Summary
Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.
Introduction
Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) werden in der regenerativen Medizin sowie experimentelle Modellierung von normalen und erkrankten Organogenese aufgrund ihrer Differenzierungspotential in Zelllinien aller weit ausgebeutet drei Keimschichten 1,2. Die Differenzierung Schicksale von hPSCs sind sehr empfindlich auf lokale Umweltfaktoren , die 1 autokrine oder parakrine modulieren können Signalisierung sowie Mechanotransduktion Prozesse durch körperliche Signale vermittelt 3-5. Zelle Mikro umfasst eine Reihe von Techniken , die räumlich zu organisieren , um die Geometrie und die Position einer Zellpopulation als Mittel entwickelt wurden 3 die lokale zelluläre Mikroumgebung zu steuern, wie Zell-Zell - Wechselwirkungen 6 und Zell-Matrix - Wechselwirkungen. Im Rahmen der hPSCs wurde Zelle Mikro wichtige Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie beschäftigt Nischen abhängenent autokrine Signalisieren moduliert hESC Pluripotenz-Differenzierung Entscheidungen 7 und Organisation in der frühen embryonalen Differenzierungsmuster 6. 2D- und 3D mikro hPSCs wurden verwendet , um die Koloniegröße von mehrzelligen Mustern zu steuern, die wiederum beeinflusst Differenzierungs Entscheidungen in die drei Keimschichten 8,9. Wir haben vielzelligen HPSC Mikromuster verwendet , um das Ausmaß der Zell-Zell- und Zell-Matrix - Interaktionen innerhalb einer HPSC Kolonie zu modulieren , zu untersuchen , wie Integrin-E-Cadherin - Übersprechens 10 Anlass zu Zellschicksal Heterogenität geben kann. Die Demonstrationen aus den oben genannten Berichten eröffnen neue Wege in Richtung der Anwendung von mehrzelligen Mikro von hPSCs als experimentelle Modelle für Medikamententoxizität Screening auf Entwicklungsstörungen 11, die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Hormone während der Gewebe oder Organentwicklung zu studieren, und die Bildung von zu entwirren Gewebemuster.
Eine Vielzahl von Zell micropatterning - Techniken wurden von Falconnet et als prüft entwickelt. al. 12 , aber nur eine Handvoll, wie Mikrokontaktdrucken 7,8,13, Mikrowell - Kultur 14,15, Photostrukturierungs 6 und microstencils 16 wurden mit hPSCs erfolgreich umgesetzt. Die Herausforderung mit Mikro hPSCs liegt in ihrer Verletzlichkeit und einer stringenten Bedingung von spezifischen extrazellulären Matrices (ECM) und die Wachstumsbedingungen für die Zellhaftung und Überleben. Für 2D HPSC Muster ist Mikrokontaktdrucken eine der gebräuchlichsten Methoden HPSC Mikromuster auf Gewebekultur und Glassubstrate 13 zu erzeugen. Das Verfahren kann gemeinsam Muster ECM in HPSC Kultur verwendet werden, einschließlich Laminin und Basalmembran-Matrices wie Matrigel. Allerdings erfordert es in der Regel einen zweistufigen Beschichtungsverfahren unterstützt von Poly-D-Lysine und benötigt spezifische inerten atmosphärischen und Feuchtigkeitsbedingungen stabil ECM Mikromuster zu machen für hPSCs auf 6,13 zu befestigen. Die wichtigste Überlegung jedes Mikro Methode ist, ob die Oberflächenmodifikation Regime HPSC-Klebstoff ECM-Muster in der gewünschten geometrischen Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Zellbindung an die Umgebung erzeugen kann.
Hier berichten wir die Verwendung von Schablonenmikro als einfaches Verfahren HPSC Mikro ohne zusätzliche Oberflächenmodifikationsschritte vor der Erzeugung von Klebstoff ECM Muster zu erzeugen, um hPSCs zu befestigen auf. Die Zell Schablone besteht aus einer dünnen Membran, beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS) -Folie, mit micron Durchgangslöchern bis Millimetergröße auf ein Substrat Zellkultur abzudichtenden physikalisch ECM Beschichtungen und anschließend beimpft hPSCs enthalten. Als Schablonenmuster durch physikalisches Zurückhalten der Position arbeitet, wo HPSC kann an dem darunterliegenden ECM beschichtete Substrat direkt zuzugreifen und diese befestigen, ist dieses Verfahren kompatibel mit verschiedenen Substraten, die HPSC Kulturen unterstützen kann. Die einzigen requirement ist, dass die Wahl des Schablonenmaterial eine reversible Dichtung mit dem Substrat bilden kann. Diese Substrate umfassen herkömmliche Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) 17, Liganden konjugiert Substrate 18 sowie elastomere Substrate mit abstimmbaren Steifigkeit (z. B. PDMS) 19. Dieses Verfahren ermöglicht auch das Beschichten von verschiedenen ECM, wie Vitronectin (oder VTN - Protein), Laminin und Basalmembran Matrices (zB Matrigel und Geltrax) für die richtige Befestigung und die Differenzierung von hPSCs zu ermöglichen. Deshalb können wir für eine bestimmte HPSC Linie optimierte ECM-Substrat-Konfigurationen Transfer zum Schablone für eine optimale Zell-Matrix-Adhäsion, das Überleben und die Differenzierung Mikrostrukturierung. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren auch hepatische Differenzierung von Mikro hESCs unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Mikroschablonenanordnungen 16 zu leiten berichtet.
Zell Schablonen können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich erfülltals 20,21, Poly (p-xylylen) Polymere 22,23, PMMA und 16 am häufigsten, PDMS 24-28. Silicon und Poly (p-xylylen) Polymere Schablonen erfordern direkte Ätzen der Durchgangslöcher mit Spezialgeräten 20-23, was deren Zugänglichkeit für die biologische Anwender einschränkt. PDMS Schablonen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden , in Abhängigkeit von der Merkmalsgröße benötigt, die typischerweise von 3 & mgr; m bis 2.000 & mgr; m reicht 11,26-29. Wenn kleine Features gewünscht werden, dünne stenciling Blätter können durch Pressformen PDMS pre-Polymer auf einem mikrostrukturierten Silizium Vorlage mit Reliefs der Mikromuster 28 hergestellt werden. Für Funktionen> 1000 & mgr; m, bietet ein CO 2 Laser - Cutter eine einfache und kostengünstige Methode , um direkt die Muster auf einem bereits gegossenen PDMS Blatt während Schablonenherstellung geschnitten. Die Rezyklierbarkeit von PDMS Schablonen macht sie auch kosteneffektiv eine Reihe von Experimenten mit ausreichender Konsistenz durchzuführen.
10.
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Protocol
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von PDMS Schablone mit 1000 um Muster durch Laserschneiden und Mikrostrukturierung der hESC Linie, H9 die PDMS-Schablone verwenden.
1. Konstruktion und Herstellung von PDMS-Schablone zur Mikro
- Gestalten Sie das Schablonieren Blatt mit Durchgangslöchern der gewünschten Geometrie und Größe (zB 1000 um Kreise) und die Schablone Dichtung mit Computer-Aided - Design - Software - 10.
- Laser-schneiden Sie die stenciling Blatt und Dichtung auf 120-150 & mgr; m und 2 mm dicke Polydimethylsiloxan (PDMS) Blätter jeweils einen CO 2 -Laser-Schneider 10 verwendet wird .
- Bond, die PDMS-Dichtung mit der PDMS-Schablonenblatt unter Verwendung von flüssigem nicht gehärtete PDMS und backen bei 60 ° C für 3-4 Stunden die PDMS-Schablone für Mikrostrukturierung zu erhalten.
- Sterilisieren des PDMS Schablone durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und Trocknen in einem Ofen vor dem Gebrauch.
2. hESCs HauptWartung
- Kultur die hESC Linien in einem Zubringer freien Erhaltungsmedium auf 1 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix beschichtete Zellkultur - Platten bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Passage die hESCs, wenn sie etwa 70% konfluent sind durch 3 min Inkubation bei 37 ° C mit Dispase-Behandlung und mechanisch die HES-Kolonien in 100-200 um Klumpen dissoziiert. Platte , die die hESCs Klumpen in einer Dichte von 30 bis 50 Klumpen pro 9,6 cm 2 Wachstumsbereich auf Basalmembranmatrix beschichteten Gewebekultur Polystyrol bei 1: 6 Teilungsverhältnis.
3. Stencil Mikrostrukturierung von humanen embryonalen Stammzellen
- Vorbereitung vor Strukturierung der Zelle
- Siegel eine PDMS Schablone auf eine 60 mm Petrischale durch den Verzicht 700 & mgr; l 70% Ethanol Analysequalität in Reinstwasser in der Petrischale und legen Sie die Schablone an der Spitze.
- Legen Sie die Petrischale innen Biosicherheitsschrank über Nacht zu lassen ter Ethanol trocken.
- Check keine Blase unterhalb der Schablone vorhanden ist, um sicherzustellen, dass die Schablone mit der Petrischale eine gute Dichtung bildet. Dies verhindert ein Austreten von ECM-Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Petrischale und speichern unter sterilen Bedingungen, bis sie bereit für die Zellaussaat ist.
- Bereiten Sie Teilmengen von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix nach dem Analysezertifikat. Stellen Sie sicher, dass jeder Teilmenge ergibt 1 × hESC qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung, wenn in 25 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium verdünnt: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F12) nach Herstellerproduktblatt.
- Bereiten Sie die ECM-Beschichtungslösung durch Zugabe eines aliquoten von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix in 16,7 ml DMEM / F12 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung zu machen. Halten Sie alle ECM-Beschichtungslösung auf Eis Gelieren zu verhindern.
- Nachtrag hESC Erhaltungsmedium mit 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor (Y27632).
- Behandeln Sie die Petrischale mit 100 WO 2 Plasma für 90 Sekunden. Um die Sterilität zu gewährleisten, öffnen nur die Petrischale Abdeckung innerhalb der Plasmakammer vor der Plasmabehandlung, und schnell die Petrischale nach Abschluss der Behandlung abdecken zurück. Dies erleichtert die Benetzung der Oberfläche und verhindert die Bildung von Luftblasen in dem Mikrodurchgangslöcher während der Zugabe von ECM Beschichtungslösung.
- In 450 & mgr; l von 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung die gesamte Schablone zu decken. Abdichten der Petrischale mit selbstsiegelfähigen Folie, wie beispielsweise Parafilm, zu verhindern, dass die Lösung vor dem Austrocknen, und Inkubation für 5 h bei 37 ° C vor dem Gebrauch.
- Seeding hESCs auf die schablonen Substrat
- Untersuchen Sie hESC Kolonien in 6-Well - Platte , die die differenzierte Zellbereiche zu identifizieren , zeigt Verlust der typischen hESC Morphologie (zB Verlust von gerundeten, dicht packed epitheliale Morphologie, hohe Kern / Zytoplasma-Verhältnis mit prominenten Nukleolen). Entfernen Sie differenzierte Regionen ein Vakuum Absauger verwenden.
- Waschen Sie zweimal mit 2 ml DMEM / F12 pro Vertiefung.
- 1 ml von Verdauungsenzymen, wie Accutase, pro Vertiefung von 6-Well-Platte und inkubiere bei 37 ° C für 8 min. Tippen Sie auf die Platte sanft alle Kolonien von Substrat zu lösen.
- Spülen jede Vertiefung mit mindestens 4 ml DMEM / F12 pro 1 ml von Verdauungsenzymen und sammeln die Zellsuspension in 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Absaugen den Überstand zu entfernen und 400 ul hESC Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor (Rocki) ergänzt fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten 3-mal sanft Klumpen zu brechen in einzelne Zellen.
- Mischen Sie die Einzelzellsuspension gut und verdünnen 10 ul Zellproben in 190 ul DMEM / F12 (1:20 Verdünnung). Verwenden Sie einen hemocytometer der Zelldichte in der Lager-Zellsuspension zu bestimmen.
- Berechnen Sie die erforderliche Zellansiedlungsdichte für eine gegebene Schablone.
HINWEIS: Zum Beispiel haben wir experimentell die Zellansiedlungsdichte bestimmt eine konfluente Monoschicht aus einzelnen Zellen zu erhalten , beträgt etwa 4.444 Zellen / mm 2. Somit wird bei einer Dichte von 2 Millionen Zellen eine Zellsuspension zu erfordern / 400 & mgr; l eine Schablone mit einer Fläche von 450 mm 2 und seeding Volumen von 400 ul wird. - Von der Stammzellsuspension auf die gewünschte Aussaatdichte mit hESC Kulturmedium (Schritt 3.3.8 HINWEIS) mit Rocki ergänzt.
- Fügen Sie einen bestimmten Volumen der Zellsuspension, die erforderliche Anzahl von Zellen in jeder Schablone enthält, und lassen Sie die Petrischale in der Haube ungestört für 5 Minuten bei Raumtemperatur Zellen absetzen zu lassen.
- Übertragen Sie die Petrischale in Inkubator und Inkubation für 1 Stunde für die Zellbindung zu ermöglichen. Achten Sie auf die Petrischale Ebene während der zu haltenTransfer-Prozess, so dass die Zellen als Monoschicht in der Schablone bleiben.
- Stencil Entfernung und Passivierung von nicht gemusterten Substrat
- Untersuchen Sie die Petrischale unter einem Mikroskop zu überprüfen, ob Zellen richtig auf das darunter liegende Substrat befestigt sind.
- Absaugen weg von der Schablone Zellsuspension.
- 2 ml / Schale von 0,5% der Zellkultur kompatibel nichtionisches Tensid in DMEM / F12 zur Fläche der Schablone umgibt.
- Verwenden Sie ein Paar autoklaviert Zange vorsichtig auf die Schablone abziehen. Swirl das nichtionische Tensid-Lösung um, als die Schablone abgezogen wird, die Zellen zu verhindern, vor dem Austrocknen. Optisch beachten Sie die Mikromuster-Zellen in der Petrischale.
- Inkubieren der Mikromuster-Zellen in 0,5% nicht-ionisches Tensid-DMEM / F12-Lösung für 10 min bei 37 ° C.
- Absaugen entfernt das nichtionische Tensid-DMEM / F12-Lösung. Waschen Sie 3-mal mit 2 ml / Schale DMEM / F12.
- 2 ml / Schale von hESCErhaltungsmedium mit Rocki ergänzt und über Nacht bei 37 ° C inkubiert.
- Nach Inkubation über Nacht mit Rocki ergänzt Erhaltungsmedium absaugen hESC, waschen Sie einmal mit DMEM / F12 und mesoendoderm Differenzierung induzieren durch Zugabe von 2 ml / Schale von Differenzierungsmedium, ergänzt mit 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP-4 und 10 ng / ml FGF2 .
- Bewerten Sie die Mikrophasenkontrast - Bildgebung und die durchschnittlichen Brachyurie (T) Intensitätsprofile für jedes Muster berechnen , wie zuvor 8 beschrieben.
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Representative Results
In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung einer Zelle Schablone durch einen Laserschneider 1000 um Merkmale zu erzeugen. Die Schablone wurde aus 2 Teilen: einem dünnen Blech Schablonieren (ungefähr 100-200 & mgr; m dick), enthaltend die Mikrodurchgangslöchern und einem PDMS Dichtung die ECM Beschichtungslösung oder Zellsuspension zu enthalten. Hier, 127 & mgr; m und 2 mm dicken handelsüblichen PDMS Bleche wurden als Schablonieren Folie und Dichtung verwendet wurden. Andere Verfahren zur PDMS Blätter steuerbarer Dicke vorbereitet, wie Schleuderbeschichten, können auch die Teile herzustellen, verwendet werden. Die beiden Komponenten wurden miteinander verbunden , indem flüssiges ungehärtetes PDMS - Präpolymer-Vernetzer - Mischung als Klebstoff oder Plasma Bonden verwendet und für 3-4 h (Fig. 1) bei 60 ° C gebacken.
Das Material für das Schablonieren Blatt wurde auf der Grundlage der Wahl der Zellkultur s ausgewähltenubstrate. Wenn herkömmliche Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) als das Kultursubstrat verwendet wird , kann PDMS Schablonen , da die Nachgiebigkeit des PDMS Schablonieren Blatt verwendet wird , mit dem starren TCPS (E ~ 3 GPa) (Fig. 2A) , um eine gute Dichtung zu bilden. In experimentellen Designs , bei denen man wünscht , räumliche Heterogenität der Stammzellschicksals auf weicheren Zellkultursubstraten, wie beispielsweise elastomere PDMS Substrate mit einer abstimmbaren Steifigkeitsbereich von 5 kPa bis 2 MPa 30, steiferen Schablonieren Materialien zu untersuchen , können eingesetzt werden. Als Beispiel haben wir gezeigt , die Verwendung eines Polyethylenterephthalat (PET) Schablone (E ~ 2 GPa) 1 mm auf weicheren PDMS Substrat mikro HPSC Kolonien zu erzeugen , eine Steifigkeit von ~ mit 5 kPa (Fig. 2B). Die PET Schablone wurde durch Aufkleben eines PDMS Dichtung auf ein Schablonieren Blatt hergestellt aus kommerziell erhältlichen PET - Folien (Fig. 2B, Einschub). Wir stellen fest, dass die erforderliche Zellanheftung Zeit während des MikroVerfahren war länger (~ 3 h) auf dem weicheren PDMS Substrat Steifigkeits ~ 5 kPa im Vergleich zu herkömmlichen Substraten TCPS.
Wir verwendeten Schablone hESC Kolonien mikrostrukturiert, dass die räumliche Heterogenität in Zelladhäsion vermittelten mechanischen Kräfte könnten Muster Differenzierung früh mesoendoderm zu demonstrieren. Wir haben zuvor gezeigt , dass H9 hESCs an der Kolonie Peripherie höher Integrin Adhäsionen erfahren als Zellen in der Kolonie Innenraum, der in Brachyury (T) -positiven mesoendoderm Zellen in ihrer Vorzugs Differenzierung führte , wenn induziert mit Activin, BMP - 4 und FGF2 31 (Fig. 3A ). Wann wurden die Zellen in unterschiedlichen Geometrien gemustert (Kreis, Quadrat, Rechteck und Halbkreisbogen) bei einer konstanten Kolonie Bereich, geometrische Anisotropie an den Ecken von Quadraten, Rechtecke und konvex zu einer lokalen Konzentration von Integrin-vermittelten Traktionskräfte geführt Krümmungen und führte zu einer erhöhten mesoendoderm Differenzierung 32,33. Tatsächlich durch Abbilden T Expressionsintensität an verschiedenen Orten innerhalb einer einzelnen Kolonie, fanden wir , dass das Ausmaß der mesoendoderm Induktion höher war in scharfen Ecken von quadratischen und rechteckigen Kolonien (Fig. 3B) und konvexen Krümmungen eines Halbkreisbogens (Fig . 3C), die berichteten hohen Integrin-vermittelter Spannungsbereiche in einem anisotropen Geometrie 32,33 entsprach. Daher können Mikro verwendet werden, um die räumliche Verteilung der Zelladhäsion vermittelten mechanischen Kräften innerhalb eines intakten HPSC Kolonie als Mittel zur Modulierung der anschließenden Differenzierungsprozess zu steuern.
Abbildung 1. Erzeugung von PDMS Schablone für Mikro. (A) Schematische Darstellung der kritischen Schritte in Schablonenherstellung. A 127 & mgr; m dicken PDMS Blatt war laser-schneiden Sie die entworfene Muster und weitere 2 mm dicken PDMS Blatt wurde lasergeschnitten zu produzieren, die Dichtung zu erzeugen. Diese beiden Komponenten wurden miteinander verbunden , mit nicht ausgehärteten PDMS die Schablone zu montieren. (B) Bilder Montage der Komponenten zeigt , die mit 1 mm Kreisdurchgangslöcher eine PDMS Schablone zu bilden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. mikrostrukturierten hESC Kolonien (1000 um Kreise) auf verschiedenen Kultursubstraten. Mikroskopische Aufnahmen von hESC Mikrokolonie unmittelbar nach der Entfernung von (A) PDMS Schablonen (kleines Bild) verwendet , um hESC Mikro auf steifen Substraten, zB TCPS Steifigkeit erzeugen ~ 2 GPa, und (B) PET Schablonen (kleines Bild) Verwendet Mikro auf weicheren Substraten zu erzeugen, beispielsweise PDMS Steifigkeits ~ 5 kPa. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Wirkung von hESC Mikromuster unterschiedlicher geometrischer Formen auf ihre mesoendoderm Differenzierung 8. (A) hESC Mikromuster von verschiedenen geometrischen Formen , aber gleiche Kolonie Bereich wurden unter Verwendung von PDMS Schablonen erzeugt. Phasenbilder (oben) und die Intensität Karten von T - Expression (unten) nach 24 h mesoendoderm Differenzierung. (B) Durchschnittliche T - Intensitätsprofile (entlang weiß gepunkteten Linien in (A)) in einer isometrischen Kreis Kolonien oder anisometrischer quadratischen und rechteckigen Kolonien . Alle Kolonien hatten die gleiche Fläche ab Konzept 50% Kreis, der die Hälfte der Koloniefläche hatte. (C) Average T Intensitätsprofile von der konkaven oder konvexen Kanten in die Kolonie Innenraum in einem halbkreisförmigen Bogen, wie durch weiße gestrichelte Linien in (A) angegeben. Jedes Intensitätsprofil in (BC) ist ein Durchschnitt von 16 Intensitätsprofile von 4 Kolonien erhalten. Die Bilder werden neu gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Toh et. al., 8. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m und RFU ist relative Fluoreszenzeinheit. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Schematische Darstellung des Workflows hESC Kolonien zu Mikro und Differenzierung induzieren. Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von hESC Mikro sind in grauen Kästen hervorgehoben..com / files / ftp_upload / 54097 / 54097fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Herstellung von Mikro Schablonen
Stencil Mikrostrukturierung ist eine ideale Methode HPSC Mikro zur Untersuchung Nische vermittelte Differenzierung Strukturierung zu erzeugen. Der entscheidende Vorteil der Schablonenmuster über andere Mikrostrukturierungstechniken, wie Mikrokontaktdrucken und Photostrukturierungs, ist, dass sie nicht die Oberflächenmodifikation erforderlich ist und kann auf herkömmliche TCPS Substraten implementiert werden. Daher optimiert Kulturmedien und ECM Beschichtungen für verschiedene HPSC Linien können leicht zum Schablonieren Mikro übertragen werden.
Es gibt eine Anzahl von Schlüsselschritte bei der Herstellung der Zelle Schablone, die zur Erzeugung von Mikromustern gut bei. Die Treue der entworfenen Geometrien in den HPSC Mikro Wiedergabe ist abhängig von der Qualität und Konsistenz der Durchgangsbohrung Fertigung in der stenciling Blatt. Für Studien mit mehrzelligen micropatseeschwalben von> 1.000 & mgr; m, kann die Durchgangslöcher direkt durch Laserschneiden auf einem vorher gegossenen PDMS Blech hergestellt werden. Die Auflösung des Laserschneidens ist abhängig von der Punktgröße des Laserstrahls und der Genauigkeit der mechanischen Phase den Weg des Laserstrahls zu steuern. Für konventionelle CO 2 -Laser Schneider, fanden wir , dass sie kreisförmig oder gekrümmte Merkmale mit guter Treue aber nicht Geometrien mit scharfen Ecken erzeugen können (z. B. Quadrat). In Anwendungen , in denen kleine oder scharfe Merkmale gewünscht werden, können die Durchgangslöcher in dem Schablonieren Blatt durch Formen PDMS auf einer mikrofabrizierten Silizium - Vorlage hergestellt werden , enthaltend Reliefs der Mikromuster 28. Die Herausforderung des Formverfahrens ist Mikrogröße Durchgangslöcher in dünnen PDMS Blätter ohne Rest PDMS über dem Silizium template Reliefs zu erzeugen. Mehrere Strategien wurden , dieses Problem durch Li et wie beschrieben zu adressieren entwickelt. al. 28
Während der alssammlung der stenciling Blatt und Dichtung in die Zelle Schablone zu erzeugen, sollte man sicherstellen, dass das Schablonieren Blatt ist flach und frei von Staub während des Verbindungsprozesses, um Leckagen von der Schablone zu verhindern. Knicken der Schablonenbogen während des Verbindungsprozesses kann die Abdichtung der Schablone auf das Kultursubstrat beeinträchtigen, ECM und Zell verursacht Lösungen aus dem Mikrodurchgangslöchern austreten. Die Schablone sollte durch Autoklavieren (120 ° C, 30 min) und gründlich getrocknet in einem Ofen sterilisiert werden, um sicherzustellen, dass es eine gute Abdichtung mit dem Kultursubstrat bilden kann.
Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Wahl des Schablonieren Blattgut. Die PDMS Schablone ist ideal für Mikro hPSCs auf starre Kultursubstraten, wie TCPS mit einer Steifigkeit von ~ 2 GPa. Wenn man jedoch wünscht hPSCs auf weicher Substrate, wie auf PDMS - Substrate häufig verwendet , um tune Zellsubstrats Steifigkeit 34, die Vorschriftsmäßigkeit eines PDMS Mikrostenciling Blatt wird es schwierig, die Schablone nach der Zellaussaat Verfahren abzulösen, damit die HPSC Mikro zu zerstören. In diesem Fall muss die Materialwahl für das Schablonieren Folie der Schablone derart gewählt werden, dass sie eine Dichtung mit dem Kultursubstrat bilden kann, aber mit Leichtigkeit abgeschält werden.
Gene HPSC Mikro
Das Protokoll für die Mikrostrukturierung H9 hESCs auf TCPS Substrate eine PDMS Schablone hier präsentiert mit optimiert wurde eine konfluente Kolonie mit einer guten Lebensfähigkeit der Zellen und die Mustertreue zu erreichen. Es ist wichtig, dass die richtige hPSCs Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen innerhalb der räumlichen Einschluss einer bestimmten Geometrie bilden, durch die Mikrostrukturen so definiert, dass man untersuchen kann, wie geometrieabhängige Faktoren, Differenzierungs Schicksal zu beeinflussen. Wir haben ein paar wichtige Schritte identifiziert , um erfolgreich HPSC Mikromuster erzeugen (Abb. 4)und sie werden wie folgt diskutiert.
Zuerst zählt die Qualität der HPSC Kultur. Es ist wichtig, die HPSC Kolonien bei 70-80% Konfluenz zu ernten, mit Mehrheit der Kolonien undifferenzierten HPSC Morphologie zeigt, während die differenzierten Bereiche zu entfernen. Über konfluenten HPSC Kulturen meist spontane Differenzierung führen, und wenn die differenzierte Bereiche, die nicht vor der Zellaussaat entfernt werden, werden die differenzierten Zellen normale Differenzierung Musterbildung stören.
Zweitens, wenn Kolonien zu Einzelzellsuspension HPSC Ernte, die Vermeidung über Behandlung mit Verdauungsenzymen ist kritisch, weil dies häufig zu Zelltod nach Inkubation über Nacht, auch wenn die Zellen zunächst befestigen. Wir fanden, dass 8 Minuten enzymatische Behandlung für die H9 hESC Linie in unserem Labor kultiviert optimal ist; obwohl wir empfehlen, dass für verschiedene Zelllinien die Zellablösung Behandlungszeit separat optimiert werden sollte.
Schließlich besteht ein Bedarf, das Substrat umgebende die HPSC Mikro mit nicht zell Adhäsionsmoleküle, um zu passivieren Zellen innerhalb des Mikromuster zu beschränken proliferierenden oder zu differenzieren. Dies ist unerlässlich, um die Treue des HPSC Mikro zu halten und wiederum die biochemische und mechanische Umgebungs Gradienten für Differenzierungsmuster zu entwickeln. Zellkultur kompatibel nichtionische Tenside, wie Pluronic F-127 kann als Passivierungsmittel verwendet werden. Wenn mit Tensiden Passivieren, sollte die Behandlungszeit und Konzentration aufgrund der Zytotoxizität Tensid ist bei langen Belichtungszeiten optimiert werden. Wie wir bereits oben erwähnt, bietet die vorgestellte Protokoll eine detaillierte Richtlinie hPSCs mit einem PDMS-Schablone zu Mikro, aber die Optimierung dieses Protokolls, insbesondere für die oben genannten kritischen Schritte, wird ermutigt, successfully HPSC Mikro erzeugen.
Eine Einschränkung der Schablonenmikro ist, dass es geeignet ist, größere Mikromuster zur Erzeugung im Bereich von 100-1500 & mgr; m. Zur Erzeugung sehr kleiner Merkmale für Einzelzellmusterungs bestimmt sind, die Herstellung von Platten mit Schablonieren <50 um Durchgangslöcher ist sehr anspruchsvoll, wie vorher erwähnt. Daher erwarten wir , dass die Verwendung von Schablonen mit Mikro hPSCs gut geeignet ist Bildung vielzelliger Gewebemuster in verschiedenen Entwicklungsprozesse (zB neuroepithelium Klapp- oder endoderm Musterung) zu untersuchen.
Durch die Verwendung von Mikro geometrisch eine HPSC Population beschränken, können wir Zelladhäsion mechanischen 10 und parakrine vermittelte Signalgebung Gradienten 6 stellen die räumliche Organisation der resultierenden Differenzierungs Schicksal zu steuern und zu verstehen. Diese mikro HPSC Modelle mit räumlich organisiert differentiation kann wiederum übersetzt werden in eine humanspezifische Krankheit oder teratogen Screening - Modelle 11 für angeborene Geburtsfehler.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Start up Zuschuss (R-397-000-192-133) und ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592) Diese Arbeit wird von NUS unterstützt. GS ist ein NUS Forschungswissenschaftler. Autoren möchte Dr. Jiangwa Xing für ihre technische Unterstützung auf Zelle Mikro danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.005 | Used to form reservoir for stencil |
| 120-150 μm thick PDMS sheet | Specialty Silicone Products Inc., USA | SSPM823-.040 | Used to form stencil |
| 60 mm Petri dish | Nunc Nunclon Delta | 150326 | Substrate for micropatterning |
| Accutase | Accutase, Merck Millipore, Singapore | SCR005 | Enzyme to break H9 cells into single cells |
| Activin | R&D Systems, Singapore | 338-AC-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| BMP4 | R&D Systems, Singapore | 338-BP-010 | Growth factor for H9 differentiation |
| Plasma system | Femto Science, Korea | CUTE-MP | For plasma oxidation of stencil |
| Dispase | StemCell™ Technologies, Singapore | 7923 | Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging |
| DMEM/F12 | GIBCO, USA | 11330032 | Basal medium for H9 cells |
| FGF2 | R&D Systems, Singapore | 233–FB–025 | Growth factor for H9 differentiation |
| H9 cell line | WiCell Research Institute, Inc., USA | WA09 | Human embryonic stem cells |
| hESC-qualified basement membrane matrix | Matrigel, BD Biosciences, Singapore | 354277 | Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells |
| Inverted microscope | Leica Microsystems, Singapore | DMi1 | For capturing bright-field images |
| Laser cutter | Epilog Helix 24 Laser System | Used to generate through holes in PDMS sheet | |
| mTeSR™1 medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5850 | Maintainence medium for H9 cells |
| PDMS | SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA | 3097358-1004 | Used for sticking the PDMS stencil and reservior |
| ROCKi Y27632 | Calbiochem, Merck Millipore, Singapore | 688000 | Maintains H9 cells as single cells |
| STEMdiff™ APEL™ medium | StemCell™ Technologies, Singapore | 5210 | Differentiation medium for H9 cells |
| Polyethylene terephthalate film | SureMark Singapore | SQ-6633 | Used to form stencil |
| Cell culture compatible non-ionic surfactant | Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore | P2443 | Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates |
References
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