Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54190
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Life Sciences Solutions, Thermo Fisher Scientific

Summary

Протокол, представленные в данном исследовании, описаны способы мониторинга в реальном времени прогрессии перепрограммирования через кинетический измерения положительных и отрицательных маркеров плюрипотентных стволовых клеток с использованием проточной цитометрии. Протокол также включает в себя оценку формирования изображения на основе морфологии и маркер или экспрессии репортера во время генерации иПСК.

Introduction

Пациент полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются перспективными инструментами для клеточной терапии и скрининга лекарств. Они обеспечивают аутологичной источник клеток для терапии. Кроме того, они охватывают очень широкий набор генетического происхождения, что позволяет детальный анализ в пробирке генетических заболеваний за то , что в настоящее время эмбриональных стволовых клеток (ESC) линии позволили бы. Последние достижения привели к разработке нескольких методов генерации ИПСК, включая перепрограммирование с вирусом Сендай, эписомная плазмид или мРНК в 1,2 раза . Следует отметить, что различные методы перепрограммирования связаны с различными уровнями эффективности и безопасности, а также, вероятно, отличаются другими способами, которые влияют на их пригодность для различных областей применения. При наличии множества перепрограммирования технологий, стало важно разработать методы для оценки процесса перепрограммирования. Большинство существующих методов полагаются на качественной проверке морфологии или окрашиванияс сотовыми специфических красителей стволовых и антител. Один недавно разработанный метод использует лентивирусов репортеров флуоресценции, которые чувствительны к PSC конкретных микроРНК или дифференцированных клеток специфических мРНК 3. Такие методы мониторинга облегчают выбор и оптимизация методов перепрограммирования для различных ситуаций. Например, CDy1 был использован в качестве флуоресцентного зонда для ранних ИПСК для того , чтобы на экране для перепрограммирования модуляторов 4. Способность наблюдать и сравнивать различные эксперименты на перепрограммирование также имеет важное значение для достижения лучшего понимания самого процесса. Например, в настоящее время известно , что некоторые типы клеток соматические легче перепрограммировать , чем другие 5, и что клетки проходят через промежуточные состояния во время перепрограммирования 6-8. К сожалению, механизмы, лежащие в основе процесса перепрограммирования до сих пор полностью не поняты и, следовательно, точные различия между методами перепрограммирования также остаются быть defined. Таким образом, методы мониторинга, оценки и сравнения перепрограммирования события продолжают иметь решающее значение для поля стволовых клеток.

Методы, описанные в данном протоколе разрешают мониторинг и оценку процесса перепрограммирования и иллюстрации того, как эти методы могут быть использованы для сравнения различных наборов реагентов перепрограммирование. Первый подход включает в себя анализ методом проточной цитометрии с использованием комбинации антител против положительного и отрицательного плюрипотентных стволовых клеток (PSC) маркеров. Второй подход пары в реальном времени визуализации и измерения общего слияния (процент площади поверхности, покрытой клетками) и слияния габаритных сигналов (процент площади поверхности, покрытой флуоресцентных сигналов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.Solution и среднего Приготовление

  1. Базальная мембрана Матрица (Очищенная от Engelbreth-Holm-Swarm Опухоли)
    1. Медленно разморозить матрицу базальной мембраны (5 мл) на льду при температуре 4 ° С в течение ночи.
    2. Разбавляют исходный раствор 1: 1 с 5 мл охлажденного льдом, стерильной среде DMEM / F-12 среду, в стерильной, предварительно охлажденным 15 мл коническую трубку. Разливают аликвот в предварительно охлажденные, 1,5 мл стерильной микро центрифужные пробирки и немедленно хранить при -20 ° С.
    3. Перед использованием, разморозить замороженную 1: 1 базальной мембраны матрицы аликвоты в течение ночи при температуре 4 ° С. Во время использования, дополнительно разбавить 1: 1 аликвоты еще 50 раз с ледяной, стерильной среде DMEM / F-12 среду, в конечном разведении 1: 100.
    4. Добавьте соответствующее количество 1: раствор мембранной матрицы 100 разбавленный подвального к соответствующей культуре тканей (ТС) сосудов и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Как правило, используют 3 мл разбавленного раствора базальной мембраной матрицы для нанесения покрытия на ТС блюдо Oе 20 см 2 площадь поверхности, покрытие все другие виды блюд TC / пластины в соотношении 0,15 мл разбавленного матрицы на см 2 площади поверхности. Аспирируйте оставшийся раствор перед добавлением любой культуральной среды и клеток.
  2. Фибробласт Средний
    1. Оттепель 100 мл бутылку ES Квалифицированным эмбриональная бычья сыворотка (ES-FBS) при 4 ° С в течение ночи.
    2. Добавьте 50 мл талой ES-FBS и 5 мл MEM Non-незаменимую аминокислоту Solution (1x) до 445 мл DMEM среды. Стерилизация объединенные компоненты через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и хранить среду при температуре 4 ° С в течение до 4 недель.
  3. КПКО Средний
    1. Оттепель 100 мл бутылку ES-FBS при 4 ° С в течение ночи.
    2. Добавьте 50 мл размороженной FBS, 5 мл MEM несущественных аминокислот раствором (1x), и 500 мкл 2-меркаптоэтанола до 445 мл DMEM среды.
    3. Стерилизация объединенные компоненты через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и хранить меняDIUM при 4 ° С в течение до 4 недель.
  4. Основной фактор роста фибробластов раствор (B-FGF)
    1. Добавьте 10 мкл сыворотки Замена 990 мкл D-PBS и тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    2. Добавляют 1 мл 1% (об / об) раствора Serum Replacement на один флакон 10 мкг лиофилизированного б-FGF. Тщательно перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз.
    3. Алиготе 10 мкг / мл B-FGF раствора в 200 мкл аликвоты в микро-центрифужные пробирки и хранят при -20 ° С до тех пор, пока требуется до 4-х недель.
  5. Человек плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) Средний
    1. Оттепель 100 мл флакон сывороточных Replacement при 4 ° С в течение ночи.
    2. Добавляют 100 мл талой Serum Replacement, 5 мл MEM Non-незаменимую аминокислоту Solution (1x), и 500 мкл 2-меркаптоэтанола до 395 мл DMEM / F-12 среды.
    3. Стерилизация объединенные компоненты через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и хранить среду в4 ° C в течение 4 недель.
    4. Во время использования, предварительно подогреть среду HPSC до 37 ° С и добавка с 4 нг / мл bFGF.
  6. КПКО - кондиционированной среды (КС)
    1. Добавить 18 мл 0,1% желатина в колбу Т-175 культуры и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Удалите 0,1% раствора желатина после одного часа инкубации. Добавить 9,1 х 10 6 митотически-инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (КПКО) , в 45 мл среды и КПКО инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
    3. После инкубации в течение ночи, удалить старую КПКО средних и мыть один раз с помощью 25 мл D-PBS в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Отберите от D-PBS промыть и добавить 90 мл подогретого среды HPSC, дополненное 4 нг / мл bFGF. Выдержите в 37 ° C инкубаторе в течение ровно 24 часов.
    5. После 24 ч инкубации в асептических удалить среду HPSC из колбы и КПКО стерилизовать через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Алиготе в 50 мл конические пробирки и заморозить при -20 ° C до тех пор, пока это необходимо. КПКО CM может храниться до 6 месяцев при -20 ° C.
    6. Добавить еще 90 мл подогретого среды HPSC с добавлением 4 нг / мл bFGF в КПКО колбу. Выдержите в 37 ° C инкубаторе в течение ровно 24 часов. Повторите заготовки КМ на срок до 7 дней.
    7. Во время использования, предварительно подогреть КПКО-CM до 37 ° С и добавка с 4 нг / мл bFGF.
  7. E8 Средний
    1. Оттепель добавки 10 мл E8 при 4 ° С в течение ночи.
    2. Удалить 10 мл базальной среды Е8 и асептически добавить содержимое размороженного E8 дополнение к оставшейся базальной среде. Тщательно перемешать и стерилизовать через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Хранить полную среду при 4 ° С в течение до 2-х недель.
    3. Во время использования, предварительно подогреть аликвота среды для использования до комнатной температуры. Не рекомендуется предварительно теплой E8 средней до 37 ° С.
  8. Cell Такrting буфера
    1. Приготовьте свежий буфер сортировочную прямо перед сортировкой клеток путем добавления раствора ЭДТА (1 конечная концентрация мМ), буфер HEPES (25 мМ конечной концентрации), раствор пенициллина / стрептомицина (100 ед / мл конечной концентрации) и бычьего сывороточного альбумина (1% конечная концентрация) в Дульбекко фосфатно-солевом буферном (кальций и магний свободный).
    2. Стерилизовать буфер через фильтр 0,22 мкм до начала использования.
  9. Сортировки клеток восстановления Средний
    1. Изменение 50 мл фибробласта среды путем добавления пенициллина / стрептомицина (100 ед / мл, конечная концентрация) и Rock Ингибитор Y-27632 (10 мкМ конечной концентрации). Предварительно нагреть эту среду до 37 ° С перед посевом отсортированные клетки.

2. Сендай опосредованного Перепрограммирование фибробласты человека

  1. 24 часа в сутки до трансдукции с вирусами Сендай, семена фибробласты при плотности 2 × 10 5 Cгезов на лунку в желаемые лунки TC пластины 6-луночного.
  2. Выполните трансдукции в день 0 следующим образом.
    1. Предварительно теплые 2 мл фибробласта среды в водяной бане 37 ° C. Удалить один набор вирусных трубок Сендай от -80 ° C хранения и оттаивать каждую пробирку по одному за раз, сначала погрузить нижнюю часть трубы в 37 ° С на водяной бане в течение 5 - 10 секунд, а затем вынуть трубку из воды ванны и дайте ему оттаять при комнатной температуре. После оттаивания, кратко центрифуге трубки и поместить его сразу на льду.
    2. Использование коммерчески второго поколения Сэндай вирусов путем добавления соответствующих объемов (в соответствии с КСХ) для каждой из трубок, с тем, чтобы достичь следующих множественность инфекции (MOI) до 1 мл подогретого фибробластов среды на лунку, чтобы быть трансдуцированных, как следовать : KOS = 5 × 10 6 CIU, Нс-Мус = 5 × 10 6 CIU, hKlf4 = 3 × 10 6 CIU.
    3. Тщательно перемешать вирусного раствора с помощью пипетки смесь осторожно вверх и вниз. Комплексыт.е следующий шаг в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте фибробласт среды из скважины фибробластов перепрограммировать, и добавьте 1 мл вирусного раствора в каждую лунку. Поместите клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора и инкубировать в течение ночи.
  3. После инкубации в течение ночи, аспирация от трансдукции среды и утилизации старой среды должным образом (10% раствор хлорной извести в течение 30 мин). Заменить 2 мл подогретого фибробластов среды и продолжают культуры трансдуцированных клеток.
  4. Культуры клеток для более 6 дней, заменяя старую среду свежей среды фибробластов каждый день.
    Примечание: Не пассажа перепрограммировать клетки до 7 дней не оставлять трансдукции.
  5. День 6: готовить блюда для иПСК поколения
    1. Для фидерной-зависимого поколения иПСК, добавляют 1,5 мл 0,1% -ного раствора желатина в каждую лунку 6-луночных культуральных тканей (ТС) Петри и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
    2. Удалите 0,1% желатин, таклюция после 1 часа инкубации. Добавить 3 х 10 5 митотически-инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (КПКО) , в 2 мл среды на КПКО лунку и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
    3. Для фидер-независимое поколение иПСК, добавляют 1,5 мл разведенной матрицы базальной мембраны (разведение 1: 100) в каждую лунку 6-луночных культуральных тканей (ТС) Петри и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
  6. Через семь дней после того, как трансдукции, урожай трансдуцированных фибробластах и ​​повторно пластинчатые их на готовых блюд культуры для производства колоний иПСК.
    1. Аспирируйте от нормальной культуральной среды от фибробластов, и промыть клетки один раз с 2 мл D-PBS.
    2. Отберите от D-PBS вымыть и добавить 0,5 мл подогретого 0,05% трипсина / ЭДТА. Инкубируйте клетки в течение 3 - 5 мин при 37 ° С.
    3. Когда клетки округляется, добавляют 2 мл подогретого среды фибробластов в каждую лунку, чтобы остановить трипсинизации. Выбить клетки из колодца, осторожно пипеткой тон средний по всей поверхности тарелки. Сбор клеточной суспензии в 15 мл коническую центрифужную пробирку.
    4. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клетки в 2 мл свежей, подогретого Фибробласт Medium.
    5. Граф клеток с использованием желаемого способа (гемоцитометра или автоматического счетчика клеток) и семенем заранее подготовленные культуральные чашки с 5 х 10 4 клеток для фидерных зависящих от условий и 1 × 10 5 клеток для фидерной независимых условий, на лунку 6 -Ну блюдо и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение ночи.
    6. После инкубации в течение ночи, изменения носителя HPSC среды, Е8 среды или КПКО-кондиционированной среды, в зависимости от применения. Замените старую среду со свежей средой каждый день после этого.

3. Сендай перепрограммирования BGO1v hOct4-GFP репортер эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) Производный Вторичные Фибробласты

  1. Derив вторичные фибробласты человека от репортера чЭСК линии BG01v hOct4-GFP в соответствии с процедурой , описанной ранее 9.
  2. За два дня до трансдукции, плиты BGO1v / Hog получены фибробласты на две лунки 6-луночного планшета на 2 - х 10 5 клеток на лунку, используя Medium фибробластов.
    1. В день трансдукции, предварительно теплых 2 мл фибробласта среды до 37 ° С.
    2. Удалить один комплект Сендай трубок от -80 ° C хранения. Удалить флаконах из мешочка и оттаивать каждую пробирку по одному за раз, сначала погрузив нижнюю часть трубки в водяной бане при 37 ° C в течение 5 - 10 секунд, после чего, позволяют трубы оттаивают при комнатной температуре. После оттаивания, кратко центрифуге трубки и поместить его сразу на льду.
    3. Добавьте указанные объемы каждой из трех трубок Сендай (см CoA для нужного объема) до 2 мл фибробласта среды, предварительно нагретый до 37 ° С и тщательно перемешать вирусного раствора с помощью пипетки вверх и вниз. Выполните следующую Steр в течение 5 мин.
      Примечание: Для этого эксперимента множественности заражения 5: 5: 6 был использован.
    4. Аспирируйте фибробласт среды из скважин фибробластов быть трансдуцированная. Добавить 1 мл суспензии вируса в каждую из двух скважин, которые будут трансдуцированная. Поместите клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора и инкубировать в течение ночи.
    5. После инкубации в течение ночи, удалите трансдукции среду и утилизировать его должным образом (10% раствор хлорной извести в течение 30 мин). Заменить каждую лунку по 2 мл подогретого среды и фибробластов продолжают культуры трансдуцированных клеток.
  3. Культуры клеток для более 6 дней, меняя старую среду свежей среды фибробластов каждый день.
    1. Семь дней после трансдукции, урожай трансдуцированных фибробластах и ​​повторно пластинчатые их на готовых блюд культуры для производства колоний иПСК.
    2. Аспирируйте от нормальной культуральной среды от фибробластов, и промыть клетки один раз с 2 мл D-PBS.
    3. Аспирируйте от ДПBS помыть и добавить 0,5 мл подогретого 0,05% трипсина / ЭДТА. Инкубируйте клетки в течение 3 - 5 мин при 37 ° С.
    4. Когда клетки округляется, добавляют 2 мл подогретого среды фибробластов в каждую лунку, чтобы остановить трипсинизации. Выбивать клетки из лунки осторожно пипеткой среду по всей поверхности тарелки. Сбор клеточной суспензии в 15 мл коническую центрифужную пробирку.
    5. Центрифуга клетки при 200 х г в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клетки в подходящем количестве свежей, предварительно подогретой среде фибробластов.
    6. Граф клеток с использованием желаемого способа (гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток).
    7. Семенной трансдуцированных клеток при плотности 1 х 10 5 клеток на лунку матрицы базальной мембраны -покрытие 6-луночного планшета и инкубировать в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение ночи.
  4. После инкубации в течение ночи, изменения носителя, КПКО кондиционированной средой, дополненной 10 нг / мл б-FGF. Замените старую среду со свежим каждый день КПКО CM после этого.
  5. Три недели после трансдукции, механически рассекают и передавать требуемые колонии для клональной экспансии или использовать для анализа.

4. Живая изображений сотовый фибробласта Перепрограммирование

  1. Мониторинг в режиме реального времени
    1. Через 7 дней после трансдукции с комплектом перепрограммирования Сендай, семена желаемого количества клеток на 6-луночных планшетах с желаемыми средних и матричных систем, как описано ранее. Поместите затравочный посуду внутри томографа, расположенного в увлажненном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2.
    2. Установите программу обработки изображений, чтобы захватить целые а образы каждой отдельной скважины с заданным интервалом (каждые 6 - 8 ч) непрерывного захвата изображения в течение следующих 14 дней в соответствии с протоколом производителя.
      Примечание: настройки фазового контраста изображения выбраны для нормального перепрограммирования для оценки прогрессирования колонии. В случаеиз BG01v / Hog происходит перепрограммирование фибробластов, то лучше всего для захвата изображений в фазового контраста и зеленого флуоресцентного канала в качестве повторной активации эндогенного OCT4-GFP репортер может быть отслежена на протяжении всего процесса перепрограммирования.
    3. Изменение носителя ежедневно, это может быть HPSC среда, Е8 среда, или КПКО-СМ, в зависимости от эксперимента, как описано ранее, с 8-й день до 21 после трансдукции. Скважины могут быть дополнительно проанализированы для формирования колоний с использованием непрямой иммунофлуоресценции.
    4. По окончании эксперимента на 19 день до 21, удалить культуральной среды из каждой лунки, чтобы быть зондировали антителами на фибробластах и ​​стволовых клеточных маркеров выбора.
    5. Промыть каждую лунку один раз с 2 мл подогретого DMEM / F-12 среды.
    6. Подготовка аликвоты каждого положительных / отрицательных пар первичных антител в 1 мл DMEM / F-12 среды, следующим образом: анти-мыши SSEA4 (1: 200) и анти-CD44 крысы (1:50), анти-мышиного TRA-1- 60 (1: 200) и анти-CD44 крысы (1:50), и щелочной фосфатазы Liве Stain (1:50) и анти-CD44 крысы (1:50). Добавьте мл растворов 1 первичного антитела к каждому из которых соответствует хорошо. Инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
    7. Аспирируйте от раствора первичного антитела и дважды промывают предварительно нагретый DMEM / F-12 среды.
    8. Готовят растворы вторичные антитела (1 мл в каждую лунку) с использованием козьего анти-мышь Alexa Fluor 488 конъюгированный вторичный (1: 500) для зеленой флуоресценции и козы против крыс Alexa Fluor 594 конъюгированный вторичный (1: 500) для красной флуоресценции в DMEM / F-12, среда. Добавить в каждую лунку после окончательной промывки. Инкубируйте вторичными антителами в течение 30 мин при 37 ° С.
      Примечание: Из-за щелочной фосфатазы Живой Stain (в) APL-переходного сигнала, первичный инкубационный анти-CD44, сначала должны быть выполнены самостоятельно и APLS должен быть добавлен во время инкубации с вторичными антителами
    9. После вторичной инкубации антитела, аспирация раствор и дважды промывают DMEM / F-12 среды. Добавить свежий предварительно нагретый DMEM / F-12,среда в каждую лунку до окончательного захвата изображения.
    10. Установите программное обеспечение Imager приобретать целые а образы каждой лунки, используя все три параметра сканирования: фазового контраста, зеленой флуоресценции и красной флуоресценции. Создание изображений в различных увеличениях и создавать покадровой фильмы с программным обеспечением для контроля роста и экспрессии маркера. Используйте протокол производителя.
    11. Использование программного обеспечения для анализа, оценки слияния хорошо с течением времени в фазового контраста и в зеленых флуоресцентных единицах для / Hog перепрограммирования BG01v.
  2. Мониторинг перепрограммирования с использованием промежуточных соединений маркеров клеточной поверхности
    1. Монитор перепрограммирования события в различные моменты времени, исследуя перепрограммирования блюда в различные моменты времени с антителами против различных стволовых клеток положительных / отрицательных маркеров для того, чтобы контролировать процесс перепрограммирования. Probe культуры каждые 2 до 3 дней в зависимости от наличия повторах. Зонд перепрограммирования дисГЭС на 19-й день до 21, используя двойную стратегию окрашивания, чтобы определить полностью перепрограммирован колонии IPSC и частично перепрограммирован колоний на основе моделей окрашивания.
    2. В желаемый момент времени, аспирация от обычной ростовой среды из каждой лунки быть зондировали антителами для маркеров выбора.
    3. Промыть каждую лунку один раз с 2 мл подогретого DMEM / F-12 среды.
    4. Подготовка аликвоты каждого положительных / отрицательных пар первичных антител в 1 мл DMEM / F-12 среды, следующим образом: SSEA4, конъюгированный с зеленым флуоресцентным флуорофора (1: 200), TRA-1-60, конъюгированный с зеленым флуоресцентным флуорофора (1: 50), щелочная Живая Пятно (1: 500), CD24, конъюгированного с зеленым флуоресцентным флуорофором (1:50), В2т, конъюгированных с зеленым флуоресцентным флуорофором (1:50), EpCAM, конъюгированных с зеленым флуоресцентным флуорофором (1:50) , мыши CD73 (1: 100), которые зондировали с антителом против мышиного вторичного антитела, конъюгированного с зеленым флуоресцентным флуорофора (1: 500), и крысы CD44 (1:50), который зондируютанти-крысиного вторичное антитело, конъюгированное с красной флуоресцентной флуорофора (1: 500). Добавьте мл растворов 1 первичного антитела к каждому из которых соответствует хорошо. Инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
    5. Аспирируйте от раствора первичного антитела и дважды промывают предварительно нагретую DMEM / F12 среде.
    6. Для получения неконъюгированных антител, перейти к с использованием метода 2-ступенчатую путем подготовки соответствующих решений вторичными антителами и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С. Убедитесь, что вторичные антитела являются первичными хозяевами и не перекрестно реагируют. Выполните дополнительные шаги стирки, как описано выше.
    7. После того, как все соответствующие стирок, добавить свежий предварительно подогретый DMEM / F-12 среду, в каждую лунку до окончательного захвата изображения.
    8. Захват флуоресцентные изображения под соответствующим фильтром при 100-кратном увеличении с помощью флуоресцентного микроскопа и анализа изображений с помощью доступного программного обеспечения для анализа.

5. Измерение перепрограммирования Kinetics Использование Flow Cytometry

  1. Количественный Кинетическая Измерение перепрограммирования с использованием клеточной поверхности антител
    1. Перед перепрограммированием, установить необходимое количество перепрограммирования экспериментов для каждой временной точки. Для измерения кинетики перепрограммировании в течение первых 7 дней перепрограммирования, отдельные каскадов, выполняются для каждого желаемый момент времени. В моменты времени после 7-го дня, семян достаточное количество фидерных независимые моменты времени продолжать измерять перепрограммирования события. Одна лунка 6-луночного планшета даст достаточное количество клеток для проведения анализа потока цитометрии.
    2. Измерьте все желаемые перепрограммирование временные точки из отдельных скважин, так как это является анализ конечной точки. Аспирируйте от фибробласт среды от желаемого хорошо. Промывают один раз D-PBS.
    3. Аспирируйте от промывки D-PBS. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА в лунку для тестирования. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. После инкубации dissociели клетки на отдельные клетки путем промывки клеточной суспензии 1 мл против поверхности скважины и передавать суспензии в 15 мл коническую пробирку. Используйте 3 мл D-PBS, чтобы смыть все оставшиеся клетки из колодца и добавить их в 15 мл коническую. Используйте 10 мл дополнительного D-PBS для дальнейшего разбавления раствора клеток в конической трубе.
    5. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл DMEM / F-12 среды. Выполнить подсчет клеток по мере необходимости для создания стандартной клеточной суспензии , которая составляет менее 1 × 10 6 клеток / мл.
    6. Готовят каждую аликвоту положительных / отрицательных непосредственно конъюгированных антител выбора в 1 мл DMEM / F-12 среды для менее 1 × 10 6 клеток / мл с использованием следующих комбинаций: SSEA4 , конъюгированных с зеленым флуоресцентным флуорофора (1: 200) с CD44, конъюгированного с PE-Су5 или CD44, конъюгированный с зеленым флуоресцентным флуорофора и SSEA4 конъюгированного с красной флуоресцирующей дальнем флуорофора. высиживатьантитела с клеточной суспензии в течение 45 мин при комнатной температуре.
    7. Аспирируйте раствор первичного антитела и дважды моют с предварительно подогретой среде DMEM / F-12 среды.
    8. Аспирируйте окончательной промывки и вновь приостановить осадок клеток в 1 мл D-PBS. Пипеткой содержание каждой суспензии в отдельных FACS труб.
    9. С помощью соответствующих отрицательных контролей (неокрашенные и изотипу контроля), подтверждения правильности вперед и бокового рассеяния профиль и напряжения на цитометр. Установка напряжения для соответствующих флуорофоров в соответствии с начальными одиночными параметрами пятна, например, что зеленые флуорофоры активируются синим лазером и сигналов, полученных в канале BL1, в то время как далеко красный флуоресцирующий флуорофор и PE-Cy5 флуорофора активируются красным лазером и сигналы, полученные в канале RL1. Приобретать двойного окрашивают населения для каждой временной точки.
    10. Анализировать файлы FCS для каждого момента времени с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа и использовать редактор для ARRAДанные NGe для наблюдения выражение населения сдвиг с течением времени.
    11. Выполните шаги 5.1.1 5.1.6, если сортировки клеток желательно в различные моменты времени. Используйте соответствующие флуорофором комбинации в соответствии с конфигурацией лазерного клеточного сортировщик, который будет использоваться.
    12. После последней промывки, вновь приостановить осадок клеток в 1 мл буфера сортировки клеток. Настройка сортировщика ячейки до правильные настройки передней и боковой разброс с помощью неокрашенной управления. Одиночные запятнанные управления, чтобы настроить соответствующие параметры для каждого флуорофора.
    13. Используйте небольшой образец суспензии двойного окрашенных клеток; выбрать 2 группы населения, которые будут сортироваться и назначить соответствующий заряд для обеспечения надлежащего сбора отсортированных клеток.
    14. Добавьте 200 мкл восстановления клеток среды в приборке, чтобы гарантировать, что отсортирован клеточную суспензию подкладкой и защищена во время сортировки. Урожай желание количество клеток и передавать на новые КПКО блюд, содержащих свежиеLY подготовлены для восстановления среды.
    15. Изменение среды после инкубации в течение ночи со средой восстановления. Культуры должны быть впоследствии кормили и обычно пассируют с использованием среды, содержащей HPSC пенициллин / стрептомицин (100 ед / мл конечной концентрации),.

6. Анализ конечных точек

  1. Терминал щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание
    1. С помощью терминала хромогенный AP окрашивание коррелировать наблюдаемые кинетические и морфологические события с окончательными эффективностью перепрограммирования.
    2. После 21 дней перепрограммирования, удалить культуральной среды из скважины окрашиваться с терминала AP пятно и промыть один раз с 200 мМ Трис-HCl (рН 8,0).
    3. Подготовьте необходимое количество окрашивающего раствора в соответствии с указаниями инструкции завода-изготовителя в 200 мМ Трис-HCl.
    4. Аспирируйте мыть и добавьте 2 мл приготовленного раствора для окрашивания в каждую лунку. Выдержите в течение от 20 до 30 мин при комнатной температуре и от гое свет.
    5. Аспирируйте окрашивание раствора и мыть один раз с 200 мМ Трис-HCl. Удалить стирку и добавить дистиллированную воду до визуализации.
    6. Захват колориметрический сигнал, используя обычную камеру изображения. Подсчитайте число положительно окрашенных колоний вручную. Визуализируйте пятна с помощью флуоресцентного анализа в канале Трит-C, так как пятно также флуоресцентные в природе и выполнять визуализацию цельной скважины и проанализированы с использованием тепловизора целого хорошо. Используйте протокол производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мониторинг Кинетика перепрограммировать с помощью проточной цитометрии

CD44 является маркером в то время как фибробласты SSEA4 является PSC маркером 6,10. Как и следовало ожидать от этого паттерна экспрессии, проточной цитометрии из BJ фибробластах показывает SSEA4 - CD44 + популяции , что облегчает создание квадрантов ворот в комбинации с неокрашенной образца. Во время перепрограммирования фибробластов DF1 с вирусами Сендай, CD44 постепенно теряется в то время как SSEA4 медленно выражается. На 3 -й день после трансдукции с Сендай вирусами, есть большая популяция SSEA4 - CD44 + клетки и небольшая популяция SSEA4 + CD44 + клеток , что становится более отчетливой на 7 -й день (рисунок 1). На 13 -й день, двойной положительный населения переходит к SSEA4 + CD44 - состояние. К 17-й день большой процент СЕLLS в культуре уже SSEA4 + CD44 -. На этот раз курс показывает, что проточной цитометрии с CD44 и SSEA4 могут быть использованы для мониторинга прогрессирования и скорость перепрограммирования.

Количественное сравнение подтверждает , что перепрограммирования BJ фибробласты с вирусами перепрограммирования Сендай генерирует SSEA4 + CD44 - клетки с разной скоростью , чем перепрограммирования BJ фибробластами (рис 2А). Данные показывают , что раннее сравнение процентного содержания PSC типа SSEA4 + CD44 - клетки отслеживает прогрессирование перепрограммирование. Интересно, что на 8 -й день из DF1 перепрограммирования фибробластов, сортировкой и отдельно культивирование популяции клеток , которые находятся в процессе повышающей регуляции SSEA4 и downregulating CD44 генерирует AP + колониям 11 (рис 2В). В отличие от этого , оригинальный SSEA4 - CD44 + популяция порождает AMуч меньшее число AP + колоний на 21 день перепрограммирования, который является типичным день окончательного анализа колоний. Это говорит о том, что можно количественно оценить и сравнить население , переходящих с тем , чтобы предсказать различия в кинетике перепрограммирования еще до того , SSEA4 + CD44 - формируется население. Важным моментом здесь отметить, что перепрограммирование является переменной процесса зависит от нескольких факторов , таких как , начиная соматической клеточной популяции, эффективность трансдукции, средний и т.д. Однако общая картина и прогрессирование описанных выше поверхностных маркеров согласуется между различными экспериментами перепрограммирования и начиная фибробласты. Анализ кинетики перепрограммирования также можно сделать с помощью различных маркеров, таких как вновь выявленных негативных PSC маркеров CD73 и B2M 6, а также установленных PSC маркеров CD24 12,13 и 14,15 EpCAM. Аналогично CD44, CD73 и В2т выражаются в парСИХИЧЕСКОЕ BJ фибробласты, но подавляются в процессе перепрограммирования, став незаметного в полностью перепрограммировать ИПСК (фиг.3А). Поток цитометрии конечно времени , используя CD44 и CD73 или CD44 и В2т показывает , что CD44 и CD73 являются подавляются с одинаковой скоростью, в то время как B2M подавляется быстрее , чем CD44 (Рисунок 3B). В обоих случаях скорость перепрограммирования можно наблюдать путем измерения накопления двойного отрицательного населения. В отличие от этих негативных PSC маркеров, CD24 и EpCAM отсутствуют в фибробластах и выражены в ИПСК (фиг.3А). В проточной цитометрии течения времени, CD24 - CD44 + и EpCam - CD44 + фибробласты в конечном итоге образуют двойные-отрицательные группы населения , которые впоследствии переход в CD24 + CD44 - и EpCam + CD44 - PSC-подобные клетки, соответственно (рис 3б). Таким образом, при перепрограммировании, как положительные, так PSC маркерывыражены после того, как CD44 подавляется. Подобно тому, что наблюдалось с SSEA4 и CD44, образование и накопление различных клеточных популяций указывают на прогрессирование перепрограммирования.

Отслеживание Перепрограммирование с помощью анализа обработки изображений в режиме реального времени

В реальном масштабе времени изображений перепрограммирования культур после пересев показывает постепенное образование колоний (фиг.4А), что соответствует логарифмической увеличению впадения в условиях фазового контраста (рис 4б). Confluence в условиях фазового контраста , таким образом , обеспечивает другую метрику для мониторинга перепрограммирование количественно, но она охватывает как колонии , которые являются положительными для PSC маркеров и продолжающегося распространения unreprogrammed или частично перепрограммировать клетки (рис 4A, последняя панель). Количественная области, которые были окрашены для маркеров плюрипотентностиTRA-1-60, SSEA4 и AP 6,10 на 21 -й день указывает на то, что иПСК приходится лишь менее половины от общего слияния (рис 4В). Для того, чтобы оценить прогресс перепрограммирования строже, можно использовать репортер линии для перепрограммирования. Здесь вторичные фибробласты были получены из линии BG01v / Hog ESC, которая была разработана с OCT4-GFP репортер 16. GFP выражается как клетки перепрограммировать и , как образуются колонии (рис 5А). Измерение впадения в условиях фазового контраста и зеленого каналов показывает , что GFP стечение растет медленнее , чем общее слияния и впадения в GFP день 19 составляет менее половины от общего слияния (рис 5B), напоминает TRA-1-60, SSEA4 и AP окрашивания на 21-й день.

Рисунок 1
Рисунок 1. Моnitoring прогрессу перепрограммирования с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия Dot Участки для DF1 фибробластами перепрограммирован Сендай вирусами под Фидер безупречных условий. Клетки собирали и окрашивали SSEA4 и CD44 антител с различными интервалами от 3 ​​-й день (D3) в день 19 (D19) процесса перепрограммирования. Культуры на 9-й день (Д9) и далее были проанализированы после того, как клетки пересевали на 7-й день (D7). Точечные графики показывают 8000 синглеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
. Рисунок 2. Оценка перепрограммирования Кинетика и эффективности при фидерных свободных условиях (А) График , показывающий изменения в процентах от SSEA4 + CD44 - перепрограммировать клетки после трансдукции DF1 выдумкаroblasts и BJ фибробласты с вирусами Сендай. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на 3 -й день до 19 после трансдукции, с культурами на 9 -й день и далее , проходящих пересев на 7 день (B) Псевдо-цвета проточной цитометрии участков для клеток DF1 трансдуцированных вирусы Сэндай и окрашивали SSEA4 и CD44 антителами. SSEA4 -. CD44 + клетки (черный круг) и SSEA4 + клетки (красный круг) были рассортированы на 8 -й день и позволили расти до 19 день до того окрашивания для щелочной фосфатазы (красный) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Соблюдая перепрограммировать Кинетика фидерных свободных культур с использованием различных положительных и отрицательных PSC маркеров. (AD) Живая окрашиваниеДня-18 DF1-производных перепрограммирования культур с использованием антител для положительных PSC маркеров CD24 и EpCam и отрицательных PSC маркеров CD44, CD73 и В2т. Верхние панели объединить зеленые и красные каналы флуоресценции в то время как нижние панели также включают в себя фазовый контраст изображения. Шкалы представляет 200 мкм. (E) Проточная цитометрия участков для точечных DF1-производных перепрограммирования культур , собираемых и окрашивали с использованием тех же маркеров из 9 -й день до 17 (D9 до D17) после трансдукции. Перед анализом культуры пересевали в День 7. Точечные графики показывают 8000 синглеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Отслеживание перепрограммировать Кинетика путем измерения общего Confluence. (A) в режиме реального времени яmaging из BJ фибробласты перепрограммирован с вирусами Сендай при фидерных свободных условиях. Фазовый контраст изображения тех же колоний были приняты на 7-й день до 19, а затем на 21-й день с дополнительным окрашиванием для CD44 и SSEA4, TRA-1-60 или AP. Масштабная линейка соответствует 400 мкм. (B) Количественная от общего слияния (фазового контраста) как перепрограммирование прогрессирует от пересев на 7 -й день до 21 -й день Общая впадения в 21 -й день по сравнению с SSEA4, TRA-1-60 и слияния сигнала AP ( зеленый канал). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Оценка перепрограммирования Кинетика путем измерения OCT4-GFP Confluence. (A) в режиме реального времени визуализации BG01v / Hog чЭСК полученных из фибробластов перепрограммированСендай вирусы при фидерных свободных условиях. Фазовый контраст, зеленая флуоресценция и слиты были получены изображения тех же колоний на 7 -й день до 19. Шкала бар соответствует 400 мкм. (B) Количественная от общего слияния (фазового контраста) и OCT4-GFP слияния (зеленый канал) , как перепрограммирование прогрессирует от повторного сева на 7 -й день в день 21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы [RHQ, JSTA, KS, и UL] являются сотрудниками компании Thermo Fisher Scientific, которая производит некоторые из реагентов и инструментов, используемых в этой статье.

Acknowledgments

Авторы благодарят Чад Макартура за полезные обсуждения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1x) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

Tags

Биология развития выпуск 113 перепрограммирования индуцированные плюрипотентные стволовые клетки в реальном масштабе времени изображения проточной цитометрии плюрипотентные маркеры стволовых клеток кинетическое измерение
Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J.,… More

Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter