Abstract
Selv om det er accepteret, at hjertet har en begrænset potentiale til at regenerere cardiomyocytter følgende skade, og at lave niveauer af cardiomyocyte omsætning forekomme under normal aldring, kvantificering af disse hændelser er fortsat udfordrende. Dette er til dels på grund af sjældenhed af processen og det forhold, at flere cellulære kilder bidrager til myocardial vedligeholdelse. Desuden DNA dobbeltarbejde inden cardiomyocytter ofte fører til en polyploid cardiomyocyte og kun sjældent fører til nye cardiomyocytter ved celledeling. For nøjagtigt kvantificere cardiomyocyte diskrimination omsætning mellem disse processer er afgørende. Protokollen beskrevet her beskæftiger langsigtet nukleosid mærkning for at mærke alle kerner, der er opstået som følge af DNA-replikation og cardiomyocyte kerner identificeret ved at udnytte kerner isolation og efterfølgende PCM1 immunolabeling. Tilsammen tillader nøjagtig og følsom identifikation af nucleosid mærkning af cardiomyocyte kerner befolkning. Endvidere 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol mærkning og analyse af kerner ploidi, muliggør diskriminering af neo-cardiomyocyte kerner fra kerner, der har inkorporeret nukleosid under polyploidization. Selv om denne metode ikke kan kontrollere for cardiomyocyte binucleation, det giver mulighed for en hurtig og robust kvantificering af neo-cardiomyocyte kerner, mens der tegner sig for polyploidization. Denne metode har en række downstream-applikationer, herunder vurdere de potentielle lægemidler at øge cardiomyocyte regenerering eller undersøgelse af virkningerne af hjertesygdom på cardiomyocyte omsætning og ploidi. Denne teknik er også kompatibel med yderligere downstream immunohistologiske teknikker, der muliggør kvantificering af nukleosid iblanding i alle kardiale celletyper.
Introduction
I de senere år har der været en ophobning af beviser udfordrer den antagelse, at hjertet er en terminalt differentieret, post-mitotisk orgel 1,2. Men kvantificering af cardiomyocyte omsætning og regenerering er stadig udfordrende.
Vanskelighederne i præcist at identificere sjældne cardiomyocyte generation ved hjælp af standard immunhistokemiske teknikker er godt rapporteres 3. Hertil kommer, at cellulære kilde cardiomyocyte generation fortsat usikker med beviser for bidrag fra cardiomyocyte spredning samt ved stamcelle differentiering 4-6. Derfor er brugen af slægt opsporing modeller, som kræver kendskab til cardiomyocyte stamfader fænotype er umuligt og kvantificering af proliferation i en enkelt population, herunder cardiomyocytter, er uhensigtsmæssig. Desuden en cardiomyocyte har potentiale til endoreplication uden karyokinesis (hvilket resulterer i en polyploid bildiomyocyte) eller karyokinesis i fravær af cytokinesen (hvilket resulterer i en binucleated cardiomyocyte) 7,8. Den nøjagtige kvantificering af cardiomyocyte omsætning afhænger af evnen til at skelne mellem disse hændelser og ægte neo-cardiomyocyte generation. Dette skaber unikke komplikationer, fordi DNA-replikation og ekspression af cyclin-afhængige kinaser i cardiomyocytter ikke udelukkende vise sandt celledeling 9,10.
For at hjælpe med kvantificering af neo-cardiomyocyte generation, har vi kombineret en etableret kerner isolation teknik, og immunologisk mærkning af pericentriolar materiale 1 (PCM1) for cardiomyocyte kerner identifikation som beskrevet af Bergmann et al. 7,11 med nye metoder til langsigtet DNA-mærkning og ploidi-analyse. PCM-1 er en centrosom protein, der akkumulerer ved nukleare overflade af differentierede, ikke-cykling myocytter. Tidligere undersøgelser har vist, at antistoffer modPCM-1 specifikt mærke cardiomyocyte kerner 7,11 og som sådan PCM1 er blevet brugt af en række uafhængige grupper at identificere cardiomyocytter 1,12,13. Derudover har vi vist, at PCM1 ekspression kort til genetisk mærkede cardiomyocyte kerner i TnT-Cre transgene musemodel 14 (Supplerende figur 1).
Protokollen beskrevet her muliggør nøjagtig og følsom identifikation af neo cardiomyocyte kerner generation i mus hjertet, uanset de cellulære oprindelse (figur 1A og B), mens der samtidig er mulighed nukleosid mærkning grund polyploidization fra analysen (figur 1C og D). Selv om denne metode ikke kan kontrollere for cardiomyocyte binucleation, det giver mulighed for en hurtig og robust kvantificering af neo-cardiomyocyte kerner, der er nødvendige for den nøjagtig kvantificering af cardiomyocyte omsætning. Endvideredet giver en hurtig screening redskab til at vurdere mulige ændringer i dynamikken i cardiomyocyte generation.
Mens DNA-mærkning omfatter normalt 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) som thymidin-analog, der er beskrevet her protokollen bruger en 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu) baseret assay som den kræver færre bearbejdningstrin for en hurtigere gennemløb og kræver ikke denaturering af DNA'et for immuno-detektion, hvilket gør den forenelig med andre immunfarvning protokoller og derved øge de potentielle efterfølgende anvendelser af fremgangsmåden.
Figur 1: Kontinuerlig pulsering med Edu etiketter neo-cardiomyocytter uanset deres forfædre. (A) edu inkorporeres i DNA'et i cardiomyocytter under celledelingen. Proliferation i cardiomyocyte befolkningen vil Result i en stigning i, eller udskiftning af cardiomyocytter og derfor produktive DNA-syntese (bidrager til væv vedligeholdelse og reparation). (B) edu inkorporeres i DNA'et i kardiale progenitorceller under celledeling. Dette vil blive tilbageholdt i cellen under differentiering til cardiomyocyte afstamning. Denne stamcelledifferentiering vil også resultere i en stigning i antallet af cardiomyocytter og bidrager derfor til væv vedligeholdelse og reparation. (C) cardiomyocytter har potentiale til at undergå "uproduktive" DNA-replikation resulterer i øget cardiomyocyte ploidi, som er forbundet med cardiomyocythypertrofi og myocardial remodeling, men erstatter ikke mistede cardiomyocytter. Processen med polyploidization afviger fra binucleation da det resulterer i en cardiomyocyte med en enkelt kerne, der indeholder fire eller flere sæt af to homologe kromosomer (> 2 N). (D) Efter en kontinuerlig kerner pUlse, denne protokol beskriver kerner isolering og identifikation af de cardiomyocyte kerner ved PCM1 udtryk for at tillade kvantificering af både cardiomyocyte ploidi og Edu inkorporering. PCM1 udtryk og Edu inkorporering detekteres ved anvendelse af flowcytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Animal arbejde blev godkendt og godkendt af Newcastle University Ethics Review Board. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra direktiv 2010/63 / EU af Europa-Parlamentet om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. edu Administration
- Opløs edu i steril saltvandsopløsning (0,9% w / v) i en endelig koncentration på 12,5 mg / ml.
- Opvarm opløsningen til 40 ° C og vortex for at opløses fuldstændigt. Opbevar nok edu / saltvand ved 4 ° C for at injicere alle mus i undersøgelsen giver mulighed for 6 daglige injektioner.
Bemærk: Typisk over 6 mus er nødvendige for hver forsøgsgruppe. Dog bør udføres styrkeberegninger for uafhængige undersøgelser.
- Opvarm opløsningen til 40 ° C og vortex for at opløses fuldstændigt. Opbevar nok edu / saltvand ved 4 ° C for at injicere alle mus i undersøgelsen giver mulighed for 6 daglige injektioner.
- Afvej individuelle mus. Beregn den nødvendige volumen til at administrere 100 ug / g edu / saltopløsning til hver mus (8 pi lager edu opløsning pr g).
- Tegn en passende volume af edu / saltvand i insulinsprøjte med en 25 G nål.
- Udfør intraperitoneal (ip) injektioner mens håndtering mus ved hjælp af godkendte hjemmekontor teknikker.
- Placer en mus på buret låget. Træk forsigtigt tilbage på haleroden og fast forstå musen ved harmoniske.
- Udsætte maven til injektion ved at holde musen med pegefingeren og tommelfingeren nær bunden af hovedet og deponering dyrets hoved tilbage mod gulvet.
- Tør maven med 70% alkohol opløsning. Find dyrets midterlinjen og nederste højre kvadrant. Sprøjt edu / Saltvandsopløsning i dyret ind i den nederste højre kvadrant.
- Sprøjt mus med Edu / saltopløsning og registrere tidspunktet på dagen.
- Gentag trin 1,2 til 1,4 på samme tidspunkt på dagen, i 6 på hinanden følgende dage.
Bemærk: Som der kræves en edu negativ kontrol for at indstille gating til flowcytometrisk analyse, injicere en ekstra alder, køn og eksperimentelt matchered mus med et tilsvarende volumen af saltvand uden edu. Dette vil give den nødvendige kontrol (ingen edu kontrol). Denne kontrol bør medtages for hver undersøgelse for at give mulighed for variationer i partier af reagenser og cytometer oprettet.
2. Høst Hjerter
- På 24 timer efter det 6. edu injektion, ofrer mus ved hjælp af cervikal dislokation (eller en alternativ Schedule 1 Home Office godkendt metode).
- Placer ofret dyr i rygleje og gøre huden indsnit fra midten maven til membranen med kirurgiske sakse.
- Skær mellemgulvet, og holde brystbenet væk fra kropskaviteten, skåret bilateralt at blotlægge hjertet.
- Løft hjerte lidt, og skære de store blodkar i udstrømningen tarmkanalen at dissekere hjertet ud af brysthulen.
- Anbring straks hvert hjerte i til en individuel 15 ml centrifugerør indeholdende 10 ml PBS nedkøles til 4 ° C.
- Overfør hjerter til SEParate 10 cm petriskåle under anvendelse af en skalpel skæres hvert hjerte i to i et sagittalt orientering og vask hjertet ved forsigtigt at klemme med en pincet. Derefter udskiftes PBS for at fjerne så meget blod som muligt. Gentag dette trin to gange.
- Placer begge dele af hver hjerte i det samme individ 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Fortsæt til trin 3 eller alternativt gem prøver -80 ° C som beskrevet i trin 2.9 og 2.10.
- Anvendelse af en 25 G nål, lave et lille hul i mikrocentrifugerør låg for at forhindre låget i at åbne som følge af ekspansionen af gasser når hjertet er behandlet.
- Mærk hver mikrocentrifugerør og sted i en beholder med flydende nitrogen til at fryse.
3. Nuclei Dissociation og cardiomyocyte Kerner Mærkning
Bemærk: Denne kerner dissociation og cardiomyocyte kerner mærkning er tilpasset sig fra Bergmann et al 11 Udfør denne procedure på alle prøver injiceret.med Edu og saltvand injiceres (ingen edu kontrol) negativ kontrol. Se tabel 1 for opskriften af løsninger, der kræves for at udføre disse trin.
- For hvert hjerte, der skal analyseres, anbringes 36 ml 1% BSA / PBS-opløsning i en ultracentrifuge rør, inkuberes i 30 minutter, kasseres opløsningen og derefter lad det lufttørre.
Bemærk: Dette rør anvendes i trin 3.6. - Placer individuelle frosne hjerter på en 10 mm skål på is og hakkekød ved hjælp af en skalpel tillader hjerter at afrime under hakningen processen.
- Placer hakket hjerter i 15 ml Cell Lysis Buffer i et 50 ml centrifugerør og homogeniseres med en probe homogenisator i 15 sekunder ved 25.000 rpm ved stuetemperatur.
- Tilføj yderligere 15 ml Cell Lysis Buffer til centrifugerør og overførsel til en 40 ml Dounce med en stor clearance støder. Udfør 10 slag med pistil og filtreres gennem en 100 um derefter 40 um celle si i et 50 ml centrifugerør.
- Centrifuger i 10 minutter ent 700 xg ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Resuspender nukleare pellet i 25 ml saccharosegradient Solution og lag cellekernerne indeholdende opløsning på toppen af 10 ml frisk saccharosegradient opløsning i ultracentrifugerør fremstillet i 3.1.
- Centrifuger ved 13.000 xg i 1 time ved 4 ° C ved anvendelse af en swing out rør rotoren.
- Efter centrifugering kasseres supernatanten og resuspender kerner pellet i 1.300 pi kerner opbevaring buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og etiket PCM1.
- Fjern 300 pi af suspensionen til en ny mikrocentrifugerør og tilføje til 700 pi frisk kerner opbevaringsbuffer. Mærk dette rør som ISO-kontrol.
- Tilføj anti-PCM1 ved en endelig koncentration på 8 pg / ml til mikrocentrifuge rør mærket PCM1 og tilføj Rabbit IgG isotype kontrol antistof i en koncentration på 8 pg / ml til mikrocentrifugerør mærket ISO kontrol.
- Inkuber natten over ved 4 ° C. Efter incubation, centrifugeres ved 700 xg i 10 min, supernatanten, erstatte med 1 ml frisk kerner opbevaring buffer, resuspender og centrifuger igen i 10 min ved 700 x g. Supernatanten kasseres og erstattes med 1 ml frisk kerner opbevaringsbuffer.
- Tilsæt 1 pi F (ab ') 2-fragment af gede-anti-kanin IgG (H + L) antistof (FITC eller tilsvarende grønt-fluorescerende farvestof) for at opnå en slutkoncentration på 2 pg / ml.
Bemærk: Brugen af et F (ab ') 2-fragment-antistof reducerer potentialet for ikke-specifik mærkning af immunceller, herunder makrofager og B-celler. - Wrap rør i aluminiumfolie for at beskytte mod lys og inkuberes i 1 time ved 4 ° C.
4. Påvisning af Edu Indbygning
- Fortynd 10X koncentreret edu reaktionsbuffer 1:10 med deioniseret vand.
- Centrifuger PCM-1 og ISO kontrol mærkede kerner suspensioner ved 700 xg i 10 min, supernatanten og resuspender kerner pellet i 1 ml1% BSA / PBS-opløsning. Vask kerner pellet to gange.
- Efter den sidste vask, kasseres supernatanten og erstatte med 100 ul edu fiksativ.
- Wrap rør i aluminiumfolie for at beskytte mod lys og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask prøverne to gange med 1 ml 1% BSA / PBS-opløsning, centrifugeres ved 700 xg og inkuberes med 1x saponin-baserede permeabilisering opløsning ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Forbered 1x edu mærkning cocktail (tabel 2). Et minimum af 2 reaktioner vil være forpligtet til også at omfatte ikke edu kontrol.
- Der tilsættes 500 pi 1x edu mærkning cocktail direkte til hver prøve, der allerede indeholder kerner i 100 pi 1x saponin-baserede permeabilisering opløsning og inkuber ved stuetemperatur beskyttet mod lys i 30 minutter.
- Centrifuger ved 700 xg og resuspender i 1 ml 1% BSA / PBS og gentage dette trin to gange mere.
- Centrifuger ved 700 xg, kasseres supernatanten og erstatte med 400 pi DNA farveopløsning (se tabel of Materials).
| Navn af reagenset |
| 1. Cell Lysis Buffer |
| 0,32 M saccharose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 2,0 mM EDTA |
| 0,5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2.Sucrose Gradient Solution |
| 2,1 M saccharose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesiumacetat |
| 1 mM DTT |
| 3. Kerner storage buffer (NSB) |
| 0,44 M saccharose |
| 10 mM Tris-HCI (pH = 7,2) |
| 70 mM KCI |
| 10 mM MgCl2 |
| 1,5 mM spermin |
Tabel 1: kerner isolation buffer ingredienser Opskrift på alle buffere, der anvendes i protokol afsnit 3 (Nuclei dissociation og cardiomyocyte kerner mærkning)..
5. flowcytometrisk analyse
Bemærk: Udfør Flow cytometri på isolerede kerner som tidligere 7,11,15 beskrevet.
- Opret først et plot, der beskriver Forward Scatter (FSC) og Side Scatter (SSC) at tillade diskrimination af kerner fra affald (figur 2A).
- Opret et plot til at skelne enkelte kerner fra aggregater (figur 2B) ved at plotte 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) (DAPI) område (3-405 / 450/50-A) versus højde (33-405 / 450 / 50-H). Sørg that 3-405 / 450/50 Et signal opsamles på den lineære skala for at muliggøre korrekt bestemmelse af DNA-indhold.
- Opret et plot, der beskriver 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC og viser kun begivenheder fra singlet gate skabt i 5.2 for at vurdere PCM-1-ekspression i singlet befolkning.
- Kør Isotype kontrolprøven for at etablere en PCM-1 positive gate (figur 2C). Køre en lille mængde PCM1 mærkede prøve at kontrollere PCM1 udtrykkende befolkning og gating position.
- Opret et plot, der beskriver SSC-A vs 405/450/50-A (at opdage DAPI). I dette plot, display kun singlet PCM1 udtrykker kerner, ved hjælp af portene oprettet i 5.3. Brug denne plot til at oprette en ekstra hierarkiske port, der kun indeholder 2 N kerner (figur 2D).
- Opret et plot, der beskriver 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A for at tillade identifikation af Edu mærkning PCM1 udtrykke cardiomyocyte befolkning. Vis kun kerner, som er singlet, P CM1 + og 2N hjælp af ovenstående gating.
- Kør hjerte prøve fra nogen Edu kontrol for at indstille edu positive port (Figur 2E). Opret passende gate for Edu + celler.
- Optag og kvantificere singlet, PCM-1 udtrykker, 2N kerner, der har indarbejdet Edu.
- Beregn denne population som en procentdel af den samlede singlet, PCM1 + kerner. Dette vil give hastigheden af neo-cardiomyocyte kerner generation, i løbet af syv dage edu puls periode, som en procentdel af de samlede cardiomyocyte kerner.
Bemærk: Som DAPI binding til DNA er støkiometrisk fluorescensintensiteten er proportional med mængden af DNA. Bestem ploidi baseret på intensiteten af 405/450/50 Et signal, som tidligere 7 beskrevet. - At evaluere ploidi inden for den samlede cardiomyocyte befolkning bruger plottet etableret i 5.5 og en gating strategi baseret på DNA-koncentrationen 7.
/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg "/>
Figur 2:. Gating strategi at kvantificere cardiomyocyte Edu inkorporering og ploidi (A) Kerner diskrimineres fra snavs baseret på forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC). (B) En lineær port er skabt og den singlet kerner befolkning er identificeret baseret på DAPI mærkning og 405/450/50 højde vs område signal. (C) Fluorescerende gating tillader adskillelse af cardiomyocyte kerner (PCM-1-positive) og ikke-cardiomyocyte (PCM-1-negative) kerner fra hjertevævet. (D) Intensitet af DAPI signal anvendes til at bestemme DNA-koncentration og dermed kerner Ploidiniveauet for PCM1 + cardiomyocyte befolkning. I mus> 80% af cardiomyocyte kerner er diploide (2n). (E) Fluorescerende gating tillader adskillelse af 2N, cardiomyocyte kerner som har inkorporeret edu (PCM + / EDU + = 0,9%) fra 2 N, cardiomyocytter, som ikke har inkorporeret edu (PCM + uddan-). Alle trin er beskrevet i protokollen 5.0. Eksempel vist fra MDX -. / Å mus på C57 / BL10 baggrund Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Denne metode giver kvantificering af øget edu inkorporering grund cardiomyocyte kerner division samtidig med at kontrollere for øget polyploidization. Ved hjælp af en BrdU baseret assay, vi tidligere vist, at pattedyrs hjerte reagerer på kronisk cardiomyocyte tab, i mdx musemodel for Duchenne muskeldystrofi, med regenerering af nye cardiomyocytter. Vi har brugt de metoder, der er beskrevet her til yderligere at validere vores offentliggjorte resultater og til at demonstrere anvendeligheden af protokollen. Som pr beskrevne protokol; voksen (12 uger gamle) mdx og kontrol bl10 mus blev pulseret med en daglig injektion af edu i 7 dage, der tidligere er rapporteret for at tillade statisk analyse mellem forsøgsgrupper 5,13. Immunhistologisk analyse af pulserende hjerter viser tilstedeværelsen af PCM1 udtrykkende cardiomyocytter, som har inkorporeret edu (figur 3A). Men de data, using immunologiske metoder kan misforstås, som andre celletyper, der har indarbejdet Edu kan fejlidentificerede som cardiomyocytter. Et eksempel på dette vises i supplerende Figur 1A og B. Desuden immunologiske metoder skelner ikke polyploidization fra nukleare division. Den flowcytometri analyse beskrevet i denne protokol muliggør hurtig kvantificering af cardiomyocyte nukleare division i mdx og kontrol mus, mens udelukke celler, som havde inkorporeret Edu grund polyploidization. Svarende til tidligere offentliggjorte data 13, analyse viste en stigning i satserne for neo-cardiomyocyte kerner generation i MDX mus hjerter i forhold til alder matchede kontroller (1,2% versus 0,17%; Figur 3B og C).
Figur 3: Kvantificering af Edu mærkede cardiomyocytter i vildtype og mdx hjerter. (A) Billede af Z-stack fremskrivninger taget fra 40 um tykke sektioner af mdx hjerter. PCM-1-udtrykkende cardiomyocyte kerner (grøn), som har indarbejdet edu (rød). Gul pil indikerer Edu mærkede cardiomyocytter. I og II angiver individuelle edu mærkede cardiomyocytter vist i Z-planet. Kerner mærket med DAPI (blå) (B og C) Flowcytometri af isolerede kerner, der viser repræsentative illustreres ved hjælp af 12-13 uger gamle vildtype (C57 / BL10) og mdx-mus (MDX - / y på C57 / BL10 baggrund). (B) Histogram viser DAPI intensitet og forskelsbehandling af 2N og> 2N kerner. (C) Plots viser Edu inkorporering i 2N cardiomyocyte kerner befolkning når de analyseres som beskrevet i denne protokol. For alle mus Edu blev administreret i 1 uge fra 12 uger gamle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1:. PCM-1 er en specifik markør for cardiomyocyte kerner under anvendelse af protokollen beskrevet kerner blev isoleret fra den dobbelte transgene mus frembragt ved krydsning TNT-cre mus 14 med ROSA nT / nG cre følsom reporter linie 16. I den resulterende muse cre aktivering under kontrol af troponin T (TNT) promotoren fører til irreversibel ekspression af GFP med er lokaliseret til kernerne. Kerner mærket med isotypekontrol (Iso) viser evne til at identificere GFP udtrykke cardiomyocyte kerner befolkning (488/530/30-A). Mærkning af kerner med anti-PCM1 (sekundært antistof opdaget af 633-660 / 20-A) viser korrelationen mellem PCM1 udtryk med GFP udtrykke cardiomyocyte kerner befolkning. I dette eksempel 98,8% af cardiomyocyte kerner som identificeret af TNT promotor-aktivitet, er mærket af PCM1 antistof. Klik her for at downloade supplerende figur 1.
Supplerende Figur 2:. Udfordringer til kvantificering cardiomyocyte fornyelse af immunohistologiske teknikker (A) 2D Billedet viser to PCM-1 udtrykker cardiomyocyte kerner (grøn), som ser ud til at være også mærket til Edu (rød). Gule pile angiver, hvad der synes at være cardiomyocytter der har indarbejdet Edu. Dette skyldes den tilsyneladende co-lokalisering af PCM1 ekspression og edu mærkning ved visualisering ved anvendelse af 2-dimensionale billeddannelse. (B) En 3-dimensional projektion af billedet identificerer edu mærkede celler ikke cardiomyocytter men er ikke-cardiomyocyte celler overliggende PCM1 udtrykkende cardiomyocyte kerner. C57 / BL10 mus ved 12 ugers alderen anvendes til forsøg. Klik her for at downloade supplerende figur 2A. Klik her for at downloade supplerende figur 2B.
| reaktionskomponenter | Antal reaktioner | |
| 2 | 5 | |
| PBS | 875 pi | 2,19 ml |
| Kobber protectant | 20 pi | 50 pi |
| Fluorescerende farvestof picolyl azid | 5 pi | 12,5 pi |
| fortyndet reaktionbuffer udarbejdet i 4.1 | 100 pi | 250 pi |
| Totalt reaktionsvolumen | 1 ml | 2,5 ml |
Tabel 2: edu cocktail ingredienser. Opskrift på edu etikettering cocktail kræves i protokol § 4 (Påvisning af Edu inkorporering).
Discussion
For præcist at kvantificere cardiomyocyte omsætning og regenerering analyser må skelne mellem sandt cardiomyocyte generation og uproduktive DNA division. Mange undersøgelser fortsat blot ignorere disse uproduktive begivenheder, kvantificere cardiomyocyte spredning udelukkende via ekspression af cyclin kinesis og cellecyklus markører. Til dato en enkelt metode, der tillader præcis kvantificering af cardiomyocyte omsætning samtidig med at kontrollere for disse uproduktive begivenheder forbliver hentydninger. Navnlig er det fortsat vanskeligt at forklare cardiomyocyte polyploidization som bidrager med op til ~ 65% af cardiomyocyte DNA-replikation 13. Derfor at bistå med nøjagtig kvantificering af cardiomyocyte generation har vi udviklet en protokol, der tillader den robuste kvantificering af satserne for neo cardiomyocyte kerner samtidig udelukke DNA-replikation, der resulterer i øget ploidi. Selv om denne protokol ikke kan forskelsbehandling mellem neo-cardiomyocyte slægtertion og cardiomyocyte bi-kimdannelse, kan den bruges hurtigt og præcist at beregne den øvre grænse (der tegner sig for ploidi) af cardiomyocyte generation. Denne protokol giver derfor et screeningsværktøj til at vurdere mulige ændringer i satserne for cardiomyocyte generation og polyploidization i sygdomsmodeller eller at vurdere den potentielle effektivitet lægemidler. Når ændringer i hastigheden af neo-cardiomyocyte kerner generation, identificeres ved hjælp af denne protokol efterfølgende studier kan anvendes til at konstatere, om denne på grund af ændringer i cardiomyocyte generation af cardiomyocyte nukleering nummer, som beskrevet tidligere 2,13,17,18. Disse omfatter anvendelsen af histologiske kvantificering cardiomyocyte kernedannende dynamik under pulsen periode eller analyser af vævssnit opnået fra Edu pulserende dyr i at sammenligne Edu inkorporering i mononukleære og flerkernede cardiomyocyte befolkninger.
På grund af de lave niveauer af cardiomyocyte omsætning denneprotokollen bruger multiple injektioner af edu over en periode på 7 dage. Dette giver også mulighed for "jagter" af alle potentielle cellulære kilder til cardiomyocyte generation og tillader kvantificering af kumulativ cardiomyocyte kerner generation løbet af denne periode. Afhængigt af undersøgelsen, kan denne tidsramme justeres efter de forudsagte niveauer for cardiomyocyte generation. Til nøjagtig kvantificering af edu inkorporering i cardiomyocyte kerner, er det bydende nødvendigt, at der ikke er nogen ikke-specifik mærkning af kernerne med det sekundære antistof anvendes til påvisning PCM-1 reaktivitet. Det ville derfor være fornuftigt at foretage yderligere sekundære antistoftitrering eksperimenter for at optimere dette aspekt af protokollen, især hvis en anden medlemsstat end den sekundære antistof foreslået i denne protokol skal bruges. Protokollen beskrevet her anvender PCM-1 ekspression til at identificere cardiomyocyte kerner. Mens dette er en etableret cardiomyocyte markering, kan alternative markører anvendes til at valideredata; disse omfatter antistoffer specifikke for cardiac troponin T, som er blevet identificeret som delvis lokaliseret i cardiomyocyte kerner 1. Ligeledes kan alternative nukleare lokaliserede proteiner bruges til at identificere og kvantificere Edu indarbejdet i andre end de cardiomyocytter kerner befolkninger. Det er vigtigt, at alle cardiomyocyte kerner, der aktivt undergår mitose er udelukket fra analysen, som skæbnen for denne DNA-syntese er ukendt og kan resultere i enten celledeling eller øget ploidi. PCM1 adskilles under M-fasen af cellens cyklus derfor cardiomyocytter undergår mitose vil ikke identificeres ved PCM1 ekspression. Desuden bør alle kerner i S-fasen af cellecyklussen udelukkes fra efterfølgende analyse. Dette kan opnås ved gating alle kerner med en DAPI intensitet over 2N befolkningen, herunder dem med en DAPI intensitet mellem 2N og 4N populationer.
Selv om det er i stigende gradaccepteret, at hjertet har kapacitet til at erstatte cardiomyocytter under normal ældning og efter akut skade, kilden og graden af dette potentiale forbliver kontroversiel. Desuden har forskellige satser for cardiomyocyte omsætning er rapporteret 1,7,20-22. Dette kan til dels skyldes vanskelighederne med præcist at identificere og kvantificere neo-cardiomyocyte generation 19. Til dato de fleste undersøgelser har påberåbt kun på brugen af histologisk analyse og identificering af cardiomyocytter via ekspressionen af cytoplasmatiske proteiner, herunder proteiner af sarkomeret, til kvantificering af cardiomyocyte omsætning og fornyelse 2,4,23,24. Anvendelsen af disse metoder til påvisning af ekspression af proliferationsmarkører, eller som demonstreret her, kan inkorporeringen af thymidinanaloger let resultere i fejlagtig identifikation af andre kardiale celletyper som cardiomyocytter. Mens anvendelsen af 3D konfokal billeddannelse kan bidrage til at afhjælpe disse problemer thESE metoder er dyre og tidskrævende. Interessant, den her beskrevne protokol demonstrerer neo-cardiomyocyte kerner generation sker med en hastighed på 0,17% pr uge. Dette er i overensstemmelse med andre flowcytometri baserede undersøgelser, der påviser ugentlige omsætning på op til 0,13% 5. Selv om det er fristende at ekstrapolere årlige omsætning satser baseret på disse data, som i tidligere undersøgelser 2,5,25,26, dette er uhensigtsmæssigt, da satserne for omsætningen er dynamiske løbet levetid af et dyr 13.
Denne metode har en række potentielle anvendelser, herunder at vurdere de potentielle lægemidler at øge cardiomyocyte regenerering eller undersøgelse af virkningerne af hjertesygdom på cardiomyocyte omsætning og satserne for cardiomyocyte polyploidization.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
| 2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
| cell strainers 70 μm and 100 μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
| CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
| Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
| ultracentrifuge | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
- Soonpaa, M. H., Rubart, M., Field, L. J.
- Loffredo, F. S., Steinhauser, M. L., Gannon, J., Lee, R. T. Bone marrow-derived cell therapy stimulates endogenous cardiomyocyte progenitors and promotes cardiac repair. Cell Stem Cell. 8, 389-398 (2011).
- Malliaras, K., et al. Cardiomyocyte proliferation and progenitor cell recruitment underlie therapeutic regeneration after myocardial infarction in the adult mouse heart. EMBO Mol Med. 5, 191-209 (2013).
- Hsieh, P. C., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13, 970-974 (2007).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Exp Cell Res. 317, 188-194 (2011).
- Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 36, 45-51 (1997).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, 311-322 (2000).
- Carmena, M., Earnshaw, W. C. The cellular geography of aurora kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-854 (2003).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. , e4205 (2012).
- Gilsbach, R., et al. Dynamic DNA methylation orchestrates cardiomyocyte development, maturation and disease. Nat Commun. 5, 5288 (2014).
- Richardson, G., Laval, S., Owens, W. A. Cardiomyocyte regeneration in the mdx mouse model of non-ischemic cardiomyopathy. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jiao, K., et al. An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart. Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).
- Bergmann, O., et al.
- Prigge, J. R., et al. Nuclear double-fluorescent reporter for in vivo and ex vivo analyses of biological transitions in mouse nuclei. Mamm Genome. , (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157, 795-807 (2014).
- Liu, Z., Yue, S., Chen, X., Kubin, T., Braun, T. Regulation of cardiomyocyte polyploidy and multinucleation by CyclinG1. Circ Res. 106, 1498-1506 (2010).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am J Physiol Cell Physiol. 298, C1603-C1609 (2010).
- Kajstura, J., et al. Myocyte turnover in the aging human heart. Circ Res. 107, 1374-1386 (2010).
- Kajstura, J., et al.
- Walsh, S., Ponten, A., Fleischmann, B. K., Jovinge, S. Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation in vivo--an analysis based on cardiomyocyte nuclei. Cardiovasc Res. 86, 365-373 (2010).
- Anversa, P., Leri, A., Kajstura, J.
- Gonzalez-Valdes, I., et al. Bmi1 limits dilated cardiomyopathy and heart failure by inhibiting cardiac senescence. Nat Commun. 6, 6473 (2015).
- Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523, 226-230 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, H220-H226 (1997).
