Abstract
マイクロRNA（miRNAは）（無細胞の）循環血液流に細胞から放出されます。循環中の特定のマイクロRNAの量は、疾患状態に連結され、疾患のバイオマーカーとして使用する可能性を有するされています。デジタルPCR技術染料系化学を用いて、液滴マイクロRNA定量を循環させるための高感度で正確な方法が最近開発されました。具体的には、ロックされた核酸（LNA）を使用することは、特定のmiRNAの絶対的な定量化を得ることができる互換性のある液滴デジタルPCRシステムにおいて緑色蛍光DNA結合色素とのmiRNA特異的プライマーをベース。ここでは、そのような血漿および血清などの生物学的流体、中のmiRNAの量を評価するためにこの技術を実行方法について説明し、実行可能かつ効果的です。
Protocol
血漿または血清からのマイクロRNAの単離
注：血漿および血清調製は、miRNAの定量化を循環関連のステップです。血漿および血清の調製のための好ましい手順はありません。検討する唯一の重要なことは、同じ実験からの全てのサンプルは正確に同じワークフローを使用して処理しなければならないことです。 200μlの血清または血漿から開始します。総RNAは、市販のキットを用いて血清または血漿から単離することができます。
1.（miRNAを含む）全RNAのためのプロトコルの単離
- 氷上で解凍血清/血漿サンプル。
- 200μlの血清/血漿に溶解試薬 （ 例えば 、のQIAzol）の1ミリリットルを追加します。
- ボルテックスで混合し、室温で5分間、ベンチのホモジネートを含むチューブを置きます。
- Cから合成miRNA CEL-のmiR-39-3pの4.16 nMの溶液を3μLを加えますエレガンス 。
- 200μlのクロロホルムを追加します。 15秒間激しくチューブを振ります。目を配置します2分間室温でベンチ上の電子管。
- 相分離を得るために4℃で12,000×gで15分間遠心操作：上部の水相は、RNAが含まれています。
- 任意の白相間材料の移動を防ぐため、約700μlを、新しいチューブに水相を転送します。
- 100％エタノールの1ミリリットルを加え、反転により混合します。
- 最大700μlのサンプル2 mlのコレクションチューブ上に配置されたミニスピンカラムにピペットで。 15秒間12,000×gで蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。
- 残りのサンプルを使用して、この手順を繰り返します。
- ミニスピンカラムに700μlのBuffer RWTを追加し、カラムを洗浄するために12,000×gで15秒間蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。
- ミニスピンカラムにピペットで500μlのBuffer RPE。 12,000 rpmで15秒間蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。もう一度この手順を繰り返します。
- スピンカラムを乾燥させるために2分間フルスピードでミニスピンカラムを遠心残留エタノールからの膜。
- カラムのメンブレン上に新しい1.5 mlコレクションチューブとピペット35μlのRNaseフリー水にミニスピンカラムを移します。
- RNAを溶出するために12,000×gで1分間遠心します。
- -80℃でRNAを保管してください。
注：RNAの濃度を正確に決定することができないので、入力された量の尺度として固定ボリュームを使用します。
2.マイクロRNA逆転写
- 5×反応緩衝液、ヌクレアーゼフリー水：逆転写（RT）試薬ミックス成分を解凍。氷の上管と場所を反転穏やかに混合します。使用直前に、冷凍庫から酵素混合物を除去し、氷の上に置きます。すべての試薬をスピンダウン。
- 表1に記載されているように氷上でRT試薬ミックスを調製する。少なくとも10％超えるミックスを調製します。
- ピペット操作によって反応をミックスし、その後スピンダウン。
- 42℃で60分間インキュベートします。
- reverを熱不活性化95℃で5分間SE転写酵素。
- 直ちに4℃に冷却します。
- -20℃でのcDNAを保管してください。
3. cDNAを希釈
- ヌクレアーゼを含まない水で計画ddPCR反応に必要なcDNAテンプレートの量を希釈します。午前1時50分と1の間のcDNA反応を希釈水で500、標的miRNAの豊富さに依存します。 -20°Cで希釈したcDNAを保管してください。希釈されたcDNAを、-20℃で少なくとも3ヶ月間安定であることが判明しました。
4.ドロップレットの生成とPCR
注意：小滴の生成は、一度に8個のサンプルで実行する必要があります。技術的反復が原因12,15 .Aテンプレートなしのコントロール（NTC）サンプルは、すべてのプレートで実行する必要があり、この技術の高い再現性に、それぞれ異なるddPCR条件のために、必要とされていません。
- 解凍し、マスターミックスを平衡化（ 例えば 、EvaGreenマスターミックス）RTで、マイクロRNAプライマーセットおよびcDNA。
- マスターミックス番目のミックスoroughlyチューブを数回反転させることによって。すべての試薬をスピンダウン。
- 表2に記載されているようにddPCRミックスを調製する。複数のddPCR反応が行われた場合、ddPCRが作業-溶液を混合用意。少なくとも10％超えるミックスを調製します。
- 組み立てた後、十分に混合するとddPCRミックスをスピンダウン。
- ddPCR12μlの96ウェルPCRプレートまたはPCRチューブに混合分配。
- ウェル/各チューブに希釈したcDNA鋳型の8μlを添加します。
- ホルダーに液滴発生器のカートリッジを挿入します。
- 空気を回避しながら、液滴発生器のカートリッジのサンプルウェルに移し、各調製した試料を20μl（中段）、慎重には、井戸の底に泡。
- 液滴発生器油の70μlの各油井（下段）を入力します。
- カートリッジホルダーの上にガスケットをフックし、液滴発生器に挿入します。
- メーカーの広報に係る液滴生成を開始するためにふたを閉めotocol。液滴生成が完了したら、ふたを開け、使い捨てガスケットを取り外します。カートリッジの上部ウェルは液滴を含んでいます。
- 96ウェルPCRプレートの単一の列に8トップウェル（液滴）の内容のピペットでゆっくりとスムーズに40μlの。
- 直ちに蒸発を避けるために、液滴を移送した後、ホイルでPCRプレートを密封します。液滴リーダーに針と互換性のある穿刺可能なホイルプレートシールを使用してください。
- プレートを封止し、30分以内に熱サイクル（PCR）を開始します。
- 表3に記載のサイクリングプロトコルを実行します。
5.ドロップレット読書
- 液滴リーダーの電源をオンにします。
- 液滴リーダーにサーマルサイクラーからプレートを移動します。
- プレートホルダーのベースにPCR後の液滴を含む96ウェルPCRプレートを置きます。
- PCRプレート上にプレートホルダーの上部に配置します。しっかりと両方のリリースタブを押してくださいダウンホルダーにPCRプレートを固定します。
- システムのPCからソフトウェアを起動します。
- 実験（絶対定量化）を定義するために、セットアップをクリックした後の液滴の読み取りを開始するには[実行]をクリックします。
- 液滴の読み取りが完了すると、データを開き、分析するためのボタンを「分析」をクリックします。
- 正の滴（なげなわツール）（ 図1B）を選択するために、解析ソフトウェアで2D振幅プロットを使用してください。
- 正と総滴数を確認するには、[イベント]タブを使用します。 18000の総数 - 21,000液滴は、通常probeless ddPCRで達成されます。
- 正の液滴を選択したら、集中タブからの輸出の.csvオプションを使用して、miRNAの濃度値をエクスポートします。
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Representative Results
血漿または血清の1ml当たりの特定のmiRNAの絶対量は、緑色蛍光DNA結合色素を用いて測定し、デジタルPCR技術滴することができる。 図1は、最終的なmiRNAの濃度を決定する正の液滴の選択、（コピー/μLのプロセスを示します）解析ソフトウェアにより計算増幅反応です。血液中の各miRNAの量が他のものよりも豊富ないくつかのmiRNA種であること、非常に異なっています。 ddPCR反応で1:50希釈されたcDNAを用いて、正および負の液滴の適切な数を得ることが可能です。正の液滴飽和（ 例えば 、残存負滴）の場合は、cDNA試料のさらなる希釈が必要であってもよいです。
すべてのLNAプライマーセットは、液滴デジタルPCRシステム上で正しく動作するように最適化されるべきです。 miR-181A-5Pの最適化処理であります図2に示される具体的には、（通常は0.25の範囲内- ddPCR反応あたり1μlの）プライマーの量を変化させる。（通常56の範囲で- 60℃）のアニーリング温度は、組み合わせを選択することができますそれは、正と負の液滴間のより良好な分離を決定します。 miR-181A-5Pの場合には、60℃のアニーリング温度との両方の0.5と1μlのプライマーの量は、液滴の大きさの点でより良い結果を提供します。
プライマーセットは、おそらくプライマーダイマー形成に、いくつかの非特異的増幅を与えることが発生する可能性があります。 miRNAを循環して作業する場合、試料からの陽性シグナルが非常に低いため、非特異的シグナルと同様にすることができます。非特異的な標的増幅の「雲」が真の信号（ 図1C）と重なっていない場合、miRNAはまだ唯一の真の選択定量化することができます正の滴。この場合、NTC試料は、液滴の選択のために必須です。同じ分析に含まれる全てのサンプルは同じ方法および同じddPCR条件を使用して処理する必要があります。
図1.ポジティブ液滴の選択 。正の液滴は、手動1Dプロット（A）において、負の液滴上にしきい値を使用するか、2次元プロット（B）において陽性の液滴の雲の周りに円を実行する分析の間に選択されます。いくつかのプライマーセットは、非特異的な増幅を与える場合、これは、陰性対照（無鋳型対照、NTC）サンプル（C）に現れる正の液滴の第二の雲によって証明されます。 "真"の陽性はまだ2Dプロットにおける非特異的なシグナルを除く選択することができます。e.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Probeless ddPCRと無細胞miRNAを定量化するため、図2のプライマーの最適化アッパーパネル：4つの異なるddPCR条件を使用して、2つの血漿サンプル（S1およびS2）におけるmiR-181A-5Pの定量。 MIR-181A-5P LNAのプライマー濃度（0.5および1マイクロリットル）およびアニーリング温度（58〜60°C）は、DNA挿入色素ddPCRで陽性（青）の振幅と負（黒）の液滴に影響を与えます。このmiRNAのための良好な分離は、60℃でPCRを行い、0.5または1μlのプライマーを使用して得ることができます。期待どおりにコントロールサンプル（NTC、テンプレートなしのコントロール）は、肯定液滴を持っていません。中央パネル：上記条件におけるmiR-181-5pの最終濃度。結果はAMPLIにおけるマイクロリットル当たりのコピーとして提示されていますfication反応。エラーバーはポアソンの95％信頼区間を表します。下のパネル：。液滴（緑）の合計数にプラスの滴（青）の数この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬 | 容量（μL） |
| 5×反応緩衝液 | 4 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 11 |
| 酵素ミックス | 2 |
| テンプレートの総RNA | 3 |
| 全容積 | 20 |
表1 - 逆転写試薬ミックスコンポーネント
| 試薬 | 容量（μL） |
| 2倍のDNA結合色素スーパーミックス | 10 |
| LNAのプライマーセット | 変数（0.5から1）* |
| ヌクレアーゼフリー水 | 変数 |
| 希釈されたcDNA鋳型 | 8 |
| 全容積 | 20 |
| *最初ddPCR反応は、プライマーの最高の作業量を確立するために、いくつかのサンプルを使用して実行する必要があります | |
表2 - ddPCR試薬ミックスコンポーネント
| サイクリングステップ | 温度 | 時間 | ランピングレート | サイクル |
| 酵素活性化 | 95°C | 5分 | 〜2℃/秒 | 1 |
| 変性 | 95°C | 30秒 | 40 | |
| アニーリング/伸長 | 60°C | 1分 | ||
| 信号安定化 | 4°C | 5分 | 1 | |
| 90°C | 5分 | 1 | ||
| ホールド（オプション） | 4°C | 無限 | 1 | |
| 105℃に設定し加熱蓋を使用し、40μlにサンプルボリュームを設定します。 | ||||
表3 - 液滴デジタルPCRのサーマルサイクリング条件
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Discussion
循環するmiRNAは、非常に低濃度で血液中に存在し、血漿および血清試料から抽出することができるRNAの量は低いです。この理由のため、それらは、マイクロアレイおよびRNA配列のような他の技術を用いて定量化することは困難です。また、データの正規化と血液中の内因性の「基準」のmiRNAの存在に合意の一般化が欠如しています。この文脈において、液滴デジタルPCRのような敏感な技術は、非常に低い場合には、血清または血漿の1mlあたりのmiRNAのコピー数をカウントすることが可能な、非常に魅力的です。私たちは、逆転写、したがって、時間を節約し、最も重要な、RNA材料1の反応ですべての循環のmiRNAをユニバーサルcDNAのシステムでこの技術をペアリング。我々のアプローチでは、特異性は、他のソリューション16と比較した場合のmiRNA定量化は非常に好調LNAプライマーの使用に固有のものです。
滴デジタルPCRは、標的遺伝子の絶対濃度の計算を可能にするエンドポイントアッセイです。定量PCRとは異なり、不十分な増幅効率は、最終的なddPCR定量に影響を与えません。したがって、血液サンプル内のインスタンスのための、本PCR阻害剤の量を考慮し、ddPCRは、核酸の評価を循環させるための強力なツールを提供します。
その高い感度のために、技術は、さらに、出発材料の限られた量で、またあまり豊富miRNAの適切な定量化を提供します。また、それぞれのmiRNA分子を逆cDNA分子に転写されると仮定すると、我々は、希釈係数（145.83）用ddPCR反応値が得られた濃度を乗算1μlの血漿/血清中の絶対的なコピーを算出することができます。
提示されたワークフローは、簡単にこのようクリニカにおけるマイクロRNAの定量化のための信頼性が高く、時間の効果的なツールを提供し、一度に8から96のサンプルに対して行うことができますリットルサンプル。液滴デジタルPCRは、核酸のための不可欠なツールになる可能性は、それによって枕元にベンチから液体生検をもたらし、診断設定で評価をバイオマーカーました。
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Acknowledgments
（ - 2010/15、9980ミルのn個当たり5。特別プログラム分子臨床腫瘍）と命令のイタリア省から、大学や癌研究のためのイタリア語協会（AIRC）からMF（MFAG 11676）にし、MNに資金を提供することによってサポートされていますMNへの研究FIRB 2011（プロジェクトRBAPIIBYNP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma |
| 100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG |
| Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | Kit for microRNA reverse transcription |
| MicroRNA LNA PCR primer set | Exiqon | 204000-206xxx and 2100000-21xxxxx | Primers for miRNA amplification inside droplets |
| QX200 droplet generator | BioRad | 186-4002 | Instrument used for droplet reading |
| QX200 droplet reader | BioRad | 186-4003 | Instrument used for droplet generation |
| QuantaSoft software | BioRad | 186-3007 | Software for data collection and analysis |
| PX1 PCR plate sealer | BioRad | 181-4000 | Plate sealer |
| DG8 droplet generator cartridges and gaskets | BioRad | 186-4008 | Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets |
| QX200 ddPCR EvaGreen supermix | BioRad | 186-4033/36 | PCR supermix |
| QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye | BioRad | 186-4005 | Oil for droplet generation |
References
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