혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.
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방법 논문
대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
심혈관 질환은 전 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 지질이 함유된 대식세포와 석회화로 구성된 죽상경화성 플라크는 관상동맥, 대동맥 판막, 대동맥 및 말초 도관 동맥에서 발생하며 심혈관 질환의 특징입니다. 인간의 경우, 컴퓨터 단층 촬영을 통한 이미징을 통해 혈관 석회화를 정량화할 수 있습니다. 혈관 석회화의 존재는 미래의 심혈관 질환에 대한 강력한 예측 변수입니다. 심혈관 질환에 대한 새로운 치료법의 개발은 죽상동맥경화증의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 결정적으로 의존합니다. 죽상경화성 메커니즘에 대한 지식을 발전시키는 것은 쥐와 세포 기반 모델에 의존합니다. 여기에서는 스펙트럼이 뚜렷한 두 개의 근적외선 형광 이미징 프로브를 사용하여 대동맥 석회화 및 대식세포 침투를 이미징하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 근적외선 형광 이미징을 통해 전체 대동맥에서 석회화 및 대식세포 축적을 체외적으로 정량화할 수 있으며 죽상동맥경화증에서 염증과 석회화 사이의 기계론적 관계에 대한 이해를 심화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 동물의 대동맥 혈관 평활근 세포를 분리 및 배양하는 방법과 쥐 대동맥 또는 인간 관상 동맥에서 배양된 평활근 세포의 석회화를 유도하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 혈관 석회화를 모델링하는 이 시험관 내 방법은 치료를 위한 새로운 표적을 발견하기 위해 혈관 질환의 발병에 중요할 수 있는 신호 전달 경로를 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
그것은 매년 780,000 이상의 사망자를 차지하고 경우 심혈관 질환은 미국을 포함한 세계의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 1 관상 동맥 석회화 및 대동맥 석회화는 동맥 경화성 질환의 특징이며, 심혈관 질환의 강한 예측을 제공합니다. 2 내막 석회화 경화증과 연관 내측 만성 신장 질환, 당뇨병과 연관된 석회화 (또한 Mönckeberg라고도 함) 5 내막 석회화 지질 축적과 마크로파지의 설정에서 발생 혈관 석회화 4 2 가지 주요 유형은 성인에서보고되었다. 혈관 벽에 침투. 5,6 내측 벽 석회화는 독립적 내막 석회화가 발생 엘라스틴 섬유 또는 평활근 세포에 지역화 및 지질 증착 또는 대 식세포의 침윤과 연결되어 있지 않습니다. 5,7,8 연구를의 분자 메커니즘에혈관 석회화는 셀 기반 및 동물 모델 시스템에 의존하고있다. 중간 석회화에 대한 모델 매트릭스 GLA 단백질과 쥐를 포함하는 동안 atherocalcific 질환의 설치류 모델, 아포 지단백 E (아포 E) 9, 10 또는 저밀도 지단백 수용체 (LDLR) (11)는 고지방식이를 공급하거나 결핍 된 쥐를 포함 (MGP) 결핍 (12) 또는 가까운 총 신....
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프로토콜
마우스 모든 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수 하였다. 주택과 본 연구에서 설명 된 쥐를 포함하는 모든 절차 (연구 동물 관리에 분과위원회)가 기관 동물 케어 및 사용위원회 매사추세츠 종합 병원의 승인 하였다. 모든 절차는 고통을 최소화하기 위해 신중하게 수행 하였다.
시약 1. 준비
- 전체 대동맥의 근적외선 형광 영상
주 :. 형광 이미징 프로브는 하이드 록시 아파타이트에 대한 결합에 의해 (46, 47) 혈관의 골 형성 활성을 표시하는 데 사용할 수있는 근적외선 비스포스포네이트 유래, 카 텝신 활성화 형광 이미징 프로브 식세포 단백질 분해 및 elastolytic 활성에 대한 마커로서 작용할 수 맥관. 9 모두 형광 프로브의 동시 사용을 허용하기 위해, 그것은 중요스펙트럼 구별되는 프로브를 사용합니다. 표기 칼슘 NIR은 카 텝신 활성 특정 근적외선 형광 이미징 프로브를 나타내는 석회화 특정 근적외선 형광 이미징 프로브 및 카 텝신 NIR를 나타내는 데 사용된다.- 칼슘 NIR 및 카 텝신 NIR의 솔루션을 준비합니다. 제조사의 프로토콜에 따....
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결과
- / - 대동맥 MGP 석회화와 야생형 마우스 칼슘 NIR 형광 이미징을 사용하여 측정 하였다. 어떤 칼슘 NIR 신호 석회화 부재 (도 2)를 나타내는 야생형 마우스의 대동맥에서 검출되지 않았다. 강한 칼슘 NIR 신호는 향상된 혈관 석회화와 일치 MGP 결핍 마우스의 대동맥에서 검출되었다. 야생형로부터 대동맥의 조직 절편 MGP - / - 야생형 마우스 검출없이 석회화 MGP-결핍 마우스에서 관찰 된 광범위한 혈관 석회화 확인 - 생쥐 알리자린 레드 25 (B도 3a)으로 염색 하였다. MGP 결핍과 관련된 혈관 석회화가 BMP 신호에 의존 여부를 확인하기 위해, MGP - / - 마우스가 인생의 1 일부터 시작 LDN, ALK3-FC, 또는 차량으로 처리 하였다. 이들 생쥐는 27 일 칼슘 NI.......
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토론
동맥 석회화는 인간에서 심장 질환의 중요한 위험 인자 및 심혈관 질환의 발병에 직접적으로 기여할 수있다. 죽상 동맥 경화 질환의 얇은 섬유 대문자 1,5,52 내막 칼슘 증착 지역 역학적 스트레스 증가에 기여하는 것이 제안되어왔다 플라크 파열. 심장 비대를 유발하고 심장 기능에 영향을 미칠 수있는 동맥 경화를 증가시켜 53, 54 내측 석회화에 미치는 영향 임상 결과를. (55) 따라서, 인간의 질병에 중요한 통찰력을 제공하고 잠재적에 대한 새로운 목표를 식별 혈관 석회화의 기초 분자 메커니즘을 이해 요법.
여기서, 동맥 경화증과 석회화와 NIRF 영상을 이용한 혈관 석회화 뮤린 모델에서 대 식세포 축적을 검출하는 방법을 설명한다.도 9는 정확하게 NIR을 주입하는 것이 중요꼬리 정맥에 F 에이전트. 이 지배가 달성되기 전에 상당한 연습을 필요로하는 기술이다. (56) 또한,이 .......
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공개 사항
매사추세츠 종합병원은 죽상동맥경화증 및 혈관석회화 치료를 위한 BMP I형 수용체의 소분자 억제제 및 ALK3-Fc 적용과 관련된 특허를 출원했으며, MD, PBY, KDB 및 RM은 로열티를 받을 수 있습니다.
감사의 글
이 연구는 Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB 및 TET), Howard Hughes Medical Institute (TM), Harvard Medical School (DKR)의 Ladue Memorial Fellowship Award, RWTH Aachen (MD) 의학부 START-Program, German Research Foundation (DE 1685/1-1, MD), National Eye Institute (R01EY022746, ESB), Leducq Foundation (Multidisciplinary Program to Elucidate the Role of Bone Morphogenetic Protein Signal의 지원을 받았습니다 폐 및 전신 혈관 질환의 발병기전, PBY, KDB 및 DBB), 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(R01AR057374, PBY), 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소(R01DK082971, KDB 및 DBB), 미국 심장 협회 교수상 #11FTF7290032(RM) 및 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(R01HL114805 및 R01HL109506, 이; K08HL111210, RM)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 352096 | |
| 30 G 바늘 | BD | 305106 | |
| 알파 평활근 액틴 항체 | Sigma | SAB2500963 | |
| 챔버 슬라이드 | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| 콜라겐 분해 효소, 타입 2 | Worthington | LS004176 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
| Dulbecco's Phosphate 완충 식염수, 칼슘 없음 | Gibco | 14190-144 | |
| Elastase | Sigma | E1250 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16000-044 | |
| 겸자, 미세한 점 | Roboz | RS-4972 | |
| 겸자, 전체 곡선 톱니 모양 | Roboz | RS-5138 | |
| 포르말린(10%) | 전자 현미경 과학 | 15740 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 인간 관상 동맥 평활근 세포 | PromoCell | C-12511 | |
| 인슐린 주사기 | Terumo | SS30M2913 | |
| L-아스코르브산 | Sigma | A-7506 | |
| 마이크로 해부 스프링 가위(13mm) | Roboz | RS-5676 | |
| 마이크로 해부 스프링 가위(3mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, 카텝신(ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, 골 형성 (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Normal | Saline Hospira | 0409-4888-10 | |
| 핵 고속 적색 | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey 이미징 시스템 | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicillin / Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 질산은 (5 %) | 리카 Chemical Company | 6828-16 | |
| 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트 | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| 티오황산나트륨 | Sigma | S-1648 | |
| ß-글리세로포스페이트 다이소듐 염 수화물 | Sigma | G9422 | |
| 조직 배양 플라스크, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| 조직 배양 플레이트 (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| 조직 배양 플레이트, 6웰 | Falcon | 353046 | |
| Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
| 튜브 설치류 홀더 | Kent Scientific | RSTR551 | |
| 진공 구동 여과 시스템 | Millipore | SCGP00525 |
참고문헌
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposit....
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재인쇄 및 허가
