Abstract
该报告提出了捕获抗体对纤维素滤纸级第1号（中流动滤纸）光盘和品位第113号（快流过滤纸）盘共价固定两种方法。这些纤维素纸圆片通过硅烷偶联技术与胺官能团接枝分别固定在它们之前的抗体。高碘酸盐氧化和戊二醛交联方法被用来接枝的纤维素纸光盘捕获抗体。为了确保捕获抗体与固定后其目标的最大结合容量，不同浓度的高碘酸钠，戊二醛，和纸张的盘的表面上的捕获抗体的效果进行了研究。相比于高碘酸氧化法时通过戊二醛交联剂涂布在胺官能化的纤维素纸的光盘，该抗体显示增强对目标结合活性。 IgG抗体（小鼠参考血清）用作参考目标在这项研究中，通过戊二醛测试共价固定化抗体的应用。一种新的纸质，酶联免疫吸附测定（ELISA）已成功开发和验证用于检测IgG抗体。此方法不需要设备，它可以检测100纳克/毫升的IgG。快速流滤纸比介质流滤纸更敏感。这个实验的潜伏期很短，所需的小样本量。这种裸眼，比色免疫测定可以扩展，以检测与常规的ELISA确定的其他目标。
Introduction
在床边血糖检测（POCT）诊断性研究是对新战略的发展疗法，个性化医疗和家庭护理1重要。纤维素论文被广泛应用于免疫作为平台，因为它们价格便宜，方便，并为用户所熟悉2。此外，纤维素纸的多孔结构具有以驱动液体流动没有额外的能量冲击力。纸基生物分析的记录可早在20 世纪 ，当纸层析最初发明于1952年，最普遍的例子是免疫测试3，如妊娠糖尿病试纸发现。这些测试提供了相对快速的检测时间和廉价的分析4。由于其简单性，这些常规纸带试验已广泛应用于POCT诊断5。
检测方法包括色度6，电化学7，和电化学发光8的方法已被报道用于测量生物样品中的目标。除了这些定量方法，用于固定在纤维素纸的抗体的可靠方法也是诊断设备的开发非常重要。具体的非吸附是用于修改纸基装置9，10的表面上的抗体，以确保固定后最大结合容量到其目标的主要策略。然而，先前的研究中 表明，被吸附到纤维素纸抗体可以通过40％从纤维11解吸。因此，直接吸附抗体的纤维素上可能不会提供可重复的结果12。被纸张表面上的接枝的抗体的共价固定是开发有效的纸基生物分析13的另一种方法。各种方法已被报道用于纤维素14,15的变形12日后其原有功能。羰基与1-氰基-4- dimethylaminopyridinium四氟硼酸16相结合;通过紫外线基于激活策略17,18 1-氟-2-硝基-4- azidobenzene;基于木聚糖改性19酶法战略; 1,4- phenylenediisothiocyanate连接剂20;杂氧化21点击化学22;和阳离子卟啉23已被用于共价固定在纤维素纸的生物分子。脱乙酰壳多糖改性的纸张已被用于开发基于纸张immunodevices 24-26，因为它是丰富的，生物相容的27。壳聚糖是阳离子，并强烈坚持的阴离子纤维素27。捕捉抗体被固定在通过壳聚糖涂层和戊二醛交联的纸。碘酸氧化是嫁接上尉的另一种方法在纤维素纸28 URE抗体。在该方法中，高碘酸钠点样在纸上直接转换1,2-二羟基（乙二醇）基团在纤维素到醛基。然后醛基被用于形成多糖和抗体28之间形成共价键。虽然制造很简单，它是很难完全洗出高碘酸钠。未洗涤的高碘酸钠可引起该被固定在纤维素纸的抗体的进一步氧化，影响抗体的活性和稳定性N - （3-二甲氨基丙基） - N -ethylcarbodiimide盐酸盐和N-羟基交联剂也可用于共价固定化于基于纳米纤维的测定29的显影静电纺丝聚L-乳酸和醋酸纤维素纳米纤维的抗体。
在这项研究中，硅烷耦合技术用于嫁接cellulos胺官能团Ë纸片。这种技术有助于保留原孔隙尺寸，芯吸和纤维素滤纸的过滤速度，从而最大垂直流过在免疫测定。硅烷偶技术已广泛应用于生物传感器官能与仲胺基基材表面，接着进一步修饰使用的生物分子。胺基的基质表面上接枝包括有机官能硅烷试剂的-OH基团和矩阵基板30之间的缩合反应。纤维素纸圆片至3-丙基三甲氧基硅烷（APS）31与由硅烷偶胺基官能化。其次，通过使用两种不同的方法共价固定化的捕获抗体。第一种方法涉及到胺功能纤维素纸碟碘酸氧化捕获抗体结合。第二种方法使用戊二醛作为交联剂附着捕获antibodi下载到胺基团官能化的纤维素纸的光盘。捕获抗体的存在用兔抗人IgG-异硫氰酸荧光素（FITC）证实，使用荧光分子成像仪。到山羊抗兔IgG兔抗人IgG-FITC的结合活性也通过过氧化物酶底物进行评价。各种浓度的高碘酸钠，戊二醛，和捕捉抗体的效果进行了研究。通过检测的IgG血清的混合物成功地进行了固定的捕获抗体的应用试验。
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Protocol
1.纤维素纸片嫁接胺功能团
- 准备一块方形纸用的使用打孔器1厘米* 1厘米，和100纸片从1级号纤维素纸用直径为6.0毫米（中流量滤纸）制成的尺寸。
- 以导出在纸张盘-NH 2基团，在50毫升的玻璃瓶中通风柜混合1毫升APS和10毫升丙酮。纸张盘添加到新鲜制备的APS试剂混合物中，并孵育5小时，在室温下32轨道搅拌（200rpm）。
注意：处理APS和丙酮在通风柜。 - 从倒出50毫升的玻璃酒瓶多余的溶液成一个有机废弃物容器中。
- 10ml丙酮加入玻璃瓶，拌匀完全倒出，以消除任何未反应的APS和其他杂质。重复此步骤两次。
- 铺在纸巾和地点纸片在110℃烘箱中3小时。允许纸片冷却。在室温下储存在50ml离心管中的光盘。
- 使用傅立叶变换红外光谱（FTIR）来检查纤维素正方形纸胺基的接枝，如下所述（ 图3A）。
- 打开电脑，打开红外光谱仪。
- 打开红外光谱的软件。
- 进入“测量→初始化”。对于“BS：溴化钾”矩形“灯：红外线”和“激光”会当初始化完成后变为绿色。
- 选择“数据”矩形下方，并选择“％透光度'，'HAPP-Genzel'，'45'，'4.0'和'最小：400，最大：4000”代表“测量模式”，“变迹”，“没有。的扫描“，”分辨率“和”范围（-1）'。
- 点击“措施”。
- 选择“数据文件”的背景资料。写下来的意见。
- 点击“BKG”能为背景的基线。
- 固定在膜样品保持器的正方形的纸张。
- 选择“数据文件'的样本数据。写下意见。
- 点击“样本”，以获得样品的光谱。
- 关闭红外光谱应用和关闭计算机。
- 重复上述步骤（步骤1.1-1.6）以制备胺-官能化级113号纤维素正方形纸和光盘（快流滤纸），将获得的FTIR光谱的113级号正方形纸（ 图3B）。
抗体对胺官能化纤维素纸影碟2.共价固定化
由两种不同的方法图1.抗体的共价固定。一，固定在通过高碘酸氧化胺官能化的纤维素纸碟抗体。所述碳水化合物残基被高碘酸钠氧化，产生醛官能团。然后，被氧化的抗体加载到胺官能纤维素纸盘; B。然后将抗体固定于通过戊二醛胺官能纤维素纸光盘。该胺官能化纤维素纸圆片浸入0.05％戊二醛溶液引入醛基，以在纸的光盘。清洗后，抗体抬上醛功能化的纸片。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 固定在通过高碘酸盐氧化（ 图1A）胺官能纤维素纸光盘抗体。
- 将1微升2.5毫米perioda钠德与2微升的0.1毫克/毫升的兔抗人IgG-FITC和7微升100mM pH5.5的在1.5ml管醋酸缓冲液中，并孵育在黑暗中的混合物30分钟。
注：按照此体积比，如果必要准备更氧化的抗体。改变的体积比，以优化高碘酸钠和兔抗人IgG-FITC的浓度。 - （; pH为7.4的PBS），以40微升的最终体积的50mM磷酸盐缓冲液30微升稀释上述抗体溶液中。
- 准备三胺官能介质流滤纸盘和三个胺官能快流纸盘（如在第1节中所述）。
- 负载5微升高碘酸钠氧化的兔抗人IgG-FITC的在每个介质流滤纸盘和8微升到每个快流滤纸光盘。保持这些纸片在黑暗中在室温下1小时。
- 用0.2ml洗涤迷洗各纸盘尔（50mM Tris缓冲液用0.15M NaCl和0.05％表面活性剂，pH值7.4）。重复洗涤三次。
- 通过荧光分子成像器拍摄的荧光图像，以确定每个纤维素纸圆盘32上的抗体的存在。使用空白纸张光盘（在没有高碘酸钠的相同浓度的抗体处理的）作为对照（ 图S1至图S3）。
注：对于实验优化，改变需要被优化，并固定其他参数的浓度一个参数的浓度。高荧光强度增加了被固定在纤维素纸圆盘捕捉抗体的量。
- 将1微升2.5毫米perioda钠德与2微升的0.1毫克/毫升的兔抗人IgG-FITC和7微升100mM pH5.5的在1.5ml管醋酸缓冲液中，并孵育在黑暗中的混合物30分钟。
- 通过戊二醛（ 图1B）固定在胺官能化纤维素纸光盘抗体。
- 添加三APS处理介质流滤纸盘和三个快速流滤纸盘（宫cribed在第1）至2ml含有0.05％戊二醛1小时，在室温下用轨道搅拌的50mM PBS（pH 7.4）中的。
注意：在通风柜拉手戊二醛。 - 将每个三个盘在2个1.5 ml离心管中。将1ml的去离子（DI）水添加至每个管并摇动试管10秒。通过用移液管抽吸除去水。重复两次以除去任何未反应的戊二醛。
- 负载5微升25微克/毫升的兔抗人IgG-FITC（捕获抗体）到每个醛官能介质流滤纸盘的，并加入8微升到每个醛官能快流滤纸光盘。孵育在黑暗中在室温下大约20分钟。然后，添加10微升的50mM PBS（pH 7.4）中，以各文件盘的不除去抗体并孵育40分钟，胺醛反应。
- 用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液洗纸光盘。重复洗两次。
- 通过荧光分子成像仪拍摄的荧光图像检查抗体的每个纤维素纸盘33的存在。使用空白纸片作为对照。
注意：在图4中 ，'0'表示该用在没有戊二醛FITC的抗体的相同的浓度处理的空白纸张的光盘;在图5A中 ，空白纸圆片用戊二醛处理过，但没有FITC的抗体加载到纸张光盘。
- 添加三APS处理介质流滤纸盘和三个快速流滤纸盘（宫cribed在第1）至2ml含有0.05％戊二醛1小时，在室温下用轨道搅拌的50mM PBS（pH 7.4）中的。
- 干燥在37℃的纸张盘（从2.1和2.2节）10分钟。
- 方框15微升封闭缓冲液的纸盘（10％脱脂奶粉在50mM Tris缓冲液，pH 7.4，用0.15M NaCl）中，在室温下10分钟。
- 负载5微升并在PBS 8微升过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG（1：10,000）到中流量和快速流滤纸光盘，分别孵育在室温下暗30分钟。
- 用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液洗纸光盘。重复洗涤三次。
注意：这是没有必要以除去洗涤缓冲液作为结果不会受到缓冲。 - 加载3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢溶液的10微升混合物到每个盘。
- 采取用数码相机或智能电话的纸张盘的图像孵育5分钟后。
注意：在图5B中 ，“0”表示该用戊二醛处理过的纸张的光盘，随后装载抗体-HRP（辣根过氧化物酶）偶联物在不存在的FITC抗体。
3.纸张为基础的ELISA IgG的检测
图2.纸张基于ELISA FO的示意图řIgG的检测。捕获抗体共价固定在通过戊二醛的醛官能纤维素纸光盘。纤维素纸圆片用封闭缓冲液。然后目标的IgG加入到该光盘，随后HRP-缀合的信号的抗体的加载。最后，TMB和过氧化氢混合溶液装入每个纸片的颜色显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 溶于5ml 0.05％戊二醛溶液（在50mM PBS缓冲液，pH 7.4制备）添加到20ml的玻璃瓶中。浸泡在该溶液中15胺官能介质流滤纸盘和保持1小时，在室温下摇动。
- 同时，重复步骤3.1准备另外15醛功能化的快速流动滤纸片上。
注意事项：在通风处理戊二醛引擎盖。
- 同时，重复步骤3.1准备另外15醛功能化的快速流动滤纸片上。
- 从纸片中除去未反应的戊二醛，放置在一个15毫升的离心管中的15个中流量滤纸光盘，和15快流滤纸盘在另一15ml离心管。 5毫升DI水添加到每个管并摇动试管10秒。通过用移液管抽吸除去水。重复两次以除去任何未反应的戊二醛。
- 干燥在37℃的烘箱纸张光盘。
- 加入5微升和8微升0.025毫克/毫升小鼠IgG-Fc片段的抗体的每个中流量和快速流滤纸光盘，分别的，并孵育20分钟。
- 添加10微升的50mM PBS（pH 7.4）中，以各文件盘的不除去抗体并孵育40分钟，胺醛反应。
- 用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液洗纸光盘。重复洗涤三次。
- 干燥烘箱中的纸片在37℃。
- 块纸片W¯¯第i个15微升，在室温下10分钟阻断缓冲液中。
- 洗每个纸片用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液中。重复洗涤三次。
- 运行的IgG标准。
- 负载10微升各种IgG的浓度（ 例如 ，0，10，125，250，和500在PBS纳克/毫升）上一式三份每个盘。孵育在室温下1小时。
- 用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液洗纸光盘。重复洗涤三次。
- 负载10微升HRP缀合的小鼠IgG-Fc片段抗体（1：10,000，10毫的PBS，pH 7.4）中，并孵育在室温下1小时。
- 用纸巾上的顶部0.2毫升洗涤缓冲液洗纸光盘。重复洗涤三次。
注意：这是没有必要以除去洗涤缓冲液作为结果不受缓冲剂的存在。 - 加载TMB的10微升混合物和过氧化氢在每个光盘上。
- ŧ所有纸的光盘AKE图片包含有5分钟温育后的数字照相机或智能电话。
注意：在图6A中 ，“0”表示用捕捉抗体的固定化处理过的纸的光盘，并且没有IgG的血清抗体-辣根过氧化物酶/ TMB溶液。 - 分析每个文件盘的强度按图J.图像中
- 转换步骤3.15'的.tif“格式拍摄的图像。
- 打开“图片J'的软件。
- 转到“文件→打开”，选择图像进行分析。
- 选择形状按钮，“椭圆形”。
- 进入“图像→类型→32位”。
- 进入“编辑→反相”。
- 转到“分析→测量”。
- 复制并在电子表格进行数据分析。
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Representative Results
图3. 傅立叶变换未处理和APS处理的介质流过滤器正方形纸（A）和快速流过滤器正方形纸（B）A的红外（FTIR）光谱 。对于未处理的介质流过滤器正方形纸谱是相似的APS处理介质流过滤器正方形纸。在902-1,170 -1和1,210-1,500厘米-1为APS处理方纸乐队中强度的增加分别属于SiOC类-H组的Si-O-纤维素和CH变形。频带的于1650 -1和2885厘米-1增量分别属于-NH 2和CH 2的振动从盐水丙基部分的弯曲，; B。在972 1180厘米特征峰-1范围归因于Si-O-Si键和SO策llulose债券。在1003厘米峰值-1由Si-O-Si键和CO拉伸纤维素的重叠造成的。所有这些结果表明，APS被成功移植到纤维素方纸。 请点击此处查看该图的放大版本。
纤维素上的正方形纸胺官能团的存在通过红外光谱测定。 图3示出了未经处理的，改性的，中流量和快速流过滤器正方形纸的FTIR光谱。有涉及氨基烷基的化学修饰的三个步骤，用纤维素表面上的APS。第一步涉及的APS的水解以提供APS的硅烷醇衍生物。步骤二所涉及的水解的APS衍生物的吸附到纤维素纤维通过从H OH基的氢键ydrolyzed APS衍生物和纤维素纤维。第三步涉及的吸附APS衍生物的缩合，这导致在APS衍生物的通过内Si-OC键接枝到纤维素纤维的表面和Si-O-Si键的硅氧烷桥34的形成。如在图3A中 ，带的于1650厘米增量所示-1在2885厘米-1对应于CH 2的振动硅烷丙基部分归因于NH 2的基团的弯曲和频带的增量。原介质流过滤器正方形纸，在902-1,170 -1和1,210-1,500厘米波段-1相当于糖苷桥梁和CH伸缩振动的COC键的振动。治疗与APS方形纸后，这两个频段宽度的增加强度表明，他们分别属于SiOC类-H组的Si-O-纤维素和CH变形。类似于介质-FL流过滤正方形纸，光谱改性快速流过滤器正方形纸于1650 -1的强度也增加了-NH 2，由于化学修饰与APS（ 图3B）。在972 1180厘米强特征峰-1范围归因于Si-O-Si键和SO-纤维素债券;最高峰为1003厘米-1由于在Si-O-Si键和CO拉伸纤维素34的重叠。的波长范围内的特征键1,188和厘米之间1510 -1为APS处理方纸用糖苷桥和CH伸缩振动的COC键的振动引起的。在CH 2的伸缩振动债券在2,800-2,980 -1，最高峰显示在2932厘米-1为APS治疗方纸。总之，APS可共价嫁接到1号和第113号过滤方形纸。
图4. 荧光反应，在IgG的FITC上的纸片（方法B）的固定不同浓度的戊二醛荧光分子成像器设置 ：激发，488纳米，发射530nm的，分辨率，100微米答 ：荧光响应于0，0.001％，0.005％，0.01％和0.050％戊二醛B：荧光响应为0，0.050％，0.100％，0.250％和0.500％戊二醛。的IgG-FITC的每个盘上的浓度为0.01毫克/毫升。在戊二醛浓度到最大为0.05％的增加导致的IgG-FITC的增加的负载量。戊二醛0.05％以上浓度的IgG-FITC的负载量减少。 请点击此处查看这个大版本数字。
。在IgG的FITC标记的固定化介质流和快速流滤纸盘（方法B）为荧光分子成像器设置不同浓度的IgG-FITC的 图5 的荧光响应（A）和比色结果（B）激发，488纳米，发射530nm的，分辨率100微米。 ＃1表示级1号，中流动滤纸片，和＃113代表级113号快流滤纸片。 APS改性的纸圆片用0.05％戊二醛第一处理。然后，将不同浓度的IgG-FITC被装载到戊二醛修饰的纸的光盘。增加的IgG-FITC的加载浓度的增加在纸张上的光盘固定的IgG-FITC的量。然而，增加的固定化的IgG-FITC的浓度没有提高结合能力的抗原。 请点击此处查看该图的放大版本。
对胺官能纤维素纸光盘抗体的共价固定的基本工作流程示于图1。兔抗人IgG-FITC共价固定在纤维素纸的光盘。从纸的光盘的荧光指示抗体与纸张盘的固定化，以及荧光强度呈正比，固定化抗体的浓度。过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG然后用于确定固定化抗体的结合能力。仲胺基团和醛基团可以彼此反应以形成席夫碱，这已在生物缀35被使用。他们在这里也用于捕获的共价固定抗体。在方法的（ 图1A）， - NH 2被引入到纤维素纸光盘和-CHO通过用高碘酸钠氧化的抗体的Fc区从兔抗人IgG-FITC而得。以同样的方式，也进行了分析各种浓度高碘酸钠和IgG-FITC抗体的效果。 如图S1和图S2中 ，从0浓度为1mM和兔抗-人IgG-FITC从0.016高碘酸钠0.16毫克/毫升对0.08毫克/毫升的兔抗人IgG的氧化影响不大-FITC。该共价结合于纸光盘的抗体的量与从0到0.075毫克/毫升（ 图S3A）捕捉抗体的递增浓度的增加。
当结合能力是由过氧化酶法测定观察到淡淡的颜色变化。这可能是由于使用的过量高碘酸钠，其与捕捉抗体发生反应并导致结合活性的丧失。它是可能的高碘酸钠不能完全洗涤从纸光盘程。这是通过简单的原则，即高碘酸钠溶液提供了一种黄色当与purpald溶液混合确认。因此，高碘氧化抗体装载到纸光盘和孵育1小时。纸圆片用PBS（含0.05％吐温20）洗涤三次，然后purpald溶液加入到这些光盘。纸张盘呈紫色，立即指示醛基从高碘氧化的抗体的存在。此紫色在10分钟内变成黄色，这证实高碘酸钠在纸张上的光盘的存在。
或者，戊二醛交联法（方法B， 图1B）中的用于链接的胺GROUPS从APS处理过的纸的光盘和抗体。戊二醛被装上了纤维素纸的光盘的浓度（ 图4）和兔抗-人IgG-FITC（ 图5A）进行了优化。正如图4所示，荧光强度最大的戊二醛为0.05％，这意味着，兔抗人IgG-FITC的装载成为在该浓度的纤维素纸盘上饱和达成;增加戊二醛至2.5％的浓度并没有显示在纤维素纸盘（ 图S4）的增加的兔抗人IgG-FITC的量。荧光强度还与装载到纸光盘（ 图5A），该兔抗人IgG-FITC的浓度的增加而增加。蓝色色在加入的TMB底物和过氧化氢的混合溶液到纸张光盘，其中载有peroxidas的立即开发E的共轭检测抗体（ 图5B）。此外，封闭缓冲液，其中含10％的脱脂奶粉被证明保留后15次洗涤（ 图S5）阻挡效率。方法B被选来测试固定化抗体的应用，因为它显示出增强的结合活性到其目标。因此，被用于IgG的检测捕获抗体的0.025毫克/毫升的浓度。
图 6. IgG抗体由纸质的ELISA。＃1的测定的校准曲线表示级1号，中流量滤纸盘，和＃113表示级号113快流滤纸光盘。上部小图A给出了介质流（＃1）和快流（＃113）纤维素纸的光盘具有不同浓度的IgG的颜色读数。底部面板B给出了不同浓度的IgG的ELISA结果。一式三份用于确定标准偏差（SD）。 请点击此处查看该图的放大版本。
缀合HRP的山羊抗小鼠IgG-Fc片段捕获抗体，IgG的血清，和山羊抗小鼠IgG-Fc片段抗体被用于夹心测定。如在图6和图S6中 ，IgG的血清的从0到500纳克/毫升的浓度示出了与比色强度呈线性关系，当每一个步骤被温育1小时。在图S6中 ，用不同浓度的IgG的颜色变化是显而易见的1小时温育。然而，10分钟温育的结果没有显示在用不同浓度的IgG的颜色强度的明显变化。因此，SENS本纸基的ELISA itivity是适合开发点 - - 关心实际测试。
图S1。荧光响应不同浓度高碘酸钠（方法A）的。高碘酸钠变浓度分别固定在0.016毫克/毫升，并用于抗体氧化活性的研究的浓度与兔抗人IgG-FITC混合。通过增加高碘酸钠的浓度，IgG的FITC的装载量增加，在0.25毫达到最大值。据观察，高碘酸钠的浓度的比这个较高没有增加固定化的IgG-FITC的量。一式三份用于确定标准偏差（SD）。 请点击此处下载此文件。
图S2。荧光反应s至不同浓度的兔抗人IgG-FITC（方法A）的。高碘酸钠的浓度为0.25毫在用于抗体氧化活性研究的溶液中，兔抗-人IgG-FITC的每个盘上的最终浓度为0.016毫克/毫升。当高碘酸钠的浓度固定的IgG-FITC的浓度对的IgG-FITC的氧化影响不大。一式三份用于确定标准偏差（SD）。 请点击此处下载此文件。
图S3。荧光响应，并从不同浓度的氧化兔抗人IgG-FITC的装载到纸盘（方法A）比色结果。对于高碘酸钠氧化，0.08毫克/毫升的IgG-FITC和0.25mM的高碘酸钠进行使用。过氧化物酶缀合的抗兔IgG的稀释度为1：50000。越来越多的IgG-FITC的装载浓度对纤维素纸片增加固定的IgG-FITC量，但并没有对靶标结合的效果。 请点击此处下载此文件。
图S4。荧光响应于高浓度的IgG-FITC对纤维素纸盘（方法B）的固定化戊二醛。的IgG-FITC的每个盘上的浓度为0.01毫克/毫升。戊二醛这均高于0.25％的人没有固定增加的IgG-FITC对纤维素纸盘量的浓度。 请点击此处下载此文件。
图S5。影响洗涤次数的。答 ：是。兴三次乙 ：洗涤15次。固定在纤维素纸广场捕获抗体仍具有良好的结合能力，他们的目标，即使方纸涡旋15倍。 请点击此处下载此文件。
图S6。纸基的ELISA结果IgG的。对于IgG抗体的从0到500纳克/毫升的浓度，从孵化一小时的结果是比从10分钟孵育的结果更好。对于高浓度的IgG，10分钟足够的时间进行孵化。一式三份用于确定标准偏差（SD）。 请点击此处下载此文件。
图S7。扫描电子显微镜（SEM），在不同的放大倍数中流量滤纸的图像。答：85X和B：20000倍。在5千伏操作的场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）被用来确定所述的颗粒形态。纤维素纤维是随机交联。 请点击此处下载此文件。
图S8。在不同的放大倍数快流滤纸的SEM图像。答 ：100X和B：20000倍。在5千伏操作的场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）被用来确定所述的颗粒形态。纤维素纤维是随机交联。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
进行亲和纯化的山羊抗小鼠IgG-Fc的捕获上未修饰的纤维素纸光盘抗体的直接涂覆，以检测的IgG的浓度。结果表明，在捕捉抗体的进一步固定需要重复性。硅烷技术被成功地用于引入胺官能团的纤维素纸的光盘34。 APS的浓度会影响抗体的固定。因此，APS的丙酮的量也进行了优化。在10ml丙酮1毫升的APS是用于通过戊二醛交联剂接枝抗体的固定化的胺基团的最佳浓度。抗体嫁接用高碘酸氧化和戊二醛的交联方法中的纤维素纸的光盘。我们的研究结果表明，固定化抗体通过戊二醛交联法的结合能力比为MED的高碘酸盐氧化法更好鎓流和快速流滤纸光盘。此外，捕获抗体，其是通过戊二醛交联法固定在纤维素纸上的光盘，保留它们的功能，虽然纸张是通过涡旋进行的15次洗涤的机械应力被稳定地甚至固定。脱脂奶粉封闭缓冲液的百分之十被发现后15次洗涤（ 图S5），以保持其阻挡效率。
共价固定的抗体被用来与检测的IgG进行夹心ELISA。的IgG以100纳克/毫升的浓度使用这种纸圆盘基于测定肉眼进行检测。从0到500纳克/毫升的IgG血清的浓度与比色强度，当每一步孵育一小时的线性关系。对于基于ELISA本文圆盘免疫测定测试所需更少样品的试剂和似乎比常规免疫测定36更有效图S7和图S8中 ，。如这些图所示，该纤维是随机地交联对两种滤纸盘25的。这样做的原因高灵敏度可能是纸盘的厚度。对于快速流滤纸盘的厚度为420微米的相比较180微米为中流量滤纸。因此，更多的捕获抗体是可能被固定在快流滤纸盘，这将进一步增加检测的灵敏度。同时，用于所述快速流动滤纸盘（30微米）的孔径比的介质流滤纸盘较大（11＆＃181;米）。纸张表面封闭后，前者的孔径仍然大到足以驱动液体流动无额外的电源系统。然而，流量为在后者的缓冲区的速率较慢。因此，快流滤纸比在免疫测定中的应用中流量滤纸更好。
上固定化滤纸盘的抗体的再现性通过用比色结果的过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG和检测纸张盘的进一步孵育装载TMB底物和过氧化氢的混合溶液后进行评价。标准偏差小于10％，对于本纸基装置。兔抗人IgG-FITC对-NH 2改性纤维素纸光盘的稳定性达两个月的测试。该储存在4℃下的纸张盘保持其结合活性与过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG在其双向略有下降nding活动。然而，当抗体固定纸圆片在室温下储存或60℃，他们失去了结合活性，由于干燥和高温。所捕获的抗体可能变得不稳定并在这些条件下的变性。
有在捕捉抗体的使用戊二醛作为交联剂纤维素纸光盘上的固定化的一些关键步骤。步骤1.2接枝在纸张盘胺基是在捕捉抗体的成功的共价固定的关键步骤。如果这一步失败，则整个固定过程将失败。 FTIR用于测定胺基是否成功地固定在纸盘（步骤1.6）。第二，醛基纤维素上的纸片接枝是另一个关键步骤（步骤2.2.1和步骤3.1）。抗体共价通过席夫碱的形成固定在纤维素纸的光盘。最后，以固定在滤纸盘捕捉抗体的步骤是很重要的（步骤2.2.3，步骤3.4和步骤3.5）。从捕捉抗体胺基与纤维素纸光盘上的醛基反应以固定在纸光盘上的抗体。如果这一步不成功，捕获抗体不会固定在纸张上光盘和所有的ELISA应用测试将是负面的。我们可以用一个荧光分子成像仪，以确定捕获的抗体的存在。过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG和基于过氧化物酶的比色反应可以被用来确认在固定化抗体的结合能力。
该协议可能会遇到一些问题，如高背景信号，无信号或弱信号，和一个彩色读取不均匀。这些问题和故障排除的方法克服了这些问题的可能原因在下面讨论。高背景信号通常发生杜E要短阻塞时间。这可以通过增加阻塞温育时间，彻底洗涤该纸光盘，和避免加入过量的检测抗体缀合物的酶的除去高背景信号来解决。可能的原因包括没有靶抗原，经阻断，孵育时间不足，以及非功能性的检测抗体酶缀合物。为了克服这些问题，靶抗原必须添加和温育，使用一个新的抗体缀合物和其存储由制造商所建议的一个合适的时间段。最好是包括用于检测的阳性对照。色彩不均匀性读数是由于纸光盘在移植过程中的堆叠。为了避免这个问题，在纸张盘必须在APS接枝过程中分离，并且抗原和检测抗体缀合物的酶必须均匀地在各步骤中的纸张盘上的传播。
尽管纸基测定法是一种简单的和成本有效的方法，有局限性。在基板表面上的抗体的取向是对免疫测定的性能的关键，因为戊二醛交联剂与来自Fab区和捕捉抗体的Fc区域中的胺基团反应。因此，在高取向性的方式，不会发生与固定的抗体。由于有更多的胺基从Fab区比从IgG抗体的Fc区，所述固定化抗体的结合活性仍然是为他们的应用足够高。
纤维素纸不同的表面功能化的方法进行了总结在最近的一份报告37。试剂如二乙烯基砜; 1,4- phenylenediisothiocyanate; 4-叠氮基重氮苯;环氧氯丙烷; 4-叠氮基一氟-2-硝基环己烷;和4-巯基 - 苯重氮，可用于共价固定在纤维素纸的生物分子。吸附及包封也利用涂覆有生物分子的纤维素纸。相比于其它方法中，硅烷技术和对纤维素纸的抗体的共价固定的戊二醛交联剂的组合是一个简单的方法。此外，这种组合可以对纤维素纸的热和机械性能的影响不大，使得在免疫测定的最大垂直流过。这种策略可以扩展到固定在纤维素纸其它生物分子。
这里展示的方法可能被只要针对它直接抗体可延伸到检测的任何分析物的，。这种方法也可用于开发多重检测。例如，在方形纸，不同的区域可以区分关于各种目标。为目标的捕获抗体可以通过对它们的具体区域中的戊二醛交联剂来固定。这可以随后ELIS一个过程来检测各种目标。因此，该方法使得检测用肉眼其他目标的纸质ELISA的多功能工具。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
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