방법 논문

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

20K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

2016년 5월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

초록

심혈관 질환은 전 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 지질이 함유된 대식세포와 석회화로 구성된 죽상경화성 플라크는 관상동맥, 대동맥 판막, 대동맥 및 말초 도관 동맥에서 발생하며 심혈관 질환의 특징입니다. 인간의 경우, 컴퓨터 단층 촬영을 통한 이미징을 통해 혈관 석회화를 정량화할 수 있습니다. 혈관 석회화의 존재는 미래의 심혈관 질환에 대한 강력한 예측 변수입니다. 심혈관 질환에 대한 새로운 치료법의 개발은 죽상동맥경화증의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 결정적으로 의존합니다. 죽상경화성 메커니즘에 대한 지식을 발전시키는 것은 쥐와 세포 기반 모델에 의존합니다. 여기에서는 스펙트럼이 뚜렷한 두 개의 근적외선 형광 이미징 프로브를 사용하여 대동맥 석회화 및 대식세포 침투를 이미징하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 근적외선 형광 이미징을 통해 전체 대동맥에서 석회화 및 대식세포 축적을 체외적으로 정량화할 수 있으며 죽상동맥경화증에서 염증과 석회화 사이의 기계론적 관계에 대한 이해를 심화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 동물의 대동맥 혈관 평활근 세포를 분리 및 배양하는 방법과 쥐 대동맥 또는 인간 관상 동맥에서 배양된 평활근 세포의 석회화를 유도하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 혈관 석회화를 모델링하는 이 시험관 내 방법은 치료를 위한 새로운 표적을 발견하기 위해 혈관 질환의 발병에 중요할 수 있는 신호 전달 경로를 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

그것은 매년 780,000 이상의 사망자를 차지하고 경우 심혈관 질환은 미국을 포함한 세계의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 1 관상 동맥 석회화 및 대동맥 석회화는 동맥 경화성 질환의 특징이며, 심혈관 질환의 강한 예측을 제공합니다. 2 내막 석회화 경화증과 연관 내측 만성 신장 질환, 당뇨병과 연관된 석회화 (또한 Mönckeberg라고도 함) 5 내막 석회화 지질 축적과 마크로파지의 설정에서 발생 혈관 석회화 4 2 가지 주요 유형은 성인에서보고되었다. 혈관 벽에 침투. 5,6 내측 벽 석회화는 독립적 내막 석회화가 발생 엘라스틴 섬유 또는 평활근 세포에 지역화 및 지질 증착 또는 대 식세포의 침윤과 연결되어 있지 않습니다. 5,7,8 연구를의 분자 메커니즘에혈관 석회화는 셀 기반 및 동물 모델 시스템에 의존하고있다. 중간 석회화에 대한 모델 매트릭스 GLA 단백질과 쥐를 포함하는 동안 atherocalcific 질환의 설치류 모델, 아포 지단백 E (아포 E) 9, 10 또는 저밀도 지단백 수용체 (LDLR) (11)는 고지방식이를 공급하거나 결핍 된 쥐를 포함 (MGP) 결핍 (12) 또는 가까운 총 신장 절제술 (5 / 6의 신장 절제술 모델) 또는 높은 아데닌 다이어트에 노출하거나 요독증을 개발 쥐. (13)

여기에, MGP 결핍과 관련된 중간 혈관 석회화의 모델에 초점을 맞추고 있습니다. MGP 동맥 석회화 억제 세포 외 단백질이다. MGP 유전자 12 돌연변이 Keutel 증후군 brachytelephalangy 외에 확산 연골 석회화 특징으로하는 드문 인간 질병, 청각 상실, 말초 폐 협착증에서 확인되었다. 14-18 아니지만 자주 관찰 (19)여러 동맥의 동심 석회화가. Keutel 증후군에 설명 된 uncarboxylated, 생물학적 비활성 MGP의 높은 순환 수준이 심혈관 사망률을 예측하는 동안 인간의 MGP 유전자의 20 일반 다형성은 관상 동맥 석회화 위험이 증가, 21 ~ 23과 연관된다. (24) 인간과는 달리 Keutel 증후군, MGP 결핍 된 마우스는 나이 2 주에서 시작 인해 대동맥 파열로 출생 후 6-8주 다이 자연 광범위한 동맥 석회화로 구성된 심한 혈관 표현형을 개발한다. (12)

아포 달리 - / - 및 LDLR - / - 마우스에 고지방식이를 공급, 연관된 대 식세포 유도 염증 내막의 혈관 석회화를 개발하는 MGP - / -. 생쥐 대 식세포 침윤의 부재에서 내측 혈관 석회화 개발 11,25 비록 이러한 연구 결과는 intim에 대해 서로 다른 기본 자극을 제안Al 및 내측 석회화, 예컨대 종양 괴사 인자 α 및 IL-1과 프로 골 형성 인자 같은 염증성 매개체를 포함한 혈관 석회화 기여 확인되었다 석회화. 26 다중 신호 전달 경로의 두 형태를 매개 시그널링 메커니즘 오버랩 존재 이러한 노치의 Wnt, 골 형태 형성 단백질 (BMP) 신호. 27,28 이러한 신호 전달 경로는 다시 뼈 관련 단백질의 발현을 증가 전사 인자 런트 관련 전사 인자 2 (Runx2)과 osterix의 발현 (증가 . - / - 및 LDLR - / - 마우스에 고지방 및 자발 먹이 예 석회화를 매개 맥관 구조에서, 오스테오칼신, sclerostin, 알칼리 포스파타제) 28-30 우리 등은 아포 관찰 혈관 석회화가 입증 - / - MGP에서 관찰되는 혈관 석회화 모든 뼈 형태 형성 단백질에 따라 마우스 (BMP)시gnaling하고, 여기에 초점이 경로이다. 11,25,31 BMPs에 뼈 형성을 위해 요구되는 강력한 골 형성 인자이다 인간 동맥 경화증의 발현 증가를 나타내는 것으로 알려져있다. 32-34 시험 관내 연구는 조절하는 BMP 시그널링을 연루 이러한 Runx2 같은 골 형성 인자의 발현. BMP 리간드 35-37 과발현, BMP-2, 고지방식이 공급 아포 E 결손 마우스에서 혈관 석회화의 개발을 가속화. (38) 또한, 이러한 억제제 시그널링 특정 BMP의 사용 - / - (39, 40) 및 / 또는 LDN-193189 (LDN)로 ALK3-FC 모두 LDLR 혈관 석회화 현상을 방지 마우스에 고지방 및 MGP 결핍 생쥐 먹이 11,25.

혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)가 혈관 석회화의 개발에 중요한 역할을한다. 30,41,42에서 개발 내측 혈관 석회화 MGP를 결핍 된 마우스는 charac입니다골아 세포 표현형에 혈관 평활근 세포의 분화에 의해 terized. 이러한 Runx2 및 오스테 오 폰틴 등의 골 형성 마커의 동반 상승 myocardin과 알파 평활근 액틴을 포함하여 혈관 평활근 세포 마커의 감소 식 MGP 결과의 손실. 이러한 변화는 혈관 석회화의 개발과 일치한다. 25,43,44

대동맥 석회화와 마우스에 염증이 일반적으로 말 석회화 조기 석회화 및 골 형성 활동, 폰 코사와 알리자린 레드 염색에 대한 알칼리 포스 파타 아제 활성 및 대식 세포 단백질 마커 (예. 대상으로 면역 조직 화학 프로토콜과 같은 조직 화학적 기술을 이용하여 평가된다, CD68, F4 / 80 맥 1 맥이 맥-3). 9,45 그러나,이 기준 영상 기술 의한 샘플링 바이어스 소모적이고 불완전한 시간 단면으로 대동맥 조직의 처리를 필요로하고 제한된 그들의 염증과 calcificat을 정량화 할 수있는 능력전체 대동맥에 이온. 이 프로토콜은 또한 제공. 시각화 전체 대동맥 및 중간 크기 동맥 석회화 근적외선 형광 (NIR) 분자 이미징 생체를 이용하여 대 식세포 축적을 정량하는 방법을 설명 수확 및 마우스로부터 주 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하여 유도하는 방법 위해 쥐와 시험관에서 인간의 혈관 평활근 세포의 석회화는 혈관의 석회화를 기본 분자 메커니즘을 확인합니다. 이러한 기술은 생체 내에서와 atherocalcific 질병 연구를위한 체외 방법에서 모두 연구자를 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

마우스 모든 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수 하였다. 주택과 본 연구에서 설명 된 쥐를 포함하는 모든 절차 (연구 동물 관리에 분과위원회)가 기관 동물 케어 및 사용위원회 매사추세츠 종합 병원의 승인 하였다. 모든 절차는 고통을 최소화하기 위해 신중하게 수행 하였다.

시약 1. 준비

  1. 전체 대동맥의 근적외선 형광 영상
    주 :. 형광 이미징 프로브는 하이드 록시 아파타이트에 대한 결합에 의해 (46, 47) 혈관의 골 형성 활성을 표시하는 데 사용할 수있는 근적외선 비스포스포네이트 유래, 카 텝신 활성화 형광 이미징 프로브 식세포 단백질 분해 및 elastolytic 활성에 대한 마커로서 작용할 수 맥관. 9 모두 형광 프로브의 동시 사용을 허용하기 위해, 그것은 중요스펙트럼 구별되는 프로브를 사용합니다. 표기 칼슘 NIR은 카 텝신 활성 특정 근적외선 형광 이미징 프로브를 나타내는 석회화 특정 근적외선 형광 이미징 프로브 및 카 텝신 NIR를 나타내는 데 사용된다.
    1. 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR의 솔루션을 준비합니다. 제조사의 프로토콜에 따라, 칼슘 또는 NIR 텝신 NIR 24 nmol의 함유 바이알에 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 1.2를 가하여 가볍게 흔들어.
      주 : 2-8 ℃에서 어둠 속에서 저장시 제조사에 따르면, 한번 PBS로 재구성 된, 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 용액은 14 일 동안 안정적으로 유지.
  2. 분리 및 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포의 석회화
    1. 대동맥 소화 해결 방법 :
      1. 175 U / ㎖ 유형 2 콜라게나 1.25 U / ㎖ 엘라 스타 제를 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 신선한 솔루션 (~ 3-5 ml의 당 대동맥 수확) 준비합니다. w 용액 살균및 0.22 μm의 진공 기반 여과 시스템 i 번째 사용할 때까지 얼음 솔루션을 유지.
    2. 셀 미디어 :
      1. 10 % 소 태아 혈청, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) 500 ml의 보충. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.
    3. 석회화 미디어 :
      1. 석회화 매체 A (NaPhos, 마우스 세포주에서 사용) :
        1. 10 % 소 태아 혈청, 2 mM 인산 나트륨, 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (필요한 부피)의 DMEM 100-500 ml의 보완. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.

          또는
      2. 석회화 미디어 B (βGP / ASC / DEX는, 마우스 또는 인간의 세포 라인 중 하나에서 사용) :
        1. 10 % 소 태아 혈청, 10 밀리미터-β 글리세로 포스페이트 나트륨, 50 μg의 / ㎖ L - 아스코르브 산, DMEM (10)의 100 ~ 500 ㎖ (필요에 따라 볼륨)을 보충나노 덱사메타손, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토. 사용하기 전에 37 ° C로 미디어를 따뜻하게.

2. 꼬리 정맥 주입

  1. 꼬리 주입하기 전에, 5 분 동안 약한 가열 램프하에 마우스 가온.
  2. 튜브 설치류 홀더에 마우스를 억제. 알코올 면봉으로 꼬리를 소독.
  3. 꼬리 정맥 주입을위한 30 G 바늘을 사용한다. 꼬리 정맥은 옆에 있습니다.
    1. 바늘이 꼬리에 진출함에 따라 주사기 앞으로 압력의 완만 한 금액을 적용합니다. 주입에 대한 내성이 더 이상 존재하면 정맥에 액세스하지 않는다.
    2. 정상 속도 칼슘 NIR 100 ㎕ 및 / 또는 카 텝신 NIR 100 ㎕의 부피 주입. 사출의 끝에서, 5 초 동안 정지 된 바늘을 철회.
  4. 대동맥 (3 절 참조) 주입 후 3-24 시간을 수확.

3. 마우스 해부

  1. 200 ㎎ / ㎏ 복강 내 펜토 바르 비탈 주입 마우스를 안락사.
  2. 해부 보드의 동물 부정사를 놓고 이사회에 각 발을 테이핑에 의해 안정. 해부 현미경 작은 가위를 사용하여, 상부 흉부에 하복부로부터 연장 정중선 절개를 만든다.
  3. 집게로 피부를 다시 껍질과 복부 장기를 공개, 복막를 제거합니다. 대동맥을 가로로 쪼개다 않도록주의하면서, 위장 기관을 제거합니다.
  4. 전방 다이어프램의 횡 절개를하고 복부를 가로 지르는 절개를 계속합니다. 해부 가위를 사용하여 갈비뼈의 측면을 통해 절단 및 흉골의 우수한 부분에 부드러운 조직의 부착을 제거하여 흉곽을 놓습니다. 폐를 공개, 흉곽을 제거합니다.
  5. 조심스럽게 폐를 제거 (식별 및 근위 대동맥 해부에 도움이) 처음에 장소에 마음을 둡니다. 관리, ensuri와 흉선, 기관 및 식도를 제거대동맥은 그대로 유지 ng를.
  6. 바로 미세 집게와 마이크로 해부 가위를 사용하여, 요정 대동맥 지방 (그림 1A)를 제거 할 때 세심한주의를 기울이고, 대동맥 궁에 장골 분기에서 대동맥 주변의 연부 조직을 제거합니다. 대동맥 궁 (즉, 팔 머리, 경동맥과 쇄골 하 동맥, 그림 1B)의 큰 가지를 둘러싸고있는 나머지 지방과 연부 조직을 제거합니다.
    참고 : 형광 이미징을 수행 할 때 지방이 배경 신호를 증가시킬 수 있기 때문에 대동맥에서 지방을 제거하는 것이 중요하다.
  7. , 흉강에서 마음을 제거 신중 근위 대동맥에서 그것을 분리, 폐기. 장골 분기에서 말초 대동맥을 가로로 쪼개다. 인슐린 주사 바늘을 사용하여, 남아있는 혈액 세포를 씻어 대동맥 궁으로부터 대동맥에 생리 식염수를 주입. 완전히 제거, 대동맥 궁 혈관과 함께 대동맥을 분리몸에서.
  8. 이미징을위한 준비가 될 때까지 얼음에 생리 식염수의 대동맥을 놓습니다.

4. 대동​​맥 영상

  1. 이미지 대동맥 생체 즉시 근적외선 반사율 형광 촬상하여 수확 후. 25
    1. 전술 한 바와 같이, 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR 주입 쥐의 대동맥에서 형광 신호의 강도를 정량화 할 수있는 적절한 멀티 채널 파장에서 형광 화상 카메라를 설정합니다. (25) 제조업체에 따르면, 칼슘 NIR은와 ~ 650-678 nm의 광에 의해 여기 될 수있다 ~ 680-700 nm의 범위의 최대 방출. 카 텝신 NIR은 ~ 770 nm에서 최대한의 방출로 ~ 745-750 nm의 광에 의해 여기 될 수있다.

기본 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포의 5. 분리

  1. 상술 한 바와 같이 단계 3.1-3.7를 수행합니다.
  2. 해부가 완료 될 때까지 차가운 HBSS에 대동맥을 놓습니다. 조심스럽게 어떤 REM 수면을 절단만 대동맥을 떠나, periaortic 지방과 연부 조직을 aining.
  3. 무균 조직 배양 후드에서 35mm X 10mm 조직 배양 접시에있는 대동맥 소화 솔루션에 대동맥을 전송합니다. 부드러운 간헐적 락 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 넣어. 소화 후, 대동맥이 늘어나거나 닳은 모양을 나타낸다.
  4. 그대로 중간 층을 유지하면서 해부 현미경 및 멸균 집게로, 대동맥의 외부 외막 층을 제거. 외막을 제거하기위한 하나의 기술은 일단 대동맥 외층을 벗겨 및 양말 다시 박리 및 제거 할 수 있었던 것처럼 하부 내측 층에서 제거한다.
  5. 외막 층이 제거 된 후, 2-4 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포 배양 배지 및 스토어로 새로운 조직 배양 접시에 남은 대동맥 놓는다.
  6. 멸균 후드와 멸균 3mm 마이크로 해부 가위를 사용하여 아래, 폭 1-2mm로 대동맥을 잘라반지입니다.
  7. 대동맥 소화 솔루션으로 새로운 조직 배양 접시에이 반지를 놓고 부드러운 간헐적으로 120 분 동안 흔들어으로 37 ° C에서 품어. 세포를 재현 탁이 인큐베이션 동안 용액 위아래로 수회 피펫.
  8. 15 ML 원뿔 튜브 소화 솔루션 및 전송에 따뜻한 세포 배양 매체의 5 ML을 추가합니다.
  9. 원심 200 x g에서 5 분 동안 튜브.
  10. 세포 배양 배지 (예, 5 ㎖)의 원하는 용적에 재현 탁 미디어 세포 대기음.
  11. 25 cm2로 세포 배양 플라스크마다 대동맥으로부터 분리 된 세포의 전체 양을 플레이트 및 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 전술 한 바와 같이, 배양 초기 7~10일 동안 25,48. 표준 기술을 사용하여 세포를 전파 매체마다 72-96 시간을 변경합니다. 세포가 합류에 접근, 더 자주 (매 48 시간)을 미디어를 보충.
    참고 : 충분한 ...로서 성장을 몇 주 걸릴 수 있습니다세포의 ntity.
  12. 합류 후에 트립신 통로 세포는 37 ° C로 가온된다.
    1. 각 문화 플라스크에 트립신의 0.5-1.0 ML을 추가하고 3-5 분 동안 품어; 표면에서 세포를 분리하기 위해 필요에 따라 부드럽게 매 30 ~ 60 초 플라스크의 측면을 누릅니다.
    2. 세포를 플라스크의 바닥에서 분리되면, 트립신으로 세포를 세포 배지 10 ㎖를 추가한다. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 펠렛으로부터 미디어 트립신 대기음. 신선한 세포 배지 (예, 50-10 mL)을 원하는 양으로 세포를 재현 탁하고 (챔버 슬라이드에 전달 일부 셀) 새로운 플라스크로 옮긴다.
  13. 이전 α-평활근 액틴에 대항하는 항체를 사용하여 49 바와 같이 셀의 제 1 통로에서, 표준 면역 세포 화학 기법과 평활근 세포 계통을 확인.

배양 부드러운 근육 6. 유도하는 석회화셀

  1. 플레이트의 세포를 6 웰 포맷 5.12 얻은. 참고 : 잘 추천 당 세포 미디어 2.0 ML의 총 부피에 1 × 10 5 세포 / 웰 시작.
  2. 세포를 6 웰 플레이트 형식으로 최소 7 일 동안 석회화 미디어 A 또는 B에서 성장 할 수 있습니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
  3. 세포 매체마다 48 시간을 변경합니다.

7. 폰 코사 염색 방법을 사용하여 혈관 평활근 세포 석회화 평가

주 :. 조직 또는 배양 세포의 세포 외 기질의 석회화를 측정하는 폰 코사 방법은은 이온과 인산 바인딩 칼슘 이온의 치환에 기초 50 빛과 유기 화합물의 존재 하에서,은 이온을 환원 금속으로서 시각화 은. . 미 반응은 소듐 티오 설페이트로 처리하여 50를 제거한 다음 폰 코사 염색에 대한 프로토콜이다 :

  1. 세포 CU에서 대기음 미디어lture 판.
  2. 실온에서 20 분 동안 10 %의 포르말린 1 mL에 넣어서 세포를 고정한다.
  3. 포르말린을 제거하고 5 분 동안 증류수로 고정 된 세포를 세척 하였다.
  4. 1-2 시간에 대한 60 ~ 100 W 전구에서 5 % 질산은 용액 1 ml의 세포를 품어.
  5. 질산은 용액을 흡인하고 5 분 동안 증류수로 세척한다.
  6. 5 분 동안 증류수 용액 (/ V W)을 5 % 티오 황산나트륨의 1 ml의 세포를 넣어 반응은을 제거한다.
  7. 5 분 동안 증류수로 세포를 씻어. 반복 세척은 3 배. 폰 코사 염색 표준 거꾸로 광학 현미경과 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
  8. 선택적 단계 : 5 분 동안 원자력 빠른 빨간색의 1ml를 함께 Counterstain과. 증류수 (5 분마다) 세 세척에이 사항을 따르십시오.

또는

8. 근적외선 형광 이미징과 혈관 평활근 세포 석회화 평가

참고 : 능력과 유사마우스 대동맥 내 석회화를 식별하기 위해, 칼슘 NIR 쉽게 배양 된 세포에 의해 증착 석회화 미네랄을 결합한다. 긴 파장 필터이 기술, 형광 현미경 및 플레이트 리더를 사용하면 이미지와 각각의 시험관 석회화를 정량화 할 수 있습니다. 칼슘 NIR의 긴 파장 방출은 다른 기능을 감지하는 낮은 파장 발광 형광체의 동시 이용​​이 가능합니다. 다음과 같이 칼슘 NIR 염색에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다

  1. 섹션 1.1.1에서 설명한 바와 같이, 칼슘 NIR 24 nmol의 들어있는 바이알에 1X PBS의 1.2 ml를 추가합니다.
  2. 칼슘 NIR의 1 개를 희석 : (100)를 적절한 석회화 또는 제어 미디어.
  3. 흡인 세포 배양 접시에서 미디어와 문화 매체를 NIR이 함유 칼슘으로 대체합니다.
  4. 하룻밤 37 ℃에서 칼슘 NIR 미디어와 문화 판을 품어.
  5. 우물에서 미디어를 기음과 PBS로 한번 우물을 씻는다.
    참고 :이 시점에서,원 배양액이 웰에 첨가 할 수 있고, 세포를 실시간 영상화 할 수있다. 그렇지 않으면 다음 단계로 진행합니다.
  6. 실온에서 20 분 동안 10 %의 포르말린 1 mL에 넣어서 세포를 고정한다.
  7. 포르말린을 제거하고 5 분 동안 증류수로 고정 된 세포를 세척 하였다. 반복 세척은 3 배.
  8. 선택 단계 :. 면역 형광 염색 또는 관심의 단백질에 대한 다른 대조 염색을 수행 8,9
  9. 이미지 또는 (예를 들어, 칼슘 NIR은 650-678 nm의 광에 의해 여기 될 수있다) 적절한 형광 여기 파장과 발광 필터 (~ 680-700 나노 미터)를 사용하여 칼슘 NIR 얼룩을 검출한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

- / - 대동맥 MGP 석회화와 야생형 마우스 칼슘 NIR 형광 이미징을 사용하여 측정 하였다. 어떤 칼슘 NIR 신호 석회화 부재 (도 2)를 나타내는 야생형 마우스의 대동맥에서 검출되지 않았다. 강한 칼슘 NIR 신호는 향상된 혈관 석회화와 일치 MGP 결핍 마우스의 대동맥에서 검출되었다. 야생형로부터 대동맥의 조직 절편 MGP - / - 야생형 마우스 검출없이 석회화 MGP-결핍 마우스에서 관찰 된 광범위한 혈관 석회화 확인 - 생쥐 알리자린 레드 25 (B도 3a)으로 염색 하였다. MGP 결핍과 관련된 혈관 석회화가 BMP 신호에 의존 여부를 확인하기 위해, MGP - / - 마우스가 인생의 1 일부터 시작 LDN, ALK3-FC, 또는 차량으로 처리 하였다. 이들 생쥐는 27 일 칼슘 NI...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

동맥 석회화는 인간에서 심장 질환의 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환의 발병에 직접적으로 기여할 수있다. 죽상 동맥 경화 질환의 얇은 섬유 대문자 1,5,52 내막 칼슘 증착 지역 역학적 스트레스 증가에 기여하는 것이 제안되어왔다 플라크 파열. 심장 비대를 유발하고 심장 기능에 영향을 미칠 수있는 동맥 경화를 증가시켜 53, 54 내측 석회화에 미치는 영향 임상 결과를. (55) 따라서, 인간의 질병에 중요한 통찰력을 제공하고 잠재적에 대한 새로운 목표를 식별 혈관 석회화의 기초 분자 메커니즘을 이해 요법.

여기서, 동맥 경화증과 석회화와 NIRF 영상을 이용한 혈관 석회화 뮤린 모델에서 대 식세포 축적을 검출하는 방법을 설명한다.도 9는 정확하게 NIR을 주입하는 것이 중요꼬리 정맥에 F 에이전트. 이 지배가 달성되기 전에 상당한 연습을 필요로하는 기술이다. (56) 또한,이 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

매사추세츠 종합병원은 죽상동맥경화증 및 혈관석회화 치료를 위한 BMP I형 수용체의 소분자 억제제 및 ALK3-Fc 적용과 관련된 특허를 출원했으며, MD, PBY, KDB 및 RM은 로열티를 받을 수 있습니다.

감사의 글

이 연구는 Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB 및 TET), Howard Hughes Medical Institute (TM), Harvard Medical School (DKR)의 Ladue Memorial Fellowship Award, RWTH Aachen (MD) 의학부 START-Program, German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), National Eye Institute (R01EY022746, ESB), Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signal의 지원을 받았습니다 폐 및 전신 혈관 질환의 발병기전, PBY, KDB 및 DBB), 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(R01AR057374, PBY), 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소(R01DK082971, KDB 및 DBB), 미국 심장 협회 교수상 #11FTF7290032(RM) 및 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(R01HL114805 및 R01HL109506, 이; K08HL111210, RM)입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 ml 원뿔형 튜브Falcon352096
30 G 바늘BD305106
알파 평활근 액틴 항체SigmaSAB2500963
챔버 슬라이드Nunc Lab-Tek154461
콜라겐 분해 효소, 타입 2 WorthingtonLS004176
DexamethasoneSigmaD4902
Dulbecco's Modified Eagle MediumLife Technologies11965-084
Dulbecco's Phosphate 완충 식염수, 칼슘 없음Gibco14190-144
ElastaseSigmaE1250
태아 소 혈청Gibco16000-044
겸자, 미세한 점RobozRS-4972
겸자, 전체 곡선 톱니 모양RobozRS-5138
포르말린(10%)전자 현미경 과학15740
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14025-092
인간 관상 동맥 평활근 세포PromoCellC-12511
인슐린 주사기TerumoSS30M2913
L-아스코르브산SigmaA-7506
마이크로 해부 스프링 가위(13mm)RobozRS-5676
마이크로 해부 스프링 가위(3mm)RobozRS-5610
NIR, 카텝신(ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, 골 형성 (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
NormalSaline Hospira0409-4888-10
핵 고속 적색Sigma-AldrichN3020
Odyssey 이미징 시스템Li-CorOdyssey 3.0
Penicillin / StreptomycinCorning30-001-CI
질산은 (5 %)리카 Chemical Company6828-16
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트Sigma-AldrichS-9390
티오황산나트륨SigmaS-1648
ß-글리세로포스페이트 다이소듐 염 수화물SigmaG9422
조직 배양 플라스크, 25 cm2Falcon353108
조직 배양 플레이트 (35 mm x 10 mm)Falcon353001
조직 배양 플레이트, 6웰Falcon353046
TrypsinCorning25-053-CI
튜브 설치류 홀더Kent ScientificRSTR551
진공 구동 여과 시스템MilliporeSCGP00525
바늘

참고문헌

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Von KossaImageJ

관련 논문