Abstract
このレポートでは、セルロース濾紙グレード1号（メディアフローろ紙）ディスクやグレード番号113（高速フローろ紙）ディスク上の捕捉抗体の共有結合固定化するための2つの方法を提示します。抗体は、それらの上に固定される前に、これらのセルロース紙ディスクは、シランカップリング技術によりアミン官能基がグラフトしました。過ヨウ素酸酸化およびグルタルアルデヒド架橋方法は、セルロース紙ディスク上に捕捉抗体を移植するために使用しました。固定化後のその標的への捕捉抗体の最大結合能力を確保するために、過ヨウ素酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、及び紙ディスクの表面上の捕捉抗体の様々な濃度の影響を調べました。過ヨウ素酸酸化法と比較した場合、グルタルアルデヒド架橋剤を介してアミン官能化セルロースペーパーディスク上にコーティングされた抗体は、標的への増強された結合活性を示しました。。 （マウス参照血清中の）IgGは、グルタルアルデヒドを介して共有結合的に固定化された抗体のアプリケーションをテストするために、本研究で基準ターゲットとして使用しました。新たな紙ベースの、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）の開発に成功し、IgGの検出のために検証されました。この方法では、機器を必要とせず、それは、IgGの100ng / mlのを検出することができます。高速フローフィルタ紙媒体流ろ紙より感受性でした。このアッセイのインキュベーション期間は短く、少量の試料を必要としました。この裸眼、比色イムノアッセイは、従来のELISAを用いて同定される他の標的を検出するために拡張することができます。
Introduction
ポイント・オブ・ケア検査（POCT）診断の研究では、治療のための新しい戦略の開発、個別化医療、ホームケアの1のために重要です。彼らは、安価なアクセス、およびユーザ2によく知られているとして、セルロース紙は広く、イムノアッセイでのプラットフォームとして使用されています。また、セルロース紙の多孔質構造は、付加的なエネルギーの影響を与えることなく、液体の流れを駆動するための電力を有しています。ペーパークロマトグラフィーは、最初1952年に発明されたときに紙ベースのバイオ分析のレコードは早ければ20 世紀に発見することができ、最も一般的な例は、妊娠と糖尿病テストストリップとしてイムノクロマトグラフィー検査3、です。これらのテストは、比較的高速な分析時間と安価な分析4を提供します 。それらの単純さのために、これらの従来の紙ストリップテストは、広くPOCT診断5で使用されてきました。
測色6を含む検出方法、電気化学7、及び電気化学発光8の方法は、生体試料中の標的を測定することが報告されています。これらの定量的な方法に加えて、セルロース紙に抗体を固定化するための信頼できる方法はまた、診断用デバイスの開発のために重要です。非特異的吸着は、固定化後のその標的への最大結合容量を確保するために、紙ベースのデバイス9,10の表面上に抗体を修飾するための主な戦略です。しかし、以前の研究 セルロース紙に吸着された抗体は、40％の繊維11から脱着することができることを示しました。したがって、セルロースへの抗体の直接吸着は、再現性のある結果12を提供することはできません。紙の表面上にグラフトされた抗体の共有結合固定化は、効果的な紙ベースのバイオアッセイ13を開発する代替的な方法です。種々の方法は、セルロース14,15の変形のために報告されています12後に元の機能を維持する必要があります。カルボニルは、1-シアノ-4-ジメチルアミノテトラフルオロボレート16と組み合わせます。 1-フルオロ-2-ニトロ-4- azidobenzene UVベースの活性化戦略17、18を介し。キシログルカン修正19に基づく化学酵素戦略。 1,4-フェニレンジイソチオシアネートの連結剤20;ヘテロ酸化21クリックケミストリー22;そしてカチオン性ポルフィリン23は、共有セルロース紙に生体分子を固定化するために使用されています。キトサン修飾紙は、それが豊富で27生体適合性であるため、紙ベースimmunodevices 24-26を開発するために使用されてきました。キトサンは、カチオンであり、アニオン性セルロース27に強力に接着します。捕捉抗体は、キトサンコーティングおよびグルタルアルデヒド架橋を介して紙の上に固定されています。過ヨウ素酸酸化はCAPTをグラフトするための別の方法でありますセルロース紙28上のURE抗体。この方法では、過ヨウ素酸ナトリウムは、アルデヒド基に直接セルロース1,2-ジヒドロキシ（エチレングリコール）基に変換するために紙の上にスポットします。アルデヒド基は、次いで、多糖類および抗体28の間に共有結合を形成するために使用されます。製造が簡単であるが、完全に過ヨウ素酸ナトリウムを洗い流すことが困難です。未洗浄の過ヨウ素酸ナトリウムは、抗体の活性および安定性に影響を与える、セルロース紙に固定化された抗体のさらなる酸化を引き起こすことができるNが - （3-ジメチルアミノプロピル） - Nエチルカルボジイミド塩酸塩およびN-ヒドロキシスクシンイミド架橋剤をも使用されています共有ナノファイバーベースのアッセイ29の開発のための電界紡糸ポリL-乳酸および酢酸セルロースナノファイバー上に抗体を固定化します。
この研究では、シランカップリング技術はcellulos上のアミン官能基をグラフトするために使用されました電子ペーパーディスク。この技術は、イムノアッセイにおいて最大垂直フロースルーを可能にする、元の孔径、ウィッキング、及びセルロース濾紙の濾過速度を維持するのに役立ちます。シランカップリング技術は、広く生体分子を用いてさらに修飾に続いて第二級アミン基を有する基板表面を官能化するためにバイオセンサーに使用されています。マトリックス表面上のアミン基のグラフトは、有機官能性シラン剤とマトリクス基板30の-OH基との縮合反応を含みます。セルロース紙ディスクは3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APS）31を介して、シランカップリングによってアミノ基で官能化しました。これは、2つの異なる方法を使用して共有結合固定化捕捉抗体が続きました。第一の方法は、アミン官能化セルロースペーパーディスクに素酸酸化捕捉抗体の結合を含んでいました。第二の方法は、キャプチャを添付し、架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用antibodiアミン基官能化セルロースペーパーディスクにエス。捕捉抗体の存在は、蛍光分子イメージャーを用いて、ウサギ抗ヒトIgGのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で確認しました。抗ウサギIgGヤギに対するウサギ抗ヒトIgG-FITCの結合活性は、ペルオキシダーゼ基質により評価しました。過ヨウ素酸ナトリウム、グルタルアルデヒド、および捕捉抗体の様々な濃度の影響を調べました。固定化捕捉抗体の適用試験は正常IgG血清の検出により行いました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
セルロース紙ディスク上の1グラフトのアミン官能基
- 1cm角、およびパンチを用いて、6.0ミリメートル（中流量ろ紙）の直径を有するグレード第1セルロース紙から作られた100ペーパーディスクの大きさの正方形の紙1枚を準備します。
- ペーパーディスク上に-NH 2基を導出するために、ドラフト内で50mlのガラスボトル内の1mLのAPS、10mlのアセトンを混合します。新たに調製したAPS試薬混合物にペーパーディスクを追加し、室温32での軌道攪拌（200rpm）しながら5時間インキュベートします。
注意：ドラフト内でAPSおよびアセトンを処理します。 - 有機性廃棄物容器に50ミリリットルのガラス瓶から余分な溶液をデカント。
- 、ガラスボトルにアセトン10mlを加え、よく混ぜ、任意の未反応のAPSおよび他の不純物を除去するために、完全にデカント。このステップを2回繰り返します。
- 3時間110℃のオーブンでペーパータオルや場所にペーパーディスクを広げます。許可しますペーパーディスクを冷却します。室温で50 ml遠心チューブ内のディスクを保管してください。
- 下記（ 図3A）に記載のように、セルロース正方形の紙の上にアミン基のグラフト化を確認するために、赤外分光法（FTIR）をフーリエ変換を使用してください。
- コンピュータの電源をオンにし、FTIR分光装置を開きます。
- FTIR分光法のためのソフトウェアを開きます。
- 「測定→初期化」に移動します。 「BS：KBr法 'の長方形は、：初期化が終了したときに「ランプ赤外線」と「レーザー」は緑色に変わります。
- 長方形の下に「データ」を選択し、「％の透過率」、「ハップ-Genzelアポ '、' 45 '、' 4.0 '、および'ミン：400、最大：4000」を選択し「測定モード」のために、 "アポダイゼーション '、'いいえ。 「スキャン」、「解像度」、および「レンジ（CM-1）の。
- 「測定」をクリックしてください。
- 背景データのための「データファイル」を選択します。書きますコメントダウン。
- 背景のベースラインを取得するには「BKG]をクリックします。
- フィルム試料ホルダー上の正方形の紙を修正しました。
- サンプルデータのための「データファイル」を選択します。コメントを書き留めます。
- サンプルのためのスペクトルを得るために「サンプル」をクリックしてください。
- FTIR分光法のアプリケーションを閉じて、コンピュータの電源をオフにします。
- 上記の手順を（1.6から1.1ステップ）アミン官能グレード号113セルロース正方形の紙及びディスク（高速フローろ紙）を調製するために繰り返し、グレード番号113平方紙（ 図3B）のためのFTIRスペクトルを得ます。
アミン官能化セルロースペーパーディスク上の抗体の2.共有固定化
2つの異なる方法によって抗体の1.共有結合固定化を図。過ヨウ素酸酸化を介してアミン官能化セルロース紙ディスク上に固定化することができる。抗体。炭水化物残基は、アルデヒド官能基を生成する過ヨウ素酸ナトリウムで酸化しました。次に、酸化された抗体は、アミン官能化セルロースペーパーディスクにロードした。B。抗体は、その後、グルタルアルデヒドを介してアミン官能化セルロースペーパーディスク上に固定化しました。アミン官能化セルロースペーパーディスクは、紙ディスクにアルデヒド基を導入するために0.05％グルタルアルデヒド溶液に浸漬しました。洗浄後、抗体は、アルデヒド官能ペーパーディスクにロードした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 過ヨウ素酸酸化（ 図1A）を介してアミン官能化セルロース紙ディスク上に抗体を固定化します。
- 2.5 mMのナトリウムperioda1μlのミックス0.1mg / mlのウサギ抗ヒトIgG-FITCおよび1.5ミリリットルチューブ中の100mM pH5.5の酢酸緩衝液の7μlに2μlのTE、そして暗所で30分間混合物をインキュベートします。
注：必要に応じて、複数の酸化抗体を調製するために、この体積比に従ってください。過ヨウ素酸ナトリウムとウサギ抗ヒトIgG-FITCの濃度を最適化するために、容積比を変えます。 - 40μlの最終容量まで、50 mMリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4のPBS）を30μlの上記抗体溶液を希釈します。
- 三アミン官能媒体流濾紙ディスク及び（セクション1で説明したように）は、3つのアミン官能ファストフローペーパーディスクを準備します。
- 各メディアフローフィルターペーパーディスク、各ファストフロー濾紙ディスクに8μlの上に過ヨウ素酸ナトリウム酸化ウサギ抗ヒトIgG-FITCの負荷を5μl。室温で1時間暗所でこれらのペーパーディスクを保管してください。
- 洗濯バフの0.2ミリリットルでペーパーディスクのそれぞれを洗いますER（50mMのトリス、0.15MのNaCl及び0.05％の界面活性剤、pH7.4で緩衝液）。洗浄を3回繰り返します。
- 各セルロースペーパーディスク32上の抗体の存在を同定するために蛍光分子イメージャーを介して蛍光画像を撮影します。 （S3図には、 図S1）を対照として（過ヨウ素酸ナトリウムの不存在下での抗体の同じ濃度で処理された）白紙のディスクを使用してください。
注：実験的最適化のために、最適化され、他のすべてのパラメータの濃度を修正する必要がある一つのパラメータの濃度を変更します。高い蛍光強度は、セルロースペーパーディスク上に固定化された捕捉抗体の量を増加させます。
- 2.5 mMのナトリウムperioda1μlのミックス0.1mg / mlのウサギ抗ヒトIgG-FITCおよび1.5ミリリットルチューブ中の100mM pH5.5の酢酸緩衝液の7μlに2μlのTE、そして暗所で30分間混合物をインキュベートします。
- グルタルアルデヒド（ 図1B）を介して、アミン官能基化セルロース紙ディスク上に抗体を固定化します。
- 3つのAP処置した媒体流濾紙ディスク三ファストフロー濾紙ディスクを追加する（DES室温でオービタル攪拌しながら、1時間、0.05％グルタルアルデヒドが含まれている50mMのPBS（pH7.4）中の2ミリリットルのセクション1）でcribed。
注意：ドラフト内でグルタルアルデヒドを処理します。 - 2 1.5ミリリットルの遠心分離管に3枚のディスクをそれぞれ配置します。各チューブに、脱イオン（DI）水1mlを加え、10秒間チューブを振ります。ピペットで吸引することにより、水を除去します。未反応のグルタルアルデヒドを除去するために、さらに2回繰り返します。
- 負荷5の各アルデヒド官能メディアフローフィルターペーパーディスク上に25 / mlのウサギ抗ヒトIgG-FITC（捕捉抗体）のμlを、各アルデヒド官能高速フロー濾紙ディスクに8μlを添加します。室温で約20分間、暗所でインキュベートします。次に、抗体を除去することなく、各ペーパーディスクに50mMのPBS（pH7.4）中の10μlを添加し、アミンアルデヒド反応のために40分間インキュベートします。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルでペーパーディスクを洗ってください。繰り返し2回洗浄します。
- 各セルロースペーパーディスク33上の抗体の存在を確認するために蛍光分子イメージャーを介して蛍光画像を撮影。コントロールとして白紙のディスクを使用してください。
注： 図4で、 '0'は、グルタルアルデヒドの非存在下でFITC抗体と同じ濃度で処理した白紙のディスクを表し、 図5Aに、白紙ディスクはグルタルアルデヒドで処理した、しかしFITC抗体は、ペーパーディスク上にロードされませんでした。
- 3つのAP処置した媒体流濾紙ディスク三ファストフロー濾紙ディスクを追加する（DES室温でオービタル攪拌しながら、1時間、0.05％グルタルアルデヒドが含まれている50mMのPBS（pH7.4）中の2ミリリットルのセクション1）でcribed。
- 37℃で10分間（セクション2.1および2.2からの）紙ディスクを乾燥させます。
- ブロッキング緩衝液15μlのペーパーディスクをブロック室温で10分間（10％0.15 M NaClで、50mMのトリス緩衝液、pH7.4中脱脂粉乳）。
- 負荷5μLおよびPBS（1：10,000）でペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG8μlの媒体流をそれぞれ高速流濾紙ディスク上へ。インキュベート室温で暗所で30分。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルでペーパーディスクを洗ってください。洗浄を3回繰り返します。
注：これは、結果がバッファに影響されないように洗浄緩衝液を除去する必要はありません。 - 各ディスクに3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）及び過酸化水素溶液の10μlの混合物をロードします。
- インキュベーションの5分後に、デジタルカメラやスマートフォンでペーパーディスクの画像を撮影します。
注： 図5Bには、 '0' FITC抗体の非存在下で抗体HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートをロードし、その後グルタルアルデヒドで処理したペーパーディスクを表します。
IgGの検出のための3紙ベースELISA
紙ベースのELISA FOの図2.略図R IgGを検出。キャプチャ抗体は、共有結合、グルタルアルデヒドを介して、アルデヒド官能化セルロースペーパーディスク上に固定化しました。セルロース紙ディスクを、ブロッキング緩衝液でブロックしました。ターゲットIgGは、次にHRPコンジュゲート信号の抗体のローディングに続いて、ディスクに添加しました。最後に、TMB及び過酸化水素の混合溶液は、カラー読み出しのため、各ペーパーディスクにロードした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 20mLのガラス瓶に（50mMのPBS緩衝液、pH7.4に調製した）0.05％グルタルアルデヒド溶液5mlを加えます。この溶液中の15アミン官能メディアフローフィルターペーパーディスクを浸し、室温で振とうしながら1時間保ちます。
- 同時に、繰り返しステップ3.1は、他の15のアルデヒド官能ファストフロー濾紙ディスクを作製しました。
注意：ヒューム中のグルタルアルデヒドをハンドルフード。
- 同時に、繰り返しステップ3.1は、他の15のアルデヒド官能ファストフロー濾紙ディスクを作製しました。
- ペーパーディスクから未反応のグルタルアルデヒドを除去するために、別の15mL遠心管に15mlの遠心管中15中のフロー濾紙ディスク、及び15ファストフロー濾紙ディスクを置きます。各チューブに脱イオン水5mlを加え、10秒間チューブを振ります。ピペットで吸引することにより、水を除去します。未反応のグルタルアルデヒドを除去するために、2回繰り返します。
- 37℃のオーブンペーパーディスクを乾燥させます。
- それぞれ、メディアフローと速い流れのろ紙ディスクのそれぞれに5μlの0.025 mg / mlでマウスIgG-Fc断片抗体の8μlを添加し、20分間インキュベートします。
- 抗体を除去することなく、各ペーパーディスクに50mMのPBS（pH7.4）中の10μlを添加して、アミンアルデヒド反応のために40分間インキュベートします。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルでペーパーディスクを洗ってください。洗浄を3回繰り返します。
- 37℃のオーブンペーパーディスクを乾燥させます。
- ワットペーパーディスクをブロック室温で10分間ブロッキング緩衝液15μlのi番目。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルで、各ペーパーディスクを洗ってください。洗浄を3回繰り返します。
- IgGの標準を実行します。
- 負荷様々なIgGの濃度の10μlの（ 例えば 、0、10、125、250、および500 ngの/ PBS中ミリリットル）三連の各ディスク上に。室温で1時間インキュベートします。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルでペーパーディスクを洗ってください。洗浄を3回繰り返します。
- 負荷HRP結合マウスIgG-Fc断片抗体を10μl（1：10,000 10mMのPBS、pH7.4）中、室温で1時間インキュベートします。
- ペーパータオルの上に洗浄用緩衝液の0.2ミリリットルでペーパーディスクを洗ってください。洗浄を3回繰り返します。
注記：結果は、緩衝液の存在によって影響されないように洗浄緩衝液を除去する必要はありません。 - 各ディスクにTMB10μlの混合物と過酸化水素をロードします。
- Tインキュベーションの5分後にデジタルカメラやスマートフォンを持つすべてのペーパーディスクのイメージAKE。
注： 図6Aでは、 '0'捕捉抗体固定化で処理されたペーパーディスク、およびIgGの血清を含まない抗体HRP / TMB溶液を意味します。 - イメージJ.ことにより、画像内の各ペーパーディスクの強度を分析
- ステップ3.15で撮影した画像は、「tifファイル」形式に変換します。
- 「イメージJ」ソフトウェアを開きます。
- 「ファイル→開く」に移動し、分析するための画像を選択します。
- 形状ボタン「オーバル」を選択します。
- 「イメージ→タイプ→32ビット」に移動します。
- 「編集→反転」に移動します。
- 「分析→メジャー」に移動します。
- コピーし、スプレッドシート内のデータを分析します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図3. フーリエ変換は、未処理およびAPS処理されたメディアフローフィルター平方紙（A）と高速フローフィルター平方紙（B）。Aの赤外（FTIR）スペクトルを変換します。未処理のメディアフローフィルタの正方形の紙のためのスペクトルは、APS処理されたメディアフローフィルターの正方形の紙のものと同様でした。 APS処理された正方形の紙用902-1,170 -1と1,210-1,500 cm -1でのバンドでの強度の増加は、それぞれのSiOC-H基のは、Si-O-セルロースおよびCH変形に属していました。 1650センチメートル-1および2885センチメートル-1のバンドの増加は、それぞれ、生理食塩水プロピル部分からの-NH 2およびCH 2振動の屈曲に属している。B。 972 1180センチメートル-1の範囲の特徴的なピークは、は、Si-O-SiおよびSO-CEに起因しました。llulose債券。 1003センチメートル-1のピークはSi-O-Si結合とセルロースのCO伸縮の重なりによって引き起こされました。すべての結果は、APSが正常にセルロース正方形の紙の上にグラフトされたことを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セルロース正方形紙上のアミン官能基の存在は、FTIRにより測定した。 図3は、未処理、修飾、メディアフロー及びファストフローフィルタ正方形紙のFTIRスペクトルを示す図 。セルロース表面にAPSを用いたアミノ基の化学修飾に関与する3つのステップがありました。第一段階は、APSのシラノール誘導体を提供するAPSの加水分解に関与します。第二段階は、hからのOH基の水素結合を介してセルロース繊維に加水分解されたAPS誘導体の吸着を含んydrolyzed APS誘導体とセルロース繊維。ステップ3つのSi-O-C結合を介してセルロース繊維の表面にAPS誘導体のグラフトとは、Si-O-Siシロキサンブリッジ34の形成につながった吸着APS誘導体の縮合を、関係します。 図3Aに示すように1,650 -1でのバンドの増加-1 NH 2基および2,885 cm -1でのシランプロピル部分のCH 2振動に対応するのバンドの増加の曲げに起因しました。元のメディア・フローフィルタの正方形の紙の場合、902-1,170センチ-1と1,210-1,500 cm -1でのバンドは伸縮振動グリコシド橋やCHのCOC結合の振動に対応していました。 APSの正方形の紙を処理した後、これらの二つの帯域幅での強度の増加は、それらがそれぞれのSiOC-H基のSi-O-セルロース及びCH変形に属することを示しています。メディア-FLと同様にOW正方形の紙、またによるAPS（ 図3B）との化学修飾に、-NH 2 1650 cm -1でで強度が増加した修正された高速フローフィルタの正方形の紙についてのスペクトルをフィルタリングします。 972 1180センチメートルに強い特性ピーク-1の範囲は、は、Si-O-SiおよびSO-セルロース結合に起因するものでした。最高峰は1003センチメートル-1によるSi-O-Si結合およびセルロース34の延伸COの重なりにでした。正方形の紙を処理したCM 1188の間と1510 -1 APS用の波長範囲内の特性結合はグリコシド橋やCH伸縮振動のCOC結合の振動によって引き起こされます。 CH 2伸縮振動の結合は、APSが正方形の紙を処理した2932センチメートルで-1のため2,800-2,980 cm -1で最も高いピークで示されました。結論として、APSは、共有1番および113フィルタ正方形の紙にグラフトすることができます。
ペーパーディスク（方法B）上のIgG-FITCの固定化におけるグルタルアルデヒドの異なる濃度に 図4. 蛍光応答蛍光分子イメージャーの設定：励起、488nmの発光、530nmで、解像度、100マイクロメートルA：蛍光0に対応し、0.001％、0.005％、0.01％0.050％のグルタルアルデヒドB：0に蛍光応答、0.050パーセント、0.100パーセント、0.250パーセント0.500％のグルタルアルデヒド。各ディスク上のIgG-FITCの濃度は0.01 mg / mlでした。 0.05％を上限とするグルタルアルデヒドの濃度の増加は、IgG-FITCの増加担持量が得られました。 0.05％以上のグルタルアルデヒドの濃度は、IgG-FITCの積載量を減少させた。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。
図5. 蛍光応答（A）と、測色結果のIgG-FITC固定化媒体流および高速フロー濾紙ディスク上でのIgG-FITCの異なる濃度の（B）（方法B）蛍光分子イメージャーの設定：励起、488nmで、発光、530nmで、解像度、100マイクロメートル。 ＃1グレード番号1、メディアフローフィルターペーパーディスク、及び＃113を表す等級番号113ファストフローフィルターペーパーディスクを表します。 APS修飾ペーパーディスクを最初に0.05％グルタルアルデヒドで処理しました。次に、IgGをFITCの異なる濃度のグルタルアルデヒド変性ペーパーディスクにロードしました。 IgG-FITCの添加濃度を増加させると、紙ディスク上に固定化されたIgG-FITCの量を増加させました。しかし、固定化されたIgG-FITCの増加した濃度は、抗原への結合能を改善しませんでした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アミン官能化セルロースペーパーディスク上の抗体の共有結合固定化のための基本的なワークフローは、 図1に示されている。ウサギ抗ヒトIgG-FITCは、共有セルロース紙ディスク上に固定化しました。ペーパーディスクからの蛍光は、ペーパーディスクに対する抗体の固定化を示し、そして蛍光強度は、固定された抗体の濃度に直接比例しました。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを、次に固定された抗体の結合能を決定するために適用しました。第二級アミン基およびアルデヒド基はバイオコンジュゲーション35において使用されたシッフ塩基を形成するために互いに反応することができます。これらはまた、キャプチャの共有結合固定化のために、ここで使用されました抗体。方法A（ 図1A）は、-NH 2、セルロースペーパーディスクに導入し、-CHOは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、抗体のFc領域を酸化して、ウサギ抗ヒトIgG-FITC由来しました。同様に、過ヨウ素酸ナトリウムおよびIgG-FITC抗体の様々な濃度の効果も分析しました。 図S1および図S2、0~1 mMの濃度の過ヨウ素酸ナトリウムに示され、ウサギ抗ヒトIgG-FITCは、0.016から0.16 mg / mlで0.08 mg / mlで、ウサギ抗ヒトIgGの酸化にほとんど効果がなかったとして-FITC。共有結合ペーパーディスクに結合させた抗体の量は、0 0.075ミリグラム/ mlで（ 図S3A）からの捕捉抗体の濃度の増加とともに増加しました。
結合能は、ペルオキシダーゼアッセイによって決定したときにかすかな色の変化が観察されました。これは、の使用が原因である可能性があります捕捉抗体と反応し、結合活性の喪失を引き起こす過剰な過ヨウ素酸ナトリウム、。過ヨウ素酸ナトリウムが完全に離れてペーパーディスクから洗浄することができない可能性があります。これは、過ヨウ素酸ナトリウム溶液をpurpald溶液と混合黄色を提供するという単純な原理によって確認しました。従って、過ヨウ素酸酸化された抗体は、ペーパーディスク上にロードし、1時間インキュベートしました。ペーパーディスクを、PBS（0.05％のTween-20を含む）で3回洗浄し、その後purpald溶液は、これらのディスクに加えました。ペーパーディスクは、過ヨウ素酸酸化抗体のアルデヒド基の存在を示し、直ちに紫色を示しました。この紫色は、ペーパーディスク上の過ヨウ素酸ナトリウムの存在が確認され、10分以内に黄色に変化しました。
代替的に、グルタルアルデヒド架橋法（方法B、 図1B）は 、アミンgrouをリンクするために使用しました。APS処理されたペーパーディスクおよび抗体からpsの。セルロース紙ディスク上にロードされたグルタルアルデヒドの濃度（ 図4）およびウサギ抗ヒトIgG-FITC（ 図5A）を最適化しました。 図4に示すように、蛍光強度は、ウサギのローディング抗ヒトIgG-FITCは、この濃度でセルロース紙ディスクに飽和になったことを意味し、グルタルアルデヒドの0.05％の最大値に達しました。 2.5％グルタルアルデヒドの濃度の増加は、セルロースペーパーディスク（ 図S4）にウサギ抗ヒトIgG-FITCの量の増加を示しませんでした。蛍光強度は、紙ディスク（ 図5A）にロードしたウサギ抗ヒトIgG-FITCの濃度の増加と共に増加しました。 peroxidasを含有ペーパーディスクにTMB基質と過酸化水素水混合溶液を添加するとすぐに開発青色電子共役検出抗体（ 図5B）。また、ブロッキング緩衝液10％の粉乳を15回洗浄した （ 図S5）後に遮断効率を維持することが示された脱脂含まれます。それは、その標的への結合活性を増強実証されるように方法Bは、固定された抗体のアプリケーションをテストするために選択しました。したがって、捕捉抗体の0.025 mg / mlでの濃度は、IgGの検出のために使用しました。
紙ベースのELISAによってIgGの決意については、 図6 の較正曲線＃1グレード番号1を表し、メディアフローフィルターペーパーディスク、及び＃113は、等級番号113ファストフローフィルターペーパーディスクを表します。上側のパネルAは、媒体流IgGの異なる濃度（＃1）及びファストフロー（＃113）セルロースペーパーディスク用のカラー読み出しを示します。底面Bは、IgGの異なる濃度についてのELISAの結果を示します。三重は、標準偏差（SD）を決定するために使用した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HRP結合ヤギ抗マウスIgG-Fcの断片の捕捉抗体、IgG血清、ヤギ抗マウスIgG-Fc断片抗体サンドイッチアッセイのために使用しました。 図6と図S6、0〜500 ng / mlでのIgGの血清濃度に示すように、各ステップは1時間インキュベートしたときに、比色強度と線形関係を有していました。 図S6において、IgGの異なる濃度の色の変化は、1時間のインキュベーションのために明らかでした。しかし、10分のインキュベーションの結果は、IgGの異なる濃度の色強度の明らかな変化を示しませんでした。このように、SENSこの紙ベースのELISAのitivityは、実用的なポイント・オブ・ケア検査を開発するのに適していました。
図S1。過ヨウ素酸ナトリウム（方法A）異なる濃度の蛍光応答。過ヨウ素酸ナトリウム、種々の濃度は、0.016 mg / mlとし、抗体の酸化活性の研究のために使用される濃度で、ウサギ抗ヒトIgG-FITCと混合しました。過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を増加させることによって、のIgG-FITCの積載量が増加し、0.25 mmに最大に達しました。なお、これよりも高かった過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は、固定化されたIgG-FITCの量を増加させなかったことが観察されました。三重は、標準偏差（SD）を決定するために使用した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S2。蛍光応答ウサギ抗ヒトIgG-FITC（方法A）異なる濃度のS。過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は、抗体酸化活性試験のために溶液中に0.25 mmで、各ディスク上でのウサギ抗ヒトIgG-FITCの最終濃度mlの0.016ミリグラム/でした。過ヨウ素酸ナトリウムの濃度を固定したとき、のIgG-FITCの濃度は、IgG-FITCの酸化にほとんど影響を及ぼしませんでした。三重は、標準偏差（SD）を決定するために使用した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S3。蛍光応答と測色結果ペーパーディスク（方法A）に酸化されたウサギ抗ヒトIgG-FITCの異なる濃度をロードする。過ヨウ素酸ナトリウム酸化にはIgG-FITCの0.08 mg / mlで0.25 mMの過ヨウ素酸ナトリウムを使用しました。ペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgGの希釈でした1：50,000。セルロース紙ディスク上のIgG-FITCの添加濃度を増加させると、固定化されたIgG-FITCの量を増加したが、標的結合に影響を持っていませんでした。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S4。セルロースペーパーディスク（方法B）上のIgG-FITCの固定化におけるグルタルアルデヒドの高濃度の蛍光応答。各ディスク上のIgG-FITCの濃度は0.01 mg / mlでした。 0.25％より高かったグルタルアルデヒドの濃度は、セルロース紙ディスク上に固定化されたIgG-FITCの量を増加させなかった。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S5。洗浄回数の効果。 A：ました。興三回B：洗濯15回。セルロース正方形の紙に固定された捕捉抗体はまだ正方形の紙を15回ボルテックスしたにもかかわらず、それらのターゲットへの良好な結合能力を持っていた。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S6。紙ベースのIgGについてのELISAの結果。0〜500 ng / mlでからのIgGの濃度については、1時間のインキュベーションの結果は、インキュベーションの10分からの結果よりも優れています。 IgGの高濃度のために、10分のインキュベーションのために十分な時間です。三重は、標準偏差（SD）を決定するために使用した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S7。走査電子顕微鏡（SE異なる倍率でのメディアフローフィルターペーパーのM）の画像。 ：85XおよびB：20,000。 5キロボルトで動作する電界放射型走査電子顕微鏡（FE-SEM）は、粒子の形態を決定するために使用しました。セルロース繊維がランダムに架橋されている。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
図S8。異なる倍率での高速フロー濾紙のSEM像。 ：100XおよびB：20,000。 5キロボルトで動作する電界放射型走査電子顕微鏡（FE-SEM）は、粒子の形態を決定するために使用しました。セルロース繊維がランダムに架橋されている。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
非修飾セルロースペーパーディスク上のアフィニティー精製したヤギ抗マウスIgG-Fcの捕捉抗体の直接コーティングは、IgG濃度を検出するために行きました。結果は、捕捉抗体のさらなる固定が再現性のために必要とされることを示しました。シラン化技術は、正常セルロースペーパーディスク34にアミン官能基を導入するために使用されました。 APSの濃度は、抗体の固定化に影響を与えます。したがって、アセトン中のAPSの量も最適化しました。アセトン10ml中のAPSの1ミリリットルは、グルタルアルデヒド架橋剤を介して抗体を固定化するためのアミン基をグラフトするための最適濃度でした。抗体を過ヨウ素酸酸化およびグルタルアルデヒド架橋法によりセルロース紙ディスク上に移植しました。我々の結果は、グルタルアルデヒド架橋法により固定された抗体の結合能がMEDのための過ヨウ素酸酸化法よりも優れていたことを明らかにしましたイウム流れと速い流れ-濾紙ディスク。また、グルタルアルデヒド架橋法によりセルロースペーパーディスク上に固定化した捕捉抗体は、それらの機能を保持し、安定紙をボルテックスで15回洗浄の機械的ストレスを受けたにもかかわらず、固定化しました。脱脂粉乳ブロッキング緩衝液の10％は、15回の洗浄（ 図S5）後に遮断効率を保持することが見出されました。
共有結合的に固定化された抗体は、IgGの検出をサンドイッチELISAを行うために使用されました。 100ng / mlの濃度でIgGをこのペーパーディスクベースのアッセイを用いて目視で検出しました。 0〜500 ng / mlでのIgG血清の濃度は、各ステップが1時間インキュベートした比色強度と直線関係を示しました。 ELISAをベースとこのペーパーディスクのための免疫アッセイ試験は少ないサンプル試薬を必要とし、従来のイムノアッセイ36よりも効率的であるように見えました図S7及びS8、図に示されています。これらの図に示すように、繊維がランダムに濾紙ディスク25の両方の種類の架橋されています。この高感度の理由は、ペーパーディスクの厚さであるかもしれません。高速フローフィルターペーパーディスクの場合は厚さが中程度のフローフィルタ紙用180ミクロンに比べて420μmでした。したがって、より多くの捕捉抗体は、さらに、アッセイの感度を増加させる高速流濾紙ディスク上に固定化される可能性がありました。これと同時に、高速フロー濾紙ディスク（30ミクロン）のための孔径は、11＆＃（中流量濾紙ディスクのそれよりも大きかったです181; M）。紙面ブロッキングした後、元の孔径は、依然として余分な電力システムなしで液体の流れを駆動するのに十分な大きさでした。しかし、後者のバッファのフローの速度は遅かったです。したがって、高速フロー濾紙はイムノアッセイのアプリケーションでメディアフローろ紙よりも良好でした。
固定化された濾紙ディスク上での抗体の再現性は、TMB基質と過酸化水素水混合液をロードした後、測色結果のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGと検出とのペーパーディスクをさらにインキュベートすることによって評価しました。標準偏差は、この紙ベースのデバイスのための10％未満でした。 -NH 2変性セルロースペーパーディスクにウサギ抗ヒトIgG-FITCの安定性は、最大2ヶ月間試験しました。 4°Cで保存したペーパーディスクは、その双方向のわずかな減少とヤギ抗ウサギIgG結合をペルオキシダーゼに結合活性を維持しnding活動。抗体固定化されたペーパーディスクを、室温または60℃で保存した。しかし、それらは、原因乾燥や高温への結合活性を失いました。キャプチャされた抗体は、これらの条件下で不安定化し、変性している可能性があります。
架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて、セルロース紙ディスク上の捕獲抗体の固定化におけるいくつかの重要なステップがあります。ペーパーディスク上のアミン基をグラフトするためのステップ1.2は、捕捉抗体の成功した共有結合固定化における重要なステップです。このステップが失敗した場合、全体の固定化プロセスは失敗します。 FTIRは、アミン基が正常ペーパーディスク（ステップ1.6）上に固定化されたかどうかを決定するために使用しました。第二に、セルロース紙ディスク上のアルデヒド基のグラフトは、別の重要なステップ（ステップ2.2.1およびステップ3.1）です。抗体は、共有結合でシッフ塩基の形成を介してセルロースペーパーディスク上に固定化しました。最後に、ろ紙ディスク上に捕捉抗体を固定化する工程が重要（ステップ2.2.3、ステップ3.4、ステップ3.5）です。捕捉抗体のアミン基は、紙ディスク上に抗体を固定するセルロース紙ディスクからのアルデヒド基と反応させます。このステップが失敗した場合、捕捉抗体は、ペーパーディスク上に固定化されないだろうとELISAのアプリケーション・テストの全てが負になります。私たちは、捕捉抗体の存在を決定するために蛍光分子イメージャーを使用することができます。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGおよびペルオキシダーゼベースの比色反応は、固定化された抗体の結合能力を確認するために使用することができます。
このプロトコルは、このような信号に高いバックグラウンド、無信号または弱い信号、および色ムラの読み出しなどいくつかの問題が発生する場合があります。これらの問題を克服するため、これらの問題およびトラブルシューティング方法の考えられる原因を以下に説明します。高いバックグラウンドシグナルは、通常、デュ発生しますショートブロック時間に電子。これは、ブロッキングインキュベーション時間を増加させる十分ペーパーディスクを洗浄し、高いバックグラウンド信号を除去するために過剰の検出抗体複合体の酵素の添加を回避することによって解決することができます。考えられる原因は、ブロック上の標的抗原が存在しない場合、不十分なインキュベーション時間、および非機能的な検出抗体酵素複合体が挙げられます。これらの問題を克服するために、標的抗原を加え、新たな抗体コンジュゲートを使用し、製造業者によって示唆されるようにそれを格納する適切な期間インキュベートされなければなりません。検出のための陽性対照を含めることをお勧めします。色ムラの読み出しは、グラフト化工程中紙ディスクの積み重ねによるものです。この問題を回避するために、紙ディスクをAPSグラフトプロセス中に分離しなければならず、抗原及び検出抗体複合体酵素は、各ステップでペーパーディスク上に均一に広げなければなりません。
紙ベースのアッセイは、単純であるがかつコスト効果的な方法は、制限があります。グルタルアルデヒド架橋剤は、Fab領域と捕捉抗体のFc領域からのアミン基と反応するように、基板表面上の抗体の配向性は、イムノアッセイの性能にとって重要です。このように、固定化された抗体は、高度に配向した方法で発生しません。 Fab領域からより多くのアミン基は、IgG抗体のFc領域と比べてあるので、固定された抗体の結合活性は、依然として、そのアプリケーションのために十分に高いです。
セルロース紙に異なる表面機能化法は、最近の報告37にまとめました。このようなジビニルスルホンなどの試薬; 1,4-フェニレンジイソチオシアネート; 4-アジド - ベンゼン;エピクロロヒドリン; 4-アジド - フルオロ-2-ニトロシクロヘキサン。 4-メルカプト - ベンゼンは、共有結合でセルロース紙に生体分子を固定化するために使用することができます。吸着・捕捉も利用しました。生体分子とセルロース紙をコートします。他の方法と比較して、セルロース紙にシラン技術と抗体の共有結合固定化のためのグルタルアルデヒド架橋剤の組み合わせは、簡単な方法です。また、この組み合わせは、免疫アッセイにおいて最大垂直フロースルーを可能にする、セルロース紙の熱的及び機械的性能にほとんど影響を有していてもよいです。この戦略は、セルロース紙の他の生体分子を固定化するために拡張することができます。
ここで実証された方法論は、潜在的に限り、それに対する直接的な抗体が利用可能であるように、任意の検体の検出に拡張することができました。この方法はまた、多重検出を開発するために使用することができます。例えば、正方形の紙の上に、異なる領域は、様々なターゲットのために区別することができます。ターゲットの捕捉抗体は、その特定の領域にグルタルアルデヒド架橋剤を介して固定化することができます。これは、ELISを続けることができます手順は、様々なターゲットを検出することができる。このように、提案手法は、肉眼を使用して他の標的の検出のための紙ベースのELISA多目的なツールとなります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| ImageJ | RGB, free download | N/A |
References
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M. Simple telemedicine for developing regions: camera phones and paper-based microfluidic devices for real-time, off-site diagnosis. Anal. Chem. 80 (10), 3699-3707 (2008).
- Lode, P. V. Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods. Clin. Biochem. 38 (7), 591-606 (2005).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Amerongen, A. V., Korf, J., Berkel, W. J. V. Perspectives for on-site monitoring of progesterone. Trends Biotechnol. 27 (11), 652-660 (2009).
- Lim, D. V., Simpson, J. M., Kearns, E. A., Kramer, M. F. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 18 (4), 583-607 (2005).
- Li, X., Tian, J., Shen, W. Progress in patterned paper sizing for fabrication of paperbased microfluidic sensors. Cellulose. 17 (3), 649-659 (2010).
- Nie, Z., et al. Electrochemical sensing in paper-based microfluidic devices. Lab Chip. 10, 477-483 (2010).
- Delaney, J. L., Hogan, C. F., Tian, J., Shen, W. Electrogenerated chemiluminescence detection in paper-based microfluidic sensors. Anal. Chem. 83 (4), 1300-1306 (2011).
- Oh, Y. K., Joung, H. A., Kim, S., Kim, M. G. Vertical flow immunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip. 13 (5), 768-772 (2013).
- Cheng, C. M., et al.
- Jarujamrus, P., Tian, J., Li, X., Siripinyanond, A., Shiowatana, J., Shen, W. Mechanisms of red blood cells agglutination in antibody-treated paper. Analyst. 137 (9), 2205-2210 (2012).
- Credou, J., Volland, H., Dano, J., Berthelot, T. A one-step and biocompatible cellulose functionalization for covalent antibody immobilization on immunoassay membranes. J. Mat. Chem. B. 1, 3277-3286 (2013).
- Kong, F., Hu, Y. F. Biomolecule immobilization techniques for bioactive paper fabrication. Anal. Bioanal. Chem. 403, 7-13 (2012).
- Orelma, H., Teerinen, T., Johansson, L. S., Holappa, S., Laine, J. CMC-modified cellulose biointerface for antibody conjugation. Biomacromolecules. 13, 1051-1058 (2013).
- Yu, A., et al. Biofunctional paper via covalent modification of cellulose. Langmuir. 28 (30), 11265-11273 (2012).
- Stollner, D., Scheller, F. W., Warsinke, A. Activation of cellulose membranes with 1,1′-carbonyldiimidazole or 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate as a basis for the development of immunosensors. Anal Biochem. 304 (2), 157-165 (2002).
- Bora, U., Sharma, P., Kannan, K., Nahar, P. Photoreactive cellulose membrane - a novel matrix for covalent immobilization of biomolecules. J. Biotechnol. 126 (2), 220-229 (2006).
- Sharma, P., Basir, S. F., Nahar, P. Photoimmobilization of unmodified carbohydrates on activated surface. J Colloid Interface Sci. 342 (1), 202-204 (2010).
- Brumer, H., Zhou, Q., Baumann, M. J., Carlsson, K., Teeri, T. T. Activation of crystalline cellulose surfaces through the chemoenzymatic modification of xyloglucan. J. Am. Chem. Soc. 126 (18), 5715-5721 (2004).
- Araujo, A. C., Song, Y., Lundeberg, J., Stahl, P. L., Brumer, H. Activated paper surfaces for the rapid hybridization of DNA through capillary transport. Anal Chem. 84 (7), 3311-3317 (2012).
- Xu, C., Spadiut, O., Araujo, A. C., Nakhai, A., Brumer, H. Chemo-enzymatic Assembly of Clickable Cellulose Surfaces via Multivalent Polysaccharides. ChemSusChem. 5 (4), 661-665 (2012).
- Filpponen, I., et al. Generic method for modular surface modification of cellulosic materials in aqueous medium by sequential "click" reaction and adsorption. Biomacromolecules. 13 (3), 736-742 (2012).
- Feese, E., Sadeghifar, H., Gracz, H. S., Argyropoulos, D. S., Ghiladi, R. A. Photobactericidal porphyrin-cellulose nanocrystals: synthesis, characterization, and antimicrobial properties. Biomacromolecules. 12 (10), 3528-3539 (2011).
- Zang, D., Ge, L., Yan, M., Song, X., Yu, J. Electrochemical immunoassay on a 3D microfluidic paper-based device. Chem. Commun. 48 (39), 4683-4685 (2012).
- Ge, L., Yan, J. X., Song, X. R., Yan, M., Ge, S. J., Yu, J. H. Three-dimensional paper-based electrochemiluminescence immunodevice for multiplexed measurement of biomarkers and point-of-care testing. Biomaterials. 33 (4), 1024-1031 (2012).
- Wang, S., et al. Paper-based chemiluminescence ELISA: lab-on-paper based on chitosan modified paper device and wax-screen-printing. Biosens. Bioelectron. 31 (1), 212-218 (2012).
- Koev, S. T., et al. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Wang, S. M., et al. Simple and covalent fabrication of a paper device and its application in sensitive chemiluminescence immunoassay. Analyst. 137 (16), 3821-3827 (2012).
- Sadira, S., Prabhakaranc, M. P., Wicaksonob, D. H. B., Ramakrishna, S. Fiber based enzyme-linked immunosorbent assay for C-reactive protein. Sensor Actuat B-Chem. 205, 50-60 (2014).
- Koga, H., Kitaoka, T., Isogai, A. In situ modification of cellulose paper with amino groups for catalytic applications. J. Mater. Chem. 21, 9356-9361 (2011).
- Klemm, D., Heublein, B., Fink, H. P., Bohn, A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angew. Chem., Int. Ed. 44 (22), 3358-3393 (2005).
- Fernandes, S. C. M., et al. Bioinspired antimicrobial and biocompatible bacterial cellulose membranes obtained by surface functionalization with aminoalkyl groups. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5 (8), 3290-3297 (2013).
- Pharos FX plus molecular imager instructions, Catalog Number 170-9460. , (2005).
- Tee, Y. B., Talib, R. A., Abdan, K., Chin, N. L., Basha, R. K., Yunos, K. F. M.
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nat Protoc. 2, 1152-1165 (2007).
- Guidi, A., Laricchia-Robbio, L., Gianfaldoni, D., Revoltella, R., Del Bono, G. Comparison of a conventional immunoassay (ELISA) with a surface plasmon resonance-based biosensor for IGF-1 detection in cows' milk. Biosens Bioelectron. 16, 971-977 (2001).
- Ahmed, S., Bui, M. N., Abbas, A. Paper-based chemical and biological sensors: Engineering aspects. Biosens Bioelectron. 77, 249-263 (2016).
