Summary
Le protocole présenté dans cette étude décrit des procédés pour la surveillance en temps réel de la progression de la reprogrammation par l'intermédiaire de la mesure cinétique des marqueurs de cellules souches pluripotentes positives et négatives à l'aide de l'analyse de cytométrie en flux. Le protocole comprend également l'évaluation fondée sur l'imagerie-de la morphologie, et le marqueur ou l'expression rapporteur lors de la génération iPSC.
Introduction
les cellules de patients dérivées induites souches pluripotentes (CISP) sont des outils prometteurs pour la thérapie cellulaire et le criblage de médicaments. Elles fournissent une source autologue de cellules pour la thérapie. En outre, ils englobent un très large éventail de fonds génétiques, ce qui permet une analyse détaillée in vitro de maladies génétiques au - delà des lignes de courant les cellules souches embryonnaires (ESC) permettrait. Des progrès récents ont conduit au développement de plusieurs procédés pour produire iPSCs, y compris une reprogrammation avec le virus Sendai, des plasmides épisomiques ou ARNm 1,2. Notamment, les différentes méthodes de reprogrammation sont associés à des niveaux d'efficacité et de sécurité différents, et sont susceptibles de différer d'autres façons qui influent sur leur pertinence pour diverses applications. Avec la disponibilité d'une variété de technologies de reprogrammation, il est devenu important de développer des méthodes pour évaluer le processus de reprogrammation. La plupart des méthodes existantes reposent sur l'inspection qualitative de la morphologie ou la colorationavec des colorants et des anticorps spécifiques de cellules souches. Une méthode développée récemment fait appel à des journalistes de fluorescence lentiviraux qui sont sensibles aux miARN spécifiques à la CFP ou des ARNm spécifiques de cellules différenciées 3. Ces méthodes de surveillance facilitent la sélection et l'optimisation des techniques de reprogrammation pour des situations différentes. Par exemple, CDy1 a été utilisé comme une sonde fluorescente pour le début de CSPi afin de dépister des modulateurs de reprogrammation 4. La capacité d'observer et de comparer les différentes expériences de reprogrammation est également critique pour une meilleure compréhension du processus lui-même. Par exemple, on sait maintenant que certains types de cellules somatiques sont plus faciles à reprogrammer 5 que d' autres, et que les cellules passent par des états intermédiaires pendant la reprogrammation 6-8. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents du processus de reprogrammation ne sont pas encore complètement compris et, par conséquent, les différences exactes entre les méthodes de reprogrammation restent également à defined. Ainsi, les méthodes de suivi, d'évaluation et de comparaison des événements de reprogrammation continuent d'être critique pour le domaine des cellules souches.
Les méthodes décrites dans ce protocole permettent le suivi et l'évaluation du processus de reprogrammation et illustrent la façon dont ces techniques peuvent être utilisées pour comparer les différents ensembles de réactifs de reprogrammation. La première approche consiste à cytométrie en flux analyse en utilisant des combinaisons d'anticorps dirigés contre la cellule positive et négative souches pluripotentes (PSC) des marqueurs. Le second couple d'approche imagerie en temps réel et la mesure de la confluence totale (la surface couverte pour cent par les cellules) et la confluence des signaux de marqueur (la surface couverte pour cent par les signaux fluorescents).
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Protocol
1.Solution et moyennes Préparation
- Sous - sol Membrane Matrix (Purifié de Engelbreth-Holm-Swarm tumeur)
- décongeler lentement la matrice de membrane basale (5 ml) sur de la glace à 4 ° C pendant une nuit.
- Diluer la solution stock 1: 1 avec 5 ml de glace froide, DMEM stérile / F-12 dans un pré-refroidi 15 ml tube stérile, conique. Distribuer aliquotes dans des tubes micro de centrifugeuse de 1,5 ml stériles pré-réfrigérés et stocker immédiatement à -20 ° C.
- Avant utilisation, décongeler la gelée 1: 1 membrane basale matrice aliquote nuit à 4 ° C. Au moment de l'emploi, diluer le rapport 1: 1 aliquote autre 50 fois avec de la glace froide, DMEM stérile / milieu F-12 à une dilution finale de 1: 100.
- Ajouter la quantité appropriée de la solution 1: matrice de membrane 100 sous-sol dilué à la culture de tissu approprié (TC) des navires et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. En règle générale, utiliser 3 ml de la solution de matrice de membrane basale diluée pour enrober un plat de TC of 20 cm 2 de surface, manteau tous les autres types de plats TC / plaques à un rapport de 0,15 ml de matrice diluée par cm 2 de surface. Aspirer la solution restante avant l'addition de tout milieu de culture et des cellules.
- Fibroblast Medium
- Décongeler une bouteille de ES qualifié de sérum bovin fœtal (ES-FBS) 100 ml à 4 ° C pendant la nuit.
- Ajouter 50 ml de la décongelé ES-FBS et 5 ml de solution d'acides aminés non essentiels MEM (1x) à 445 ml de milieu DMEM. Stériliser les composants combinés à travers un filtre de 0,22 um et stocker le milieu à 4 ° C pendant jusqu'à 4 semaines.
- Imef Medium
- Décongeler une bouteille de ES-FBS 100 ml à 4 ° C pendant la nuit.
- Ajouter 50 ml de SVF décongelé, 5 ml de solution d'acides aminés non essentiels MEM (1x), et 500 pi de 2-mercaptoéthanol à 445 ml de milieu DMEM.
- Stériliser les composants combinés à travers un filtre de 0,22 um et stocker le moidium à 4 ° C pendant 4 semaines.
- Solution facteur de croissance des fibroblastes de base (b-FGF)
- Ajouter 10 pi de remplacement de sérum à 990 pi de D-PBS et mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas.
- Ajouter les 1 ml de 1% (v / v) d'une solution de remplacement de sérum dans un flacon de 10 ug lyophilise le b-FGF. Bien mélanger par pipetage de haut en bas.
- Aliquoter le / ml de solution de b-FGF 10 pg dans 200 aliquotes dans des tubes micro-centrifugeuse et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour un maximum de 4 semaines.
- Cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) Medium
- Décongeler une bouteille de sérum de remplacement de 100 ml à 4 ° C pendant une nuit.
- Ajouter 100 ml de remplacement de sérum décongelés, 5 ml de solution d'acides aminés non essentiels MEM (1x), et 500 pi de 2-mercaptoéthanol à 395 ml de DMEM / F-12.
- Stériliser les composants combinés à travers un filtre de 0,22 um et stocker le milieu à4 ° C pendant jusqu'à 4 semaines.
- Au moment de l'utilisation, le pré-chauffer le milieu HPSC à 37 ° C et à compléter avec 4 ng / ml de bFGF.
- Imef milieu conditionné (CM)
- Ajouter 18 ml de gélatine à 0,1% dans un flacon T-175 et on incube la culture à 37 ° C pendant 1 heure.
- Enlever la solution de gélatine à 0,1% après une heure d'incubation. Ajouter 9,1 x 10 6 fibroblastes embryonnaires de souris inactivées sur le plan mitotique-(Imef) dans 45 ml de milieu et on incube Imef dans l'incubateur à 37 ° C pendant une nuit.
- Après une nuit d'incubation, enlever l'ancien milieu Imef et laver une fois avec 25 ml de D-PBS pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le D-PBS de lavage et ajouter 90 ml de milieu HPSC préchauffée, additionné de 4 ng / ml de bFGF. Incuber dans le 37 ° C incubateur pendant exactement 24 heures.
- Après 24 heures d'incubation, retirez aseptique le milieu HPSC du ballon Imef et stériliser à travers un filtre de 0,22 um. Aliquoter dans 50 ml tubes et gel coniques à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Imef CM peut être stocké pendant jusqu'à 6 mois à -20 ° C.
- Ajouter un autre 90 ml de milieu préchauffé HPSC additionné de 4 ng / ml de bFGF dans le ballon Imef. Incuber dans le 37 ° C incubateur pendant exactement 24 heures. Répétez la récolte de CM pour un maximum de 7 jours.
- Au moment de l'utilisation, le pré-chauffer le Imef-CM à 37 ° C et à compléter avec 4 ng / ml de bFGF.
- E8 Medium
- Décongeler un supplément de 10 ml E8 à 4 ° C pendant la nuit.
- Prélever 10 ml de milieu de base E8 et ajouter de façon aseptique le contenu du complément E8 décongelée au milieu de base restant. Mélanger soigneusement et stériliser à travers un filtre de 0,22 um. Conserver le milieu complet à 4 ° C pendant 2 semaines.
- Au moment de l'utilisation, le pré-chauffer l'aliquote du milieu à utiliser à la température ambiante. Il est recommandé de ne pas préchauffer E8 moyenne à 37 ° C.
- cellule doncrter Buffer
- Préparer un tampon de tri frais juste avant le tri des cellules par addition d'une solution d'EDTA (1 mM, concentration finale), du tampon HEPES (concentration de 25 mM final), une solution de pénicilline / streptomycine (100 unités / ml de concentration finale) et de la sérumalbumine bovine (1% de concentration finale) dans phosphate Buffered Saline Dulbecco (calcium et magnésium gratuit).
- Stériliser le tampon à travers un filtre de 0,22 pm avant l'utilisation.
- Tri cellulaire Recovery Medium
- Modifier 50 ml de fibroblaste moyen en ajoutant Pénicilline / streptomycine (100 unités / ml de concentration finale) Rock Inhibitor Y-27632 (10 pM concentration finale). Préchauffer ce milieu à 37 ° C avant l'ensemencement des cellules triées.
2. Sendai Mediated Reprogrammation des fibroblastes humains
- 24 heures avant la transduction avec les virus Sendai, épépiner les fibroblastes à une densité de 2 x 10 5 caunes par puits dans les puits souhaités d'une plaque de TC 6 puits.
- Effectuer la transduction au jour 0 de la manière suivante.
- Pré-chauffer 2 ml de fibroblaste moyen dans un bain d'eau à 37 °. Retirer un ensemble de tubes de virus Sendai de -80 ° C stockage et dégeler chaque tube un à la fois par la première immersion de la partie inférieure du tube dans un bain à 37 ° de l'eau pour 5-10 sec, puis retirer le tube de l'eau baignoire et laisser décongeler à la température ambiante. Une fois décongelé, centrifuger brièvement le tube et le placer immédiatement sur la glace.
- Utiliser des virus Sendai dans le commerce de la deuxième génération en ajoutant les volumes appropriés (selon la COA) pour chacun des tubes afin d'obtenir la pluralité suivante d'infection (MOI) de 1 ml de pré-chauffé fibroblaste moyenne par puits pour transduire comme suite : KOS = 5 x 10 6 CIU, hc-Myc = 5 x 10 6 CIU, hKlf4 = 3 x 10 6 CIU.
- Bien mélanger la solution virale par pipetage le mélange doucement monter et descendre. compleTe l'étape suivante dans les 5 min.
- Aspirer le fibroblaste moyen du puits des fibroblastes à reprogrammées, et ajouter 1 ml de la solution virale à chaque puits. Placer les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur et incuber pendant une nuit.
- Après une nuit d'incubation, Aspirer le milieu de transduction et de disposer de l'ancien milieu correctement (solution d'eau de Javel à 10% pendant 30 minutes). Remplacer par 2 ml de pré-chauffé Fibroblast moyenne et continuer à cultiver les cellules transduites.
- Culture des cellules pendant 6 jours, en remplacement de l'ancien milieu avec des produits frais Fibroblast Medium tous les autres jours.
Note: Ne pas le passage des cellules reprogrammées jusqu'à 7 jours après la transduction. - Jour 6: Préparer des plats pour iPSC Generation
- Pour alimentation dépendant génération iPSC, ajouter une solution de gélatine 1,5 ml de 0,1% à chaque puits d'une culture de tissus à 6 puits (TC) plat et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Retirez la gélatine à 0,1% afinrésolu- après 1 h d'incubation. Ajouter 3 x 10 5 fibroblastes embryonnaires de souris mitotique-inactivés (Imef) dans 2 ml de milieu Imef par puits et incuber dans le 37 ° C incubateur pendant une nuit.
- Pour alimentation indépendante génération iPSC, ajouter 1,5 ml de sous-sol dilué matrice de membrane (1: 100 de dilution) pour chaque puits d'une culture de tissus à 6 puits (TC) plat et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Sept jours après la transduction, récolter les fibroblastes transduits et re-PLATE-les sur les boîtes de culture pré-faites pour iPSC génération de colonie.
- Aspirer le milieu de culture normale des fibroblastes, et laver les cellules une fois avec 2 ml de D-PBS.
- Aspirer le D-PBS laver et ajouter 0,5 ml de 0,05% de trypsine / EDTA préchauffée. Incuber les cellules pendant 3 - 5 min à 37 ° C.
- Lorsque les cellules ont arrondi, ajouter 2 ml de pré-chauffé Fibroblast moyenne dans chaque puits pour arrêter la trypsine. Déloger les cellules du puits par pipetage til milieu à travers la surface de la coupelle. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube centrifuge conique de 15 ml.
- Centrifuger les cellules à 200 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 ml frais, préchauffé Fibroblast moyenne.
- Compter les cellules à l' aide de la méthode désirée (hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique) et ensemencer des boîtes de culture préalablement préparés avec 5 x 10 4 cellules pour les conditions d'alimentation dépendant et 1 x 10 5 cellules pour des conditions d'alimentation indépendante, par puits d'une 6 -Bien plat et incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant une nuit.
- Suite à l'incubation d'une nuit, changer le milieu à moyen HPSC, moyen ou E8 media Imef conditionné, selon l'application. Remplacer l'ancien milieu avec du milieu frais tous les jours par la suite.
3. Sendai Reprogrammation de BGO1v hOct4-GFP Embryonic Reporter Human Stem Cells (CSEh) dérivées Fibroblastes secondaires
- derive fibroblastes humains secondaires de la ligne journaliste CSEh BG01v hOct4-GFP selon la procédure décrite précédemment 9.
- Deux jours avant la transduction, la plaque BGO1v / HOG dérivé des fibroblastes dans deux puits d'une plaque à 6 puits à 2 x 10 5 cellules par puits, en utilisant Fibroblast Medium.
- Le jour de la transduction, pré-chauffer 2 ml de fibroblaste moyenne à 37 ° C.
- Retirer un ensemble de tubes Sendai du -80 ° C stockage. Retirer les flacons de la poche et dégeler chaque tube une à la fois en immergeant d'abord le bas du tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 5 à 10 secondes, après quoi, laisser les tubes à décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, centrifuger brièvement le tube et le placer immédiatement sur la glace.
- Ajouter les volumes de chacun des trois tubes Sendai indiqués (voir le CoA pour le volume approprié) à 2 ml de fibroblaste moyen, pré-chauffé à 37 ° C et mélanger soigneusement la solution virale par pipetage de haut en bas. Terminez la prochaine step à moins de 5 min.
Remarque: Pour cette expérience, une MOI de 5: 5: 6 a été utilisé. - Aspirer le fibroblaste moyen des puits de fibroblastes à transduction. Ajouter 1 ml de la suspension virale à chacun des deux puits à transduction. Placer les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur et incuber pendant une nuit.
- Après une nuit d'incubation, éliminer le milieu de transduction et disposer correctement (solution d'eau de Javel à 10% pendant 30 minutes). Remplacer chaque puits avec 2 ml de pré-chauffé Fibroblast moyenne et continuer à cultiver les cellules transduites.
- Culture des cellules pendant 6 jours, en changeant l'ancien milieu avec des produits frais Fibroblast Medium tous les autres jours.
- Sept jours après la transduction, la récolte des fibroblastes transduits et re-PLATE-les sur les boîtes de culture pré-faites pour iPSC génération de colonie.
- Aspirer le milieu de culture normale des fibroblastes, et laver les cellules une fois avec 2 ml de D-PBS.
- Aspirer le DPBS laver et ajouter 0,5 ml de 0,05% de trypsine / EDTA préchauffée. Incuber les cellules pendant 3 - 5 min à 37 ° C.
- Lorsque les cellules ont arrondi, ajouter 2 ml de pré-chauffé Fibroblast moyenne dans chaque puits pour arrêter la trypsine. Détacher les cellules du puits par pipetage du milieu à travers la surface de la coupelle. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube centrifuge conique de 15 ml.
- Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une quantité appropriée de frais, préchauffé Fibroblast moyenne.
- Compter les cellules en utilisant la méthode souhaitée (hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé).
- Ensemencer les cellules transduites à une densité de 1 x 10 5 cellules par puits d'une matrice de membrane basale revêtu de plaque à 6 puits et incuber dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant une nuit.
- Suite à l'incubation d'une nuit, changer le milieu à Imef milieu conditionné, additionné de 10 ng / ml de b-FGF. Remplacer l'ancien milieu avec des produits frais Imef CM tous les jours par la suite.
- Trois semaines après la transduction, disséquer mécaniquement et transférer les colonies souhaitées pour l'expansion clonale ou d'utiliser pour l'analyse.
4. Imagerie de cellules vivantes Fibroblast Reprogrammation
- Surveillance en temps réel
- 7 jours après transduction avec le kit de reprogrammation Sendai, ensemencer la quantité désirée de cellules sur des boîtes à 6 puits avec les systèmes de moyenne et matrice souhaités comme décrit précédemment. Placez les plats ensemencées dans l'imageur, situé dans un incubateur humidifié réglé à 37 ° C, et 5% de CO 2.
- Réglez le logiciel d'imagerie pour capturer des images de puits entiers de chaque puits à un intervalle de jeu (tous les 6-8 heures) d'images en continu la capture pour les 14 prochains jours selon le protocole du fabricant.
Remarque: Les paramètres d'image de contraste de phase sont sélectionnés pour la reprogrammation normale pour évaluer la progression de la colonie. Dans le casde BG01v / HOG dérivé de fibroblaste reprogrammation, il est préférable de capturer des images en contraste de phase et dans le canal vert fluorescent comme la ré-activation du endogène OCT4-GFP reporter peuvent être suivis tout au long du processus de reprogrammation. - Changer le support quotidien, il peut être moyen HPSC, moyen E8, ou Imef-CM, en fonction de l'expérience, comme décrit précédemment de Jour 8 à 21 post-transduction. Les puits peuvent être analysés plus avant pour la formation de colonies à l'aide immunofluorescence indirecte.
- A la fin de l'expérience le jour 19 à 21, éliminer le milieu de culture provenant de chaque puits pour être sondé avec des anticorps pour les fibroblastes et les cellules souches marqueurs de choix.
- Laver chaque puits une fois avec 2 ml de / F-12 DMEM préchauffé.
- Préparer des aliquotes de chacune des paires d'anticorps négatifs / positifs primaires dans 1 ml de DMEM / F-12 comme suit: anti-souris SSEA4 (1: 200) et anti-CD44 de rat (01:50), anti-souris TRA-1- 60 (1: 200) et anti-CD44 de rat (01:50) et la phosphatase alcaline Live Stain (1:50) et CD44 anti-rat (1:50). Ajouter les ml solutions 1 d'anticorps primaire à chaque puits correspondant. Incuber à 37 ° C pendant 45 min.
- Aspirer la solution d'anticorps primaire et laver deux fois avec DMEM préchauffé / F-12.
- Préparer des solutions d'anticorps secondaires (1 ml pour chaque puits) en utilisant des anticorps de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 conjugué secondaire (1: 500) pour la fluorescence verte et de chèvre anti-rat de Alexa Fluor 594 conjugué secondaire (1: 500) pour la fluorescence rouge DMEM / milieu F-12. Ajouter à chaque puits après le lavage final. Incuber les anticorps secondaires pendant 30 min à 37 ° C.
Note: En raison de Alkaline (APLS) de phosphatase en direct Stain signal transitoire, l'incubation primaire anti-CD44 doit être effectué d'abord par lui-même et l'APLS devrait être ajouté au moment de l'incubation avec les anticorps secondaires - Après l'incubation de l'anticorps secondaire, Aspirer la solution et laver deux fois avec du DMEM / F-12. Ajouter DMEM préchauffé frais / F-12moyenne à chaque puits avant dernière capture d'image.
- Réglez le logiciel d'imagerie pour acquérir des images entières de puits de chaque puits en utilisant tous les trois paramètres de numérisation: contraste de phase, fluorescence verte et la fluorescence rouge. Créer des images à différents grossissements et créer des films en accéléré avec le logiciel pour surveiller la croissance et l'expression du marqueur. Utiliser le protocole du fabricant.
- En utilisant le logiciel d'analyse, d'évaluer la confluence du temps bien plus en contraste de phase et en unités fluorescentes vertes pour le BG01v / HOG reprogrammation.
- Surveillance Reprogrammation Intermédiaires Les marqueurs utilisant de surface cellulaire
- Surveiller les événements de reprogrammation à différents points de temps en sondant les plats de reprogrammation à différents points de temps avec des anticorps contre les cellules souches différents marqueurs positifs / négatifs afin de surveiller le processus de reprogrammation. cultures de la sonde tous les 2 à 3 jours selon la disponibilité des répétitions. Sonde les dis de reprogrammationhes au jour 19 à 21 à l'aide de la double stratégie de coloration pour identifier les colonies entièrement reprogrammées iPSC et colonies partiellement reprogrammés sur la base des motifs de coloration.
- Au point de temps souhaité, Aspirer le milieu de croissance normal à partir de chaque puits pour être sondé avec des anticorps pour les marqueurs de choix.
- Laver chaque puits une fois avec 2 ml de / F-12 DMEM préchauffé.
- Préparer des aliquotes de chacune des paires d'anticorps négatifs / positifs primaires dans 1 ml de DMEM / F-12 comme suit: SSEA4 conjugué au fluorophore fluorescente verte (1: 200), TRA-1-60 conjugué au fluorophore fluorescente verte (1: 50), Alkaline en direct Stain (1: 500), CD24 conjugué à un fluorophore fluorescente verte (1:50), B2M conjugué à un fluorophore fluorescente verte (1:50), EpCAM conjugué à un fluorophore fluorescente verte (01:50) , souris CD73 (1: 100) qui a été sondée avec un anticorps secondaire anti-souris conjugué à un fluorophore fluorescente verte (1: 500) et CD44 de rat (1:50), qui est sondé avecun anticorps secondaire anti-rat conjugué au fluorophore rouge fluorescent (1: 500). Ajouter les ml solutions 1 d'anticorps primaire à chaque puits correspondant. Incuber à 37 ° C pendant 45 min.
- Aspirer la solution d'anticorps primaire et laver deux fois avec le milieu / F12 préchauffé DMEM.
- Pour les anticorps non conjugués, passer à l'aide d'un procédé en 2 étapes, en préparant des solutions d'anticorps secondaires appropriés et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Confirmer que les anticorps secondaires sont les hôtes primaires et ne se croisent pas réagir. Effectuer les étapes de lavage supplémentaires comme décrit précédemment.
- Après tous les lavages appropriés, ajouter préchauffé DMEM / F-12 du milieu frais dans chaque puits avant dernière capture d'image.
- Capturez les images fluorescentes sous le filtre approprié à grossissement 100X en utilisant un microscope à fluorescence et d'analyser les images en utilisant le logiciel d'analyse disponibles.
5. Mesure de Reprogrammation Kinetics Utilisation de flux Cytometry
- Quantitative Kinetic Mesure de Reprogrammation en utilisant des anticorps de surface cellulaire
- Avant reprogrammation, mettre en place le nombre approprié d'expériences de reprogrammation pour chaque point de temps. Pour mesurer la cinétique de la reprogrammation pendant les 7 premiers jours de la reprogrammation, transductions individuels sont effectués pour chaque point de temps désiré. Pour les points de temps après Jour 7, ensemencer points de temps d'alimentation indépendants suffisants pour continuer à mesurer les événements de reprogrammation. Un seul puits d'une plaque de 6 puits donnera des quantités suffisantes de cellules pour effectuer une analyse de cytométrie en flux.
- Mesurer tous les points de temps de reprogrammation souhaitées à partir des puits individuels, car cela est un test de point final. Aspirer le fibroblaste moyen du puits désiré. Laver une fois avec D-PBS.
- Aspirer le lavage D-PBS. Ajouter 1 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,05% par rapport au puits à tester. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Après l'incubation, dissocimangé les cellules dans des cellules individuelles en rinçant la cellule suspension à 1 ml contre la surface du puits et transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. Utiliser 3 ml de D-PBS pour laver toutes les cellules restantes du puits et les ajouter à la 15 ml conique. Utiliser 10 ml de D-PBS supplémentaire afin de diluer la solution de cellules dans le tube conique.
- Centrifuger les cellules à 200 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de DMEM / F-12. Effectuer un comptage de cellules que nécessaire pour créer une suspension de cellules standard qui est inférieure à 1 x 10 6 cellules / ml.
- Préparer chaque aliquote de négatifs anticorps positifs / directement conjugués de choix dans 1 ml de DMEM / F-12 pour moins de 1 x 10 6 cellules / ml en utilisant les combinaisons suivantes: SSEA4 conjugués à un fluorophore fluorescente verte (1: 200) CD44 conjugué à PE-Cy5, ou CD44 conjugué à un fluorophore fluorescente verte et SSEA4 conjugué à une fluorescence rouge fluorophore Far-. Incuberles anticorps avec la suspension de cellules pendant 45 minutes à température ambiante.
- Aspirer la solution d'anticorps primaire et laver deux fois avec préchauffé DMEM / F-12.
- Aspirer le lavage final et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de D-PBS. Pipeter le contenu de chaque suspension dans des tubes de FACS individuels.
- En utilisant les contrôles négatifs appropriés (contrôles et non colorées isotypes), confirmer le profil et les tensions avant et dispersion latérale appropriée sur le cytomètre. Régler les tensions pour les fluorophores correspondants en fonction des paramètres de coloration initiale unique, de telle sorte que les fluorophores verts sont activés par le laser et les signaux acquis dans le canal BL1 bleu, tandis que du rouge lointain fluorophore fluorescent et PE-Cy5 fluorophore sont activés par le laser rouge et signaux acquis dans le canal RL1. Acquérir la population double teinté pour chaque point de temps.
- Analyser les fichiers FCS pour chaque point de temps à l'aide du logiciel d'analyse approprié et utiliser l'éditeur pour Arradonnées nge pour observer le changement d'expression de la population au fil du temps.
- Suivre les étapes 5.1.1 à 5.1.6, si un tri cellulaire est souhaitée à des moments différents. Utiliser les combinaisons de fluorophores appropriés en fonction de la configuration du laser du trieur de cellules à utiliser.
- Après le dernier lavage, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de tampon de tri cellulaire. Mettre en place la trieuse de cellules pour les réglages appropriés de l'avant et de dispersion de côté à l'aide d'un témoin non coloré. Utilisez les commandes tachées simples à mettre en place les paramètres appropriés pour chaque fluorophore.
- Utilisez un petit échantillon de la suspension à double tachée cellule; sélectionner les 2 populations à trier et attribuer la charge respective pour assurer une bonne collecte des cellules triées.
- Ajouter 200 ul de milieu de récupération des cellules dans les tubes de collecte pour faire en sorte que la suspension de cellules triées est amorti et protégé au moment du tri. Récolter le nombre de désir de cellules et transférer sur de nouveaux plats Imef contenant fraîchely préparé milieu de récupération.
- Changer le milieu après une incubation pendant une nuit avec le milieu de récupération. Les cultures doivent ensuite être nourris et régulièrement repiquées en utilisant un milieu HPSC contenant Pénicilline / streptomycine (100 unités / ml de concentration finale).
6. Analyse Endpoint
- Terminal phosphatase alcaline (AP) Coloration
- Utilisez la borne coloration AP chromogène pour corréler des événements cinétiques et morphologiques observés avec des rendements de reprogrammation finale.
- Après 21 jours de reprogrammation, retirer le milieu de culture du puits à colorer avec le terminal tache AP et laver une fois avec 200 mM Tris-HCl (pH 8,0).
- Préparer la quantité appropriée de solution de coloration comme dirigé par le manuel du fabricant dans 200 mM Tris-HCl.
- Aspirer le lavage et ajouter 2 ml de la solution de coloration prête à chaque puits. Incuber pendant 20 à 30 min à température ambiante et à l'abri de l'ee lumière.
- Aspirer la solution de coloration et laver une fois avec du Tris HCl 200 mM. Retirez le lavage et ajouter de l'eau distillée avant la visualisation.
- Capture du signal colorimétrique en utilisant une caméra d'image normale. Compter le nombre de colonies colorées positivement à la main. Visualisez la tache en utilisant une analyse fluorescente dans le canal Trit-C, que la tache est également fluorescent dans la nature et d'effectuer l'imagerie entier bien et analysées à l'aide de l'imageur entier ainsi. Utiliser le protocole du fabricant.
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Representative Results
Surveillance Kinetics Reprogrammation par cytométrie en flux
CD44 est un marqueur de fibroblaste alors SSEA4 est un marqueur PSC 6,10. Comme prévu à partir de ce modèle d'expression, par cytométrie de flux de fibroblastes BJ montre un SSEA4 - CD44 + population qui facilite la création de portes quadrants en combinaison avec l'échantillon souillures. Au cours de reprogrammation des fibroblastes DF1 avec les virus Sendai, CD44 est progressivement perdu tout SSEA4 lentement exprimé. Au jour 3 après transduction avec les virus Sendai, il y a une grande population de SSEA4 - cellules CD44 + et une petite population de SSEA4 + CD44 + cellules qui devient plus distincte à Jour 7 (Figure 1). Au jour 13, la population double positif transitions vers le SSEA4 + CD44 - État. By Day 17, un grand pourcentage de la CElls en culture sont déjà SSEA4 + CD44 -. Cette fois, cours montre que la cytométrie de flux avec CD44 et SSEA4 peuvent être utilisés pour surveiller la progression et le taux de reprogrammation.
Une comparaison quantitative confirme que la reprogrammation des fibroblastes BJ avec des virus de reprogrammation Sendai génère SSEA4 + CD44 - cellules à un taux différent de reprogrammation de BJ Fibroblastes (Figure 2A). Les données démontrent qu'une comparaison rapide du pourcentage de SSEA4 + CD44 CFP-like - cellules suit la progression de la reprogrammation. Fait intéressant, au jour 8 de fibroblaste DF1 reprogrammation, le tri et la mise en culture séparément de la population de cellules qui sont en train de réguler à la hausse et la régulation négative de CD44 SSEA4 génère AP + colonies 11 (figure 2B). En revanche, l'origine SSEA4 - population CD44 + génère hette plus petit nombre d'AP + colonies au jour 21 de la reprogrammation, qui est la journée typique de l' analyse finale de la colonie. Cela donne à penser qu'il est possible de quantifier et de comparer la population de transition afin de prédire les différences de cinétique de reprogrammation avant même le SSEA4 + CD44 - population est formée. Un point important à noter ici est que la reprogrammation est un processus variable dépendante de plusieurs facteurs tels que le démarrage population de cellules somatiques, l' efficacité de la transduction, moyenne, etc. Cependant , le schéma général et la progression des marqueurs de surface décrits ci - dessus sont compatibles entre les différentes expériences de reprogrammation et à partir de fibroblastes. L'analyse de la cinétique de reprogrammation peut également être effectuée avec différents marqueurs, tels que les marqueurs négatifs nouvellement identifiés de la CFP CD73 et B2M 6, ainsi que les marqueurs CD24 PSC établis 12,13 et 14,15 EpCAM. Semblable à CD44, CD73 et B2M sont exprimés en parfibroblastes ental BJ, mais sont downregulated au cours de reprogrammation, devenant indétectable dans CSPi entièrement reprogrammées (Figure 3A). Un flux cytométrie cours du temps en utilisant CD44 et CD73 ou CD44 et B2M montre que CD44 et CD73 sont downregulated à un taux similaire, alors que B2M est downregulated plus rapide que CD44 (figure 3B). Dans les deux cas, le taux de reprogrammation peut être observée en mesurant l'accumulation de la population double négation. Contrairement à ces marqueurs négatifs de la CFP, et CD24 sont absentes EpCAM dans des fibroblastes et sont exprimés en iPSCs (figure 3A). Dans un flux cytométrie cours du temps, CD24 - CD44 + et EpCAM - CD44 + fibroblastes forment éventuellement populations doubles négatives que la transition plus tard en CD24 + CD44 - et EpCAM + CD44 - cellules PSC-like, respectivement (figure 3B). Ainsi, lors de la reprogrammation, les deux marqueurs positifs de la CFPsont exprimés après CD44 est downregulated. Semblable à ce qui a été observé avec SSEA4 et CD44, la formation et l'accumulation des différentes populations de cellules indiquent la progression de la reprogrammation.
Suivi Reprogrammation Utilisation en temps réel Analyse d'imagerie
Imagerie en temps réel de la reprogrammation de cultures après réensemencement montre la formation progressive des colonies (figure 4A), ce qui correspond à une augmentation logarithmique de confluence sous contraste de phase (figure 4B). Confluence sous contraste de phase fournit donc une autre mesure pour la surveillance de la reprogrammation quantitativement, mais il englobe à la fois, les colonies qui sont positives pour les marqueurs de la CFP et la prolifération continue des cellules unreprogrammed ou partiellement reprogrammées (figure 4A, dernier panneau). Quantifier les zones qui ont été colorées pour les marqueurs de pluripotenceTRA-1-60, SSEA4 et AP 6,10 au Jour 21 indique que CSPi ne représentent que moins de la moitié de la confluence totale (figure 4B). Pour mesurer les progrès de la reprogrammation plus stricte, il est possible d'utiliser une ligne de reporter pour la reprogrammation. Ici, les fibroblastes secondaires ont été générés à partir de la ligne BG01v / HOG ESC, qui a été conçu avec un journaliste OCT4-GFP 16. GFP est exprimée en tant que cellules sont reprogrammés et des colonies sont formées (figure 5A). Confluence de mesure en contraste de phase et les canaux vert montre que la confluence de la GFP augmente plus lentement que la confluence totale, et la confluence de la GFP au jour 19 est inférieure à la moitié de la confluence totale (figure 5B), qui rappelle TRA-1-60, SSEA4 et AP coloration au jour 21.
Figure 1. Monitoring le Progrès de Reprogrammation cytométrie en flux. Parcelles de cytométrie en flux Dot pour DF1 Fibroblastes reprogrammée avec Sendai virus dans des conditions exemptes d' engraissement. Les cellules ont été récoltées et colorées avec des anticorps SSEA4 et CD44 à des intervalles différents de Jour 3 (D3) à Jour 19 (D19) du processus de reprogrammation. Cultures à Jour 9 (D9) partir ont été analysés après que les cellules ont été réensemencées au jour 7 (D7). Dot parcelles montrent 8.000 singulets. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2. Évaluation Reprogrammation Cinétique et efficacité dans des conditions exemptes d'engraissement (A) Graphique montrant l' évolution du pourcentage de SSEA4 + CD44 - cellules reprogrammées après transduction DF1 fibroblasts et les fibroblastes BJ avec les virus Sendai. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux au jour 3 à 19 post-transduction, avec des cultures à Jour 9 subissant partir de réensemencement au jour 7. (B) Pseudo-couleur de cytométrie en flux parcelles pour les cellules DF1 transduites virus Sendai et colorées avec des anticorps SSEA4 et CD44. SSEA4 -. CD44 + cellules (cercle noir) et SSEA4 + cellules (cercle rouge) ont été triés au Jour 8 et a permis de croître jusqu'à ce jour 19 avant la coloration de la phosphatase alcaline (rouge) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Constatant Reprogrammation Kinetics des cultures libres Feeder-Utilisation des marqueurs de la CFP positives et négatives différentes. (AD) coloration en directdes cultures Day-18 DF1 dérivés reprogrammation en utilisant des anticorps pour les marqueurs de la CFP positives CD24 et EpCAM et marqueurs CFP négatifs CD44, CD73 et B2M. Les panneaux supérieurs rejoignent les canaux de fluorescence verte et rouge, tandis que les panneaux de fond comprennent également l'image de contraste de phase. La barre d'échelle représente 200 um. (E) par cytométrie de flux tracés de points pour les cultures de reprogrammation DF1 dérivées récoltées et colorées en utilisant les mêmes marqueurs de Jour 9 à 17 (D9 à D17) post-transduction. Avant l'analyse, les cultures ont été réensemencées au jour 7. parcelles Dot montrent 8.000 singulets. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Suivi Reprogrammation Kinetics par mesure Confluence totale. (A) en temps réel iforgemagie de BJ fibroblastes reprogrammés avec des virus Sendai dans des conditions sans alimentation. images de contraste de phase des mêmes colonies ont été prises au jour 7 à 19, puis à 21 jours avec une coloration supplémentaire pour CD44 et SSEA4, TRA-1-60 ou AP. La barre d'échelle correspond à 400 um. (B) Quantification de la confluence totale (contraste de phase) que reprogrammation progresse de réensemencement au jour 7 au jour 21. confluence totale au Jour 21 est comparé à SSEA4, TRA-1-60 et AP signal de confluence ( canal vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Évaluation Reprogrammation Kinetics par mesure OCT4-GFP Confluence. (A) l' imagerie en temps réel des fibroblastes BG01v / HOG CSEh dérivées reprogrammées avecSendai virus dans des conditions sans alimentation. Le contraste de phase, la fluorescence verte et a fusionné les images des mêmes colonies ont été générées au jour 7 à 19. Barre d' échelle correspond à 400 um. (B) Quantification de la confluence totale (contraste de phase) et OCT4-GFP confluence (canal vert) que la reprogrammation progresse de réensemencement au jour 7 au jour 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Disclosures
Tous les auteurs [RHQ, JSTA, KS, et UL] sont des employés de Thermo Fisher Scientific, qui produit certains des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Tchad MacArthur pour des discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
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