकड़े 5 और 6 में विश्लेषण सभी जीनों के लिए '3' के लिए प्रदान की जाती हैं 5।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल नियमित तौर पर मुख्यमंत्रियों के एक उच्च प्रतिशत है कि आलिंद वंश के लक्षण हैं के साथ संस्कृतियों पैदा करता है। किसी भी भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, mESCs भेदभाव करने से पहले की गुणवत्ता पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। mESCs नियमित रूप से उचित आकारिकी (चित्रा 1 ए) के लिए निगरानी की जानी चाहिए। कोई भी सहज भेदभाव कि ईबीएस के गठन से पहले होता है गंभीर रूप से कार्डियोजेनेसिस की दक्षता को सीमित कर देगा और passaging (चित्रा 1 बी) के पहले हटा दिया जाना चाहिए। ईबी आकार भी कार्डियोजेनेसिस प्रभावित करता है। 200 और 1000 के बीच शुरू ईबी प्रति सेल नंबर परीक्षण किया गया है और ईबी प्रति 500 ​​कोशिकाओं नियमित तौर पर मुख्यमंत्रियों की सबसे अधिक संख्या पैदा करता है। प्रकोष्ठों उस दिन ईबी गठन से पहले passaged हैं भी और अधिक कुशलता से अलग करने के लिए करते हैं।

"फांसी ड्रॉप" विधि इस प्रोटोकॉल में 25 ईबीएस उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ईबीएस बनाने के लिए अन्य तरीकों हृदय भेदभाव हेक्टेयर के लिए इस्तेमाल कियाve 26-29 की सूचना दी गई। "फांसी ड्रॉप" विधि सरल और सस्ती है, आसानी से आम सेल संस्कृति उपकरण और सामग्री के साथ किसी भी प्रयोगशाला में अपनाया है, और सेल संस्कृति के अनुभव के साथ किसी के द्वारा आयोजित किया जा सकता है। यह भी बहुमुखी है, ईबीएस है कि आसानी से, चालाकी से किया जा सकता है का तबादला, चढ़ाया, या एकत्र आरएनए जांचकर्ताओं की जरूरतों के हिसाब से विश्लेषण के लिए का निर्माण किया। यह भी स्केलेबल है, जरूरत के रूप में ईबीएस की छोटी या बड़ी संख्या का निर्माण किया।

प्रोटोकॉल भेदभाव के 4 दिन में जिलेटिन लेपित प्लेटों पर ईबीएस के चढ़ाना पैदा करती है। यह कदम अधिक विशिष्ट प्रारूप monolayer टिशू कल्चर के लिए आम में ईबीएस फर्क धर्मान्तरित। कुछ मामलों में यह और अधिक सुविधाजनक और या निलंबन के बजाय चढ़ाना ईबीएस में छोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है। निलंबन ईबीएस बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पसंद कर रहे हैं तो कोशिकाओं के बजाय 4 दिन पर चढ़ाया जा रहा है जब बुद्धि के इलाज की प्रक्रिया में भेदभाव निलंबन में छोड़ा जा सकता हैज Grem2, ईबीएस 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया है और गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है। मीडिया तो ध्यान से एक P1000 के साथ हटा दिया जाता है, ईबीएस की आकांक्षा को रोकने के लिए पीछे एक छोटी राशि छोड़ रहा है, और 1.5 मिलीलीटर Grem2 मीडिया ट्यूब को जोड़ा जाता है। इस निलंबन तो एक 6 सेमी पेट्री डिश को हस्तांतरित और 37C पर वापस रखा गया है। मीडिया सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब हर दो दिन में ऊपर संकेत विधि का उपयोग बदल गया है।

भेदभाव 4 दिन आम तौर पर प्रमुख विकासात्मक घटनाओं के साथ जुड़े जीन की अभिव्यक्ति के विश्लेषण के आधार पर Grem2 के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए चुना गया था। gastrulation मार्कर जीन टी Brachyury और 1 की तरह Cerberus के शिखर अभिव्यक्ति के बाद और इस तरह के रूप में कार्डियक Nkx2-5 पूर्वज सेल मार्कर की अभिव्यक्ति की शुरुआत में Grem2 के अलावा दोनों कार्डियोजेनेसिस और आलिंद विनिर्देश के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि इन जीनों के शिखर अभिव्यक्ति सेल लाइनों के बीच में थोड़ा भिन्न हो सकते हैं यह घ के दौरान इन जीनों की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए सिफारिश की हैifferentiation Grem2 इसके लिए इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए। लाइनों इस प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण में से अधिकांश दिन 4 और 5 के बीच भेदभाव की Grem2 साथ इलाज के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की।

किसी भी पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ के रूप में, Grem2 की गतिविधि बहुत कुछ करने के लिए बहुत से भिन्न होता है। इसलिए यह सिफारिश की है कि Grem2 से ही बहुत कुछ स्थिरता बनाए रखने के लिए प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए प्रयोग किया जाता है। जब एक नया बहुत कुछ खरीदा जाता है, प्रभावशीलता 1-5 माइक्रोग्राम / एमएल की रेंज में खुराक titrating द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल विश्लेषण और संस्कृति के लिए पर्याप्त संख्या के आलिंद वंश से मुख्यमंत्रियों अर्जित करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिकाओं का उत्पादन प्रवाह के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है cytometry, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, RT-qPCR, या जीवित कोशिका assays में उपयोग के लिए फिर से सुसंस्कृत। पहचान और सीएमएस के अलगाव की सुविधा के लिए संस्कृति के बाद αMHC-DsRed-Nuc संवाददाता लाइन विकसित किया गया था और नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता है।

इस प्रोटोकॉल स्वस्थ सीई बनाए रखने के लिए सीरम का उपयोग करता हैभेदभाव प्रक्रिया के दौरान करूँगा संस्कृतियों। हालांकि इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से मजबूत पैदा करता है, आलिंद की तरह हृदय भेदभाव, सीरम के उपयोग के भेदभाव की प्रक्रिया के लिए एक अपरिभाषित तत्व का परिचय। इस प्रोटोकॉल के मामलों में जहां एक अधिक परिभाषित मीडिया के लिए आवश्यक है की उपयोगिता सीमित कर सकता है। एक अधिक परिभाषित मीडिया तैयारी की आवश्यकता है, सीरम पीटा सीरम रिप्लेसमेंट 30 से बदला जा सकता है। एक परिभाषित संस्कृति मीडिया के लिए स्विचन जब यह है कि समय और Grem2 उपचार की एकाग्रता को फिर से अनुकूलित किया पहले से ही इस खंड में वर्णित के रूप में सिफारिश की है।

RT-qPCR आलिंद और निलय myocytes के लिए विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति यों इस्तेमाल किया जाता है। जबकि नीचे विनियमन या नहीं वेंट्रिकुलर जीनों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने Grem2 उपचार आलिंद विशिष्ट जीन की एक प्रेरण की ओर जाता है। यह परिणाम Grem2 प्रेरित सीएमएस के लिए विशिष्ट है। आलिंद पहचान का आकलन करने के लिए जीन का एक सेट का सुझाव दिया है इस प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है। जीन की एक विस्तृत सेटऔर उनकी प्रासंगिकता की चर्चा इस प्रोटोकॉल 14,16 द्वारा संदर्भित कार्यों में पाया जा सकता है। क्षेत्र विकसित करने के लिए जारी है और हृदय भेदभाव के बारे में हमारी समझ में सुधार के रूप में यह सिफारिश की है कि आलिंद और निलय पहचान मार्कर की इस सूची का आकलन किया और जरूरत के रूप में संशोधित किया जाता है।

मुख्यमंत्रियों के सृजन सजातीय संस्कृतियों नैदानिक ​​अनुसंधान विशिष्ट हृदय उपप्रकार को प्रभावित और अनुसंधान के लिए बुनियादी कशेरुकी दिलों में चैम्बर विनिर्देश के तंत्र को समझने पर ध्यान केंद्रित एक मॉडल प्रणाली प्रदान करने के लिए जाना जाता रोगों पर ध्यान केंद्रित प्रयासों की सुविधा होगी।

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Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान HL083958 और HL100398 (AKH) और 2T32HL007411-33 द्वारा समर्थित किया गया था "हृदय तंत्र में कार्यक्रम: जांच में प्रशिक्षण" (जेबी)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GMEM Life Technologies 11710
FBS Life Technologies 10082
Glutamax Life Technologies 35050
LIF EMD Millipore ESG1107
ß-Mercaptoethanol Sigma M3148
IMDM Sigma I3390
Non-Essential Amino Acids Sigma M7145
10 cm Tissue Culture Plates Sarstedt 83.3902
10 cm Bacterial Petri Dishes VWR 25384-342
6 cm Bacterial Petri Dishes VWR 25384-092
6-well tissue culture plates Sarstedt 83.3920
Gremlin 2 recombinant protein R&D Systems 2069-PR-050
Sterile filter units Thermo Fisher 09-741-02
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890
10X PBS, Sterile Sigma P5493
BSA  Sigma 5470
0.05% Trypsin-EDTA solution Life Technologies 25300054
DPBS, no Calcium, no Magnesium Life Technologies 14200

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 109 pluripotent स्टेम सेल आलिंद कार्डिएक भेदभाव अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेतन बीएमपी विरोधी Gremlin 2 (Grem2) प्रोटीन दान और Cerberus (PRDC) से संबंधित
बीएमपी विरोधी Grem2 का प्रयोग pluripotent स्टेम सेल से अलिंद cardiomyocytes के भेदभाव
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Bylund, J. B., Hatzopoulos, A. K.… More

Bylund, J. B., Hatzopoulos, A. K. Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2. J. Vis. Exp. (109), e53919, doi:10.3791/53919 (2016).

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