Abstract
Selv om det er akseptert at hjertet har et begrenset potensial til å regenerere cardiomyocytes etter skade og at lave nivåer av kardiomyocytt omsetning oppstår under normal aldring, forblir kvantifisering av disse hendelsene utfordrende. Dette er delvis på grunn av sjeldenhet av prosessen og det faktum at flere cellulære kilder bidra til hjerteinfarkt vedlikehold. Videre er DNA-duplisering i kardiomyocytter fører ofte til en polyploid kardiomyocytt og bare sjelden fører til nye kardiomyocytter med celledeling. For nøyaktig å kvantifisere kardiomyocytt omsetning diskriminering mellom disse prosessene er avgjørende. Protokollen er beskrevet her anvender langtids nukleosid merking for å merke alle kjerner som har oppstått som et resultat av DNA-replikasjon og cardiomyocyte kjerner som er identifisert ved å benytte kjerner isolering og påfølgende PCM1 immunolabeling. Sammen dette gjør det mulig nøyaktig og følsom identifikasjon av nukleosidet merking av cardiomyocyte kjerner befolkningen. Videre, 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol merking og analyse av kjerner ploiditet, muliggjør diskriminering av neo-cardiomyocyte kjerner fra kjerner som har innarbeidet i løpet av nukleosid Polyploidisering. Selv om denne metoden ikke kan kontrollere for kardiomyocytt binucleation, gir det en rask og robust kvantifisering av neo-kardiomyocytt kjerner mens regnskap for Polyploidisering. Denne metoden har en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert vurdering av potensielle therapeutics å forbedre kardiomyocytt regenerering eller undersøke effekten av hjertesykdom på kardiomyocytt omsetning og ploiditet. Denne teknikken er også kompatibelt med flere nedstrøms immunohistologiske teknikker, slik at kvantifisering av nukleosid inkorporering i alle hjertecelletyper.
Introduction
I de senere årene har det vært en opphopning av bevis utfordrer antakelsen at hjertet er et terminalt differensiert, post-mitotisk organ 1,2. Men kvantifisering av kardiomyocytt omsetning og regenerering er fortsatt utfordrende.
Vanskelighetene i nøyaktig identifisering av sjeldne kardiomyocytt generasjon ved hjelp av standard immunhistokjemiske teknikker er vel rapportert tre. I tillegg er usikkert med bevis for bidrag fra kardiomyocytt spredning samt av stamcelle differensiering 4-6 cellekilde kardiomyocytt generasjon. Derfor er umulig og kvantifisering av proliferasjon i en enkelt populasjon, inkludert kardiomyocytter bruk av avstamning sporing modeller som krever kjennskap til kardiomyocytt stamfar fenotype, er upassende. Videre er en kardiomyocytt har potensial for endoreplication uten karyokinesis (noe som resulterer i en polyploid bildiomyocyte) eller karyokinesis i fravær av cytokinese (noe som resulterer i en binucleated kardiomyocytt) 7,8. Den nøyaktig kvantifisering av kardiomyocytt omsetningen er avhengig av evnen til å skille mellom disse hendelsene og sann neo-kardiomyocytt generasjon. Dette skaper unike komplikasjoner fordi DNA replikasjon og uttrykk for cyclin-avhengige kinaser i cardiomyocytes ikke utelukkende demonstrere sann celledeling 9,10.
For å bistå i kvantifisering av neo-kardiomyocytt generasjon, har vi kombinert en etablert kjerner isolasjon teknikk, og immunologisk merking av pericentriolar materiale 1 (PCM1) for cardiomyocyte kjerner identifisering som beskrevet av Bergmann et al. 7,11 med nye metoder for langsiktig DNA merking og ploiditetsanalysen. PCM-1 er en sentrosomen protein som akkumuleres ved kjernekraft overflaten av differensierte, ikke-sykling muskelceller. Tidligere studier har vist at antistoffer motPCM-en spesifikt merke cardiomyocyte kjerner 7,11 og som sådan PCM1 har blitt brukt av en rekke uavhengige grupper for å identifisere cardiomyocytes 1,12,13. I tillegg har vi vist at PCM1 uttrykk tilordner til genetisk merkede cardiomyocyte kjernene i TnT-CRE transgen musemodell 14 (Supplementary figur 1).
Protokollen er beskrevet her gjør det mulig nøyaktig og følsom identifikasjon av neo kardiomyocytt kjerner generering i mus hjertet, uavhengig av de cellulære opprinnelse (figur 1A og B) samtidig med unntak av nukleosid-merking på grunn Polyploidisering fra analysen (figur 1C og D). Selv om denne metoden ikke kan kontrollere for kardiomyocytt binucleation, gir det en rask og robust kvantifisering av neo-kardiomyocytt kjerner som er nødvendig for nøyaktig kvantifisering av kardiomyocytt omsetning. Dessuten,det gir en rask screening verktøy for å vurdere potensielle endringer i dynamikken i kardiomyocytt generasjon.
Selv om DNA-merking involverer vanligvis 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) som tymidinanalog, protokollen beskrevet her anvender en 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EDU) basert assay som det krever færre prosesstrinn for en hurtigere gjennomstrømning og som ikke krever denaturering av DNA for immuno-deteksjon, slik at det er kompatibelt med andre immunfarging protokoller og dermed øke den potensielle nedstrøms anvendelser av fremgangsmåten.
Figur 1: Kontinuerlig pulserende med Edu etiketter neo-cardiomyocytes uavhengig av deres forfedre. (A) EDU er innlemmet i DNA av kardiomyocytter under celledeling. Spredning i kardiomyocytt befolkningen vil Result i en økning i, eller erstatning av kardiomyocytter og er således produktivt DNA-syntese (bidrar til vev vedlikehold og reparasjon). (B) EDU er innlemmet i DNA av hjerte progenitorceller under celledeling. Dette vil bli holdt tilbake i cellen under differensiering til kardiomyocytt avstamning. Dette stamcelledifferensiering vil også resultere i en økning i antallet av kardiomyocytter og bidrar derfor til vev vedlikehold og reparasjon. (C) kardiomyocytter har potensial til å gjennomgå "ikke-produktiv" DNA-replikasjon som resulterer i økt kardiomyocytt ploiditet, som er forbundet med kardiomyocytt hypertrofi og myokardial remodellering, men ikke erstatte tapte kardiomyocytter. Prosessen med Polyploidisering forskjellig fra binucleation som det resulterer i et kardiomyocytt med en enkelt kjerne som inneholder fire eller flere sett av to homologe kromosomer (> 2N). (D) Ved å følge en kontinuerlig kjerner pUlse, beskriver denne protokollen kjerner isolering og identifisering av cardiomyocyte kjerner av PCM1 uttrykk for å tillate kvantifisering av både kardiomyocytt ploidiresultat og Edu innlemmelse. PCM1 uttrykk og Edu innlemmelse oppdaget ved hjelp av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Animal arbeidet ble autorisert og godkjent av Newcastle University Etikk Review Board. Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra direktiv 2010/63 / EU fra Europaparlamentet om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål.
1. Edu Administrasjon
- Oppløs EDU i steril saltoppløsning (0,9% vekt / volum) ved en sluttkonsentrasjon på 12,5 mg / ml.
- Oppvarm løsningen til 40 ° C og vortex for å fullstendig oppløse. Oppbevar nok Edu / Saline ved 4 ° C for å injisere alle musene i studien åpner for 6 daglige injeksjoner.
Merk: Vanligvis over 6 mus er påkrevd for hver forsøksgruppe. Imidlertid bør beregninger utføres for uavhengige studier.
- Oppvarm løsningen til 40 ° C og vortex for å fullstendig oppløse. Oppbevar nok Edu / Saline ved 4 ° C for å injisere alle musene i studien åpner for 6 daglige injeksjoner.
- Vei individuelle mus. Beregn nødvendig volum for å administrere 100 mikrogram / g Edu / saltløsning til hver mus (8 mL av lager Edu løsning per g).
- Tegn riktig volume av Edu / saltvann inn insulin sprøyte med en 25 G nål.
- Utfør intraperitoneal (ip) injeksjoner ved håndtering av mus ved bruk godkjente hjemmekontoret teknikker.
- Plasser en mus på buret lokket. Trekk forsiktig tilbake på haleroten og fast grep musen ved Scruff.
- Expose magen for injeksjon ved å holde musen med pekefingeren og tommelen nær bunnen av hodet og tipping dyrets hode bakover mot gulvet.
- Tørk magen med 70% alkohol. Finn dyrets midtlinjen og nedre høyre kvadrant. Injiser Edu / Saline løsning i dyret inn i den nedre høyre kvadrant.
- Injisere mus med Edu / saltvannsoppløsning og ta den tiden av døgnet.
- Gjenta trinn 1,2 til 1,4 på samme tid på dagen, 6 dager.
Merk: Som en Edu negativ kontroll er nødvendig for å sette gating for flowcytometrisk analyse, injisere en ekstra alder, kjønn og eksperimentelt matcheed mus med et tilsvarende volum av saltvann uten Edu. Dette vil gi den nødvendige kontrollen (uten Edu kontroll). Denne kontrollen bør inkluderes for hver studie for å gi rom for variasjoner i grupper av reagenser og cytometer satt opp.
2. Høsting Hearts
- På 24 timer etter den 6. Edu injeksjon, ofre musene bruker halshugging (eller en alternativ Schedule en Home Office godkjent metode).
- Plasser ofret dyr i liggende stilling og gjør huden snitt fra midten av magen til membranen med kirurgiske saks.
- Skjær membranen, og holder sternum vekk fra kroppens hulrom, kuttet bilateralt å avsløre hjertet.
- Løft hjertet litt og kutte de store blodårene i utstrømningen kanalen å dissekere hjertet ut av brysthulen.
- Umiddelbart hvert hjerte i til en individuell 15 ml sentrifugerør inneholdende 10 ml PBS avkjølt til 4 ° C.
- Overfør hjerter til oljarate 10 cm petriskåler, ved hjelp av en skalpell kuttes hvert hjerte i to i en sagittal orientering og vaske hjertet ved forsiktig klemme med en pinsett. Deretter erstatte PBS for å fjerne så mye blod som mulig. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Plassere begge delene av hvert hjerte i samme individ 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Fortsett til trinn 3 eller alternativt lagre prøvene -80 ° C som beskrevet i trinn 2,9 og 2,10.
- Ved å bruke en 25 G nål, lage et lite hull i mikrosentrifugerør lokk for å hindre at lokket fra å åpnes på grunn av utvidelsen av gasser når hjertet blir behandlet.
- Merk hver mikrosentrifugerør og plasser i en beholder med flytende nitrogen til å fryse.
3. Kjerner Dissosiasjon og kardiomyocytt Nuclei merking
Merk: Denne kjerner dissosiasjon og cardiomyocyte kjerner merking er tilpasset fra at av Bergmann et al 11 Utfør denne prosedyren på alle prøvene injisert.med Edu og saltvann injisert (ingen Edu kontroll) negativ kontroll. Se tabell 1 for oppskriften til løsninger som kreves for å utføre disse trinnene.
- For hvert hjerte som skal analyseres, plasserer 36 ml av 1% BSA / PBS løsning i en ultrasentrifuge tube, inkuber i 30 min, skal den kastes, og deretter la det lufttørke.
Merk: Dette rør blir brukt i trinn 3,6. - Plasser individuelle frosne hjerter på en 10 mm rett på is og kjøttdeig ved hjelp av en skalpell slik at hjertene til tine under hakking prosessen.
- Plassere hakket hjerter i 15 ml Cell Lysis Buffer i et 50 ml sentrifugerør og homogenisere med en sonde homogenisator i 15 sekunder ved 25.000 rpm ved romtemperatur.
- Tilsett ytterligere 15 ml Cell Lysis Buffer til sentrifugerøret og overføring til en 40 ml Dounce med en stor klaring pistill. Utføre 10 slag med pistill og filtrer gjennom en 100 um deretter 40 mikrometer celle sil inn i et 50 ml sentrifugerør.
- -Sentrifuge i 10 min ent 700 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten.
- Resuspender atom pelleten i 25 ml sukrosegradient løsning og lag cellekjerner inneholdende oppløsning på toppen av 10 ml frisk sukrose gradient løsning i ultrasentrifugerør fremstilt i 3.1.
- Sentrifuger ved 13000 x g i 1 time ved 4 ° C ved anvendelse av en sving ut rør rotor.
- Etter sentrifugeringen, kast supernatanten og resuspender pelleten kjerner i 1300 mL av kjerner lagringsbuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og etikett PCM1.
- Fjerne 300 pl av suspensjonen til et nytt mikrosentrifugerør og tilsett 700 ul av frisk kjerner lagringsbuffer. Merk dette røret som ISO-kontroll.
- Legg anti-PCM1 ved en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml til mikrosentrifugerør merket PCM1 og legge til kanin IgG-isotype kontroll-antistoff i en konsentrasjon på 8 ug / ml til mikrosentrifugerør merket ISO-kontroll.
- Inkuber over natten ved 4 ° C. Etter incubasjon, sentrifuger ved 700 xg i 10 min, kast supernatanten, erstatte med 1 ml frisk kjerner lagring buffer, resuspender og sentrifuger igjen i 10 min ved 700 x g. Kast supernatanten og erstatte med 1 ml frisk kjerner lagring buffer.
- Tilsett 1 pl av F (ab ') 2 fragment av geit anti-kanin IgG (H + L) antistoff (FITC eller tilsvarende grønt-fluorescerende fargestoff) for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 2 ug / ml.
Merk: Bruken av et F (ab ') 2-fragment antistoff minsker potensialet for ikke-spesifikk merking av immunceller, inkludert makrofager og B-celler. - Vikle rør i aluminiumfolie for å beskytte mot lys og inkuberes i 1 time ved 4 ° C.
4. Påvisning av Edu innlemmelse
- Fortynnet 10x konsentrert Edu reaksjonsbuffer 1:10 med avionisert vann.
- Sentrifuger PCM-1 og ISO kontroll merkede kjerner suspensjoner ved 700 xg i 10 minutter, kaste supernatanten og resuspender pelleten kjerner i 1 ml1% BSA / PBS-oppløsning. Vask kjerner pellet to ganger.
- Etter siste vask, kast supernatanten og erstatte med 100 ul av Edu fiksativ.
- Vikle rør inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Vask prøvene to ganger med 1 ml 1% BSA / PBS-løsning, sentrifuger ved 700 xg og inkuber med 1x saponin-baserte permeabiliseringen løsning ved romtemperatur i 15 min.
- Forbered 1x Edu merking cocktail (tabell 2). Et minimum av 2 reaksjoner vil være nødvendig å inkludere noen Edu kontroll.
- Legge til 500 ul av 1 x edu merking cocktail direkte til hver prøve som allerede inneholder atomkjerner i 100 pl 1 x saponin-baserte permeabiliseringen løsning og inkuber ved romtemperatur beskyttet mot lys i 30 minutter.
- Sentrifuger ved 700 xg og resuspender i 1 ml av 1% BSA / PBS og gjenta dette trinnet to ganger til.
- Sentrifuger ved 700 xg, kast supernatanten og erstatte med 400 mL av DNA fargeløsning (se tabell for material).
| Navn på reagens |
| 1. Cell Lysis Buffer |
| 0,32 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 2,0 mM EDTA |
| 0,5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2.Sucrose Gradient Solution |
| 2,1 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 1 mM DTT |
| 3. Nuclei lagring buffer (NSB) |
| 0,44 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1,5 mM spermin |
Tabell 1: kjerner isolasjon buffer ingredienser Resept for alle Buffere brukes i protokollen § 3 (Kjerner dissosiasjon og kardiomyocytt kjerner merking)..
5. flowcytometrisk analyse
Merk: Utfør Flowcytometri på isolerte kjerner som beskrevet tidligere 7,11,15.
- Først oppretter en tomt som beskriver Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) for å tillate diskriminering av kjerner fra rusk (figur 2A).
- Lag en plan for å diskriminere enkeltkjerner fra aggregater (figur 2B) ved å plotte 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole) (DAPI) område (3-405 / 450/50-A) versus høyde (33-405 / 450 / 50-H). sikre that 3-405 / 450/50 A signal blir oppsamlet på den lineære skala for å gi den korrekte bestemmelse av DNA-innholdet.
- Lag en tomt som beskriver 488/535 / 30-A (PCM-1) vs SSC og vise bare hendelser fra sing gate opprettet i 5.2 for å vurdere PCM-1 uttrykk i singlet befolkningen.
- Kjør Isotype kontrollprøven for å etablere et PCM-en positiv port (figur 2C). Kjør en liten mengde PCM1 merket prøve å verifisere PCM1 uttrykke befolkningen og gating posisjon.
- Lag et plot som beskriver SSC-A vs 405/450/50-A (for å oppdage DAPI). I denne tomten, vise bare singlet PCM1 uttrykker kjerner, ved hjelp av portene som er opprettet i 5.3. Bruk denne tomten for å opprette en ekstra hierarkisk gate som bare inneholder 2 N kjerner (figur 2D).
- Lag en tomt som beskriver 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A for å tillate identifisering av Edu merking av PCM1 uttrykke kardiomyocytt befolkningen. Vis bare atomkjerner som er singlet, P CM1 + og 2N ved hjelp av den ovennevnte gating.
- Kjør hjerte prøve fra noen Edu kontrollen for å stille Edu positive gate (figur 2E). Skape den riktige porten for Edu + celler.
- Ta opp og kvantifisere singlet, PCM-1 som uttrykker, 2N kjerner som har innarbeidet Edu.
- Beregn denne populasjonen som en prosent av total singlet, PCM1 + kjerner. Dette vil gi frekvensen av neo-kardiomyocytt kjerner generasjon, i løpet av 7 dagers EDU puls periode, i prosent av totale cardiomyocyte kjerner.
Merk: Når DAPI-binding til DNA er støkiometrisk fluorescens intensitet er proporsjonal med mengden av DNA. Bestemme ploiditet basert på intensiteten av 405/450/50-A-signal, slik som beskrevet tidligere 7. - For å evaluere ploiditeten innen totale cardiomyocyte befolkningen bruke tomten etablert i 5.5 og en gating strategi basert på DNA-konsentrasjon 7.
/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/>
Figur 2:. Avblending strategi for å kvantifisere kardiomyocytt Edu innlemmelse og ploiditet (A) Nuclei blir diskriminert fra rusk basert på fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC). (B) En lineær port er opprettet, og sing kjerner populasjonen er identifisert basert på DAPI merkingen og den 405/450/50 høyde vs arealsignal. (C) Fluorescerende gating tillater separasjon av cardiomyocyte kjerner (PCM-1-positive) og ikke-cardiomyocyte (PCM-1-negativ) kjerner av hjertevevet. (D) Intensitet av DAPI signal anvendes for å bestemme DNA-konsentrasjon og derved kjerner ploiditet av PCM1 + kardiomyocytt befolkning. I mus> 80% av cardiomyocyte kjerner er diploid (2n). (E) Fluorescent gating tillater separasjon av 2N, cardiomyocyte kjerner som har innarbeidet Edu (PCM + / EDU + = 0,9%) fra 2N, cardiomyocytes som ikke har innarbeidet Edu (PCM + undervis-). Alle trinnene er beskrevet i protokollen 5,0. Eksempel vist fra MDX -. / Y mus på C57 / BL10 bakgrunn Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Denne metoden gjør at kvantifisering av økt Edu inkorporering grunn kardiomyocytt kjerner divisjon mens kontrollere for økt Polyploidisering. Ved hjelp av en BrdU baserte assay, vi tidligere har demonstrert at pattedyr hjerte reagerer på kronisk kardiomyocytt tap, i MDX musemodellen av Duchenne muskeldystrofi, med regenerering av nye kardiomyocytter. Vi har brukt metodene beskrevet her for å ytterligere bekrefte vår publiserte funn, og for å demonstrere nytten av protokollen. Pr protokollen beskrevet; voksne (12 uker gamle) MDX og kontroll bl10 mus ble pulset med en daglig injeksjon av Edu i 7 dager, rapporterte tidligere til tillate statisk analyse mellom eksperimentelle grupper 5,13. Immunhistokjemi analyse av pulserende hjerter viser tilstedeværelse av PCM1 uttrykke cardiomyocytes som har innarbeidet Edu (figur 3A). Men dataene innhentet using immunohistologiske metoder kan feiltolkes, som andre celletyper som har inkorporert Edu kan feilidentifisert som cardiomyocytes. Et eksempel på dette er vist i Tilleggs figur 1A og B. Videre immunohistologiske metoder ikke skiller Polyploidisering fra kjernekraft divisjon. Flowcytometri analyse beskrevet i denne protokollen muliggjør hurtig kvantifisering av kardiomyocytt atom divisjon i MDX og kontroll mus, mens unntatt celler som hadde innlemmet Edu grunn Polyploidisering. I likhet med tidligere publiserte data 13, analyser viste en økning i satsene for neo-kardiomyocytt kjerner generasjon i MDX mus hjerter i forhold til alder matchet kontroller (1,2% versus 0,17%, 3B og C).
Figur 3: Kvantifisering av Edu merket cardiomyocytes i hvete og MDX hjerter. (A) Bilde av Z-stack anslag hentet fra 40 mikrometer tykke deler av MDX hjerter. PCM-1 uttrykker cardiomyocyte kjerner (grønn) som har innlemmet Edu (rød). Gul pil viser Edu merket cardiomyocytes. I og II indikerer individuelle Edu merket cardiomyocytes vist i Z-planet. Kjerner som er merket med DAPI (blå) (B og C) Strømningscytometri av isolerte kjerner som viser representative plott 12-13 uker gamle villtype (C57 / BL10) og MDX-mus (MDX - / y på C57 / BL10 bakgrunn). (B) Histogram som viser DAPI intensitet og diskriminering mellom 2N og> 2N kjerner. (C) Tomter som viser Edu innlemmelse i 2n kardiomyocytt kjerner befolkningen når analysert som beskrevet i denne protokollen. For alle mus Edu ble gitt for 1 uke fra 12 uker gamle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur 1:. PCM-1 er en spesifikk markør for cardiomyocyte kjerner anvendelse av protokollen beskrevet kjerner ble isolert fra den doble transgen muse produsert ved å krysse TNT-ere mus 14 med ROSA nT / nG cre sensitiv reporter linje 16. I den resulterende musen cre aktivering under kontroll av troponin T (TNT) promoter fører til irreversibel ekspresjon av GFP med er lokalisert til kjernen. Kjerner merket med isotypekontrollantistoff (Iso) demonstrerer evnen til å identifisere GFP uttrykke kardiomyocytt kjerner befolkningen (488/530/30-A). Merking av kjerner med anti-PCM1 (sekundært antistoff påvist ved 633-660 / 20-A) viser korrelasjonen av PCM1 uttrykk med GFP uttrykke cardiomyocyte kjerner befolkningen. I dette eksempelet 98,8% av cardiomyocyte kjerner som er identifisert av TNT promoter aktivitet, er merket av PCM1 antistoff. Klikk her for å laste Supplerende Figur 1.
Supplerende Figur 2:. Utfordringer for kvantifisering kardiomyocytt fornyelse av immunohistologiske teknikker (A) 2D Bildet viser to PCM-1 uttrykker cardiomyocyte kjerner (grønn) som ser ut til å bli også merket for Edu (rød). Gule piler indikerer hva synes å være cardiomyocytes som har innarbeidet Edu. Dette skyldes den tilsynelatende samlokalisering av PCM1 uttrykk og Edu merking når visualiseres ved hjelp av to-dimensjonal avbildning. (B) En 3-dimensjonal projeksjon av dette bildet identifiserer Edu merket celler er ikke cardiomyocytes men er ikke-cardiomyocyte celler liggende PCM1 uttrykke cardiomyocyte kjerner. C57 / BL10 mus ved 12 ukers alder som brukes til eksperimenter. Klikk her for å laste ned tilleggs figur 2A. Klikk her for å laste ned tilleggs figur 2B.
| reaksjons~~POS=TRUNC | Antall reaksjoner | |
| 2 | 5 | |
| PBS | 875 mikroliter | 2.19 ml |
| kobber protectant | 20 mL | 50 pl |
| Fluorescerende fargestoff pikolyl azid | 5 pl | 12,5 mL |
| utvannet reaksjonbuffer utarbeidet i 4.1 | 100 pl | 250 fil |
| Totalt reaksjonsvolum | 1 ml | 2,5 ml |
Tabell 2: Edu cocktail ingredienser. Oppskrift på Edu merking cocktail kreves i protokollen § 4 (Påvisning av Edu inkorporering).
Discussion
For nøyaktig kvantifisere kardiomyocytt omsetning og regenerering analyser må skille mellom sant kardiomyocytt generasjon og nonproductive DNA divisjon. Mange studier fortsette å bare ignorere disse nonproductive hendelser, kvantifisere kardiomyocytt spredning utelukkende via uttrykk for cyclin kinesis og cellesyklus markører. Å date en enkel metode som gjør det mulig for nøyaktig kvantifisering av kardiomyocytt omsetningen mens kontrollere for disse nonproductive hendelsene forblir banneord. Spesielt er det fortsatt vanskelig å gjøre rede for kardiomyocytt Polyploidisering som bidrar opp til ~ 65% av kardiomyocytt DNA-replikasjon 13. Derfor å bistå i nøyaktig kvantifisering av kardiomyocytt generasjon har vi utviklet en protokoll som gjør det robust kvantifisering av satsene for neo cardiomyocyte kjerner samtidig utelukke DNA replikasjon som resulterer i økt ploidiresultat. Selv om denne protokollen kan ikke diskriminering mellom neo-kardiomyocytt slektersjon og kardiomyocytt bi-kjernedannelse, kan den brukes til raskt og nøyaktig å beregne den øvre grense (regnskap for ploiditet) av kardiomyocytt generasjon. Denne protokollen gir derfor et screeningverktøy for å vurdere potensielle endringer i satsene for kardiomyocytt generasjon og Polyploidisering i sykdomsmodeller eller for å vurdere potensialet effektiviteten av behandlingsformer. Når endringer i frekvensen av neo-kardiomyocytt kjerner generasjon er identifisert ved hjelp av denne protokollen påfølgende studier kan anvendes for å fastslå om denne på grunn av endringer i kardiomyocytt generering av kardiomyocytt kjernedannelse tall, slik det er beskrevet tidligere 2,13,17,18. Disse inkluderer bruk av histologiske kvantifisering cardiomyocyte kjerne dynamikk under pulsperioden eller analyser av vevssnitt hentet fra Edu pulserte dyr i å sammenligne Edu innlemmelse i mononukleærerte og multinucleated cardiomyocyte populasjoner.
På grunn av de lave nivåer av kardiomyocytt omsetning detteprotokollen bruker flere injeksjoner av Edu over en 7 dagers periode. Dette gjør også "jage" av alle mulige cellulære kilder kardiomyocytt generasjon og tillater kvantifisering av kumulative kardiomyocytt kjerner generasjon i løpet av denne tidsperioden. Avhengig av studien, kan dette tidsrommet tilpasses den anslåtte nivåer av kardiomyocytt generasjon. For nøyaktig kvantifisering av edu-inkorporering i cardiomyocyte kjerner, er det viktig at det ikke er noen ikke-spesifikk merking av kjerner med det sekundære antistoff som brukes til å detektere PCM-1 reaktivitet. Det ville derfor være aktuelt å foreta flere sekundære antistoff titrering eksperimenter for å optimalisere dette aspektet av protokollen, særlig hvis et sekundært antistoff enn det som foreslås i denne protokollen som skal benyttes. Protokollen er beskrevet her bruker PCM-1 uttrykk for å identifisere cardiomyocyte kjerner. Selv om dette er en etablert kardiomyocytt markør, kan alternative markører brukes til å valideredata; disse inkluderer antistoffer som er spesifikke for hjerte troponin T som er blitt identifisert som delvis lokalisert i cardiomyocyte kjerner 1. På lignende måte kan alternative nukleære lokaliserte proteiner anvendes for å identifisere og kvantifisere EDU innlemmelse i andre enn den til kardiomyocytter kjerner populasjoner. Det er viktig at alle cardiomyocyte kjerner som er aktivt som gjennomgår mitose er ekskludert fra analysen, som skjebnen til denne DNA-syntese er ukjent og kan resultere i enten celledeling eller økt ploiditet. PCM1 demonteres i M-fasen av cellesyklusen derfor kardiomyocytter som gjennomgår mitose vil ikke bli identifisert ved PCM1 uttrykk. I tillegg bør alle kjerner i S-fasen av cellesyklus bli ekskludert fra etterfølgende analyse. Dette kan oppnås ved å portstyre ut alle kjerner med en DAPI intensitet over den 2N populasjonen inkludert de med en DAPI intensitet mellom 2N og 4N populasjoner.
Selv om det blir stadigakseptert at hjertet har kapasitet til å erstatte cardiomyocytes under normal aldring og etter akutt skade, kilden og graden av dette potensialet er fortsatt kontroversielt. I tillegg har ulike priser av kardiomyocytt omsetning rapportert 1,7,20-22. Dette kan være delvis på grunn av vanskelighetene med nøyaktig identifisering og kvantifisering av neo-kardiomyocytt generasjon 19. Fram til i dag de fleste studier har støttet seg bare på bruk av histologisk analyse og identifikasjon av kardiomyocytter via ekspresjon av cytoplasmiske proteiner, inkludert proteiner av sarcomere, for kvantifisering av kardiomyocytt omsetning og fornyelse 2,4,23,24. Bruken av disse fremgangsmåter for å påvise ekspresjon av spredning markører, eller som vist her, kan inkorporering av tymidinanaloger lett resultere i feilidentifisering av andre hjertecelletyper som kardiomyocytter. Mens bruken av 3D-konfokalt avbildnings kan bidra til å lindre disse problemene thESE metoder er kostbare og tidkrevende. Interessant, protokollen beskrevet her demonstrerer neo-cardiomyocyte kjerner generering forekommer ved en hastighet på 0,17% pr uke. Dette er konsistent med andre flowcytometri basert studier som viser ukentlige omsetning på opptil 0,13% 5. Selv om det er fristende å ekstrapolere årlig omsetning priser basert på disse dataene, som i tidligere studier 2,5,25,26, dette er upassende som prisene i omsetning er dynamiske under levetiden til et dyr 13.
Denne metoden har en rekke potensielle bruksområder, inkludert vurdering av potensielle therapeutics å forbedre kardiomyocytt regenerering eller undersøke effekten av hjertesykdom på kardiomyocytt omsetning og priser av kardiomyocytt Polyploidisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
| 2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
| cell strainers 70 μm and 100 μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
| CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
| Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
| ultracentrifuge | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J.
- Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
- Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
- Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
- Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205 (2012).
- Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288 (2014).
- Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Bergmann, O., et al.
- Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
- Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
- Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
- Kajstura, J., et al.
- Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
- Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J.
- Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473 (2015).
- Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).
