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Biology

गोलाकार पायस बूंदों में बेसिक mitotic स्पिंडल पुनर्गठन

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54278
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Delft University of Technology

Introduction

बँटवारा के दौरान दोहराया जीनोम के गुणसूत्रों सेल भूमध्य रेखा पर आयोजित कर रहे हैं नवगठित बेटी कोशिकाओं पर बहन क्रोमेटिडों का समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए। क्रोमोजोम स्थिति और अलगाव दो विरोधी centrosomes से होने वाले धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के लिए उनके लगाव द्वारा मध्यस्थता है। वफादार गुणसूत्र वितरण सुनिश्चित करने के लिए इसके अलावा, mitotic धुरी के उन्मुखीकरण भी कोशिका विभाजन विमान 1 लगती हैं। कोशिका विभाजन के समन्वित रुख विकास के कई चरणों के दौरान और ऊतक homeostasis 2 के लिए आवश्यक है। विशेष रूप से, विनियमित mitotic धुरा स्थिति सेलुलर सामग्री की विषम वितरण में परिणाम कर सकते हैं या यहां तक कि विभिन्न आकारों 2 की बेटी कोशिकाओं का उत्पादन। Mitotic धुरा विधानसभा और ओरिएंटेशन prophase में शुरू होता है और सहयोग और नाराज बल-जनरेटर 3,4 के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा करवाया जाता है। उत्पन्न बलों ख से मिलकर बनता हैअन्य संगठनों खींच और धक्का बलों। इन बलों दोनों सेल कोर्टेक्स के साथ धुरी संपर्कों से साथ ही धुरी के भीतर उत्पन्न, और microtubule गतिशीलता के साथ ही आणविक मोटर्स और पार linkers (चित्रा 1) द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है।

धक्का बलों उत्पन्न किया जा सकता है जब इस तरह के सूक्ष्मनलिकाएं सेल कोर्टेक्स के रूप में कठोर संरचनाओं के खिलाफ बढ़ता है। प्रणाली के भीतर उत्पन्न कुल विरोध बल पर निर्भर करता है, इस mitotic धुरा (कम बलों) के repositioning में परिणाम या microtubule buckling या तबाही (उच्च बलों) 5-8 को गति प्रदान कर सकते हैं। बल की राशि है कि आगे बढ़ाने के द्वारा उत्पन्न किया जा सकता microtubule लंबाई पर निर्भर करता है, के बाद से लंबाई microtubule-buckling 9 के एक मजबूत निर्धारक है। इसके अलावा, सूक्ष्मनलिकाएं कि एक केंद्रपिंड से ही शुरू, एक तंत्र है कि जल्दी prophase 3,10 में केंद्रपिंड जुदाई ड्राइव करने के लिए सुझाव दिया गया है अन्य केंद्रपिंड के खिलाफ धक्का कर सकते हैं।

विज्ञापन मेंसेल कोर्टेक्स बढ़ रही सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा उत्पन्न बलों धक्का, microtubule संपर्क छोर तक प्रत्यर्पण भी ताकतों 11 खींच मध्यस्थता कर सकते हैं। कई प्रयोगशालाओं से पता चला है कि cortical बल जनरेटर की नियंत्रित गतिविधि विवो 1 में mitotic स्पिंडल की विषम स्थिति के लिए आवश्यक है। इन खींच बलों के लिए आवश्यक कॉर्टेक्स-स्थानीय cytoplasmic dynein (इसके बाद 'के रूप में dynein' कहा जाता है), एक शून्य से अंत निर्देशित microtubule मोटर प्रोटीन 8,12,13 है। उदाहरण के लिए, खमीर, कोर्टेक्स 14 के साथ फिसलने मोटर निर्भर microtubule में microtubule जाली परिणाम के साथ cortical dynein के पार्श्व बातचीत नवोदित में। हालांकि, cortical खींच बलों को भी dynein की क्षमता सूक्ष्मनलिकाएं 8 depolymerizing करने के लिए अंत पर संलग्नक के रूप में करने के द्वारा उत्पन्न की जा सकती है। Microtubule संकोचन द्वारा उत्पन्न ऊर्जा बलों है कि आम तौर पर परिमाण अधिक की एक आदेश हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (~ 50 पी.एन. (संदर्भ के 15 16))। Depolymerizing सूक्ष्मनलिकाएं को cortical dynein के अंत पर कुर्की नवोदित खमीर 17 और सी में धुरी स्थिति को बढ़ावा देता है एलिगेंस 13। दोनों मोटर पर निर्भर फिसलने और microtubule depolymerization संचालित cortical खींच बलों सहयोग या विवो में परस्पर अनन्य हैं कर सकते हैं कि क्या वर्तमान अज्ञात पर है।

microtubule धक्का बलों और dynein की मध्यस्थता cortical खींच बलों के अलावा, केंद्रपिंड स्थिति कई अन्य प्रोटीन से mitotic धुरी के भीतर से नियंत्रित किया जाता है। Kinesin-5 मोटर्स, उदाहरण के लिए, tetramers कि पार से लिंक कर सकते हैं antiparallel interpolar सूक्ष्मनलिकाएं, जावक फिसलने बलों 18-20 की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में मौजूद हैं। Kinesin-5 मोटर परिवार के सदस्य, केंद्रपिंड जुदाई और अध्ययन सभी eukaryotes में द्विध्रुवी धुरी विधानसभा के लिए आवश्यक हैं सी के अपवाद के साथ एलिगेंस (संदर्भ 21 में समीक्षा)।

इसके अलावा, Ase1 / PRC1 परिवार का प्रसारण पार linkers भी vivo में इन विट्रो 22-27 में interpolar सूक्ष्मनलिकाएं के microtubule क्षेत्रों ओवरलैपिंग को स्थानीय बनाना करने के लिए जाना जाता है। ओवरलैपिंग microtubule-क्षेत्र के Ase1 चालित विस्तार से उत्पन्न बलों काफी बड़े विट्रो 28,29 में kinesin -14 मध्यस्थता रपट बलों counterbalance करने के लिए कर रहे हैं। कोशिकाओं में, Ase1 / PRC1, धुरी midzone 25-27,30 में microtubule क्षेत्रों ओवरलैपिंग सुझाव है कि प्रसारण पार linkers द्वारा उत्पन्न बलों काफी धुरी संगठन में योगदान कर सकते स्थिर गठन के लिए आवश्यक है। अंत में, mitotic क्रोमेटिन से बलों और गुणसूत्रबिंदुओं विभिन्न रास्ते से 3 mitotic धुरा विधानसभा और स्थिति को प्रभावित करती है। चूंकि इन घटकों यहाँ वर्णित पुनर्गठन assays का हिस्सा नहीं हैं, वे विस्तार से चर्चा नहीं की जाएगी।

jove_content "> विभिन्न सिद्धांतों जीवित कोशिकाओं में प्रयोगों के लिए कैसे अलग आणविक घटकों और बलों ऊपर वर्णित धुरी विधानसभा और स्थिति में सहयोग पर मौजूद हैं, लेकिन हम अभी भी एक मात्रात्मक समझ से दूर हैं। इसके अलावा, शुद्ध घटकों के साथ इन विट्रो प्रयोगों एक शक्तिशाली प्रदान मार्ग में मदद करने के लिए इस लक्ष्य तक पहुँचने। यहाँ हम हाल ही में प्रकाशित तरीकों में से एक अनुकूलित और विस्तारित संस्करण (रोथ एट अल। 31), जिसमें बुनियादी स्पिंडल पानी में तेल पायस बूंदों में पुनर्गठन कर रहे हैं करने के लिए एक दृश्य गाइड मौजूद है, एक साथ शुरू घटकों की न्यूनतम संख्या के। microfluidic तकनीकों का प्रयोग, गोलाकार बूंदों आकार है कि mitotic कोशिकाओं के लिए तुलना कर रहे हैं के साथ उत्पन्न कर रहे हैं। इन बूँदों के भीतर, शुद्ध centrosomes और tubulin, microtubule एस्टर गतिशीलता का अध्ययन करने पीढ़ी और एस्टर-एस्टर बातचीत के लिए मजबूर क्रम में जोड़ा जा सकता है। By शुरू cortical (जैसे dynein के रूप में) और अंतर-ध्रुवीय (जैसे kinesin-5 / Ase1) बल-जनरेटर, हमतेजी से जटिल धुरी संरचनाओं की तरह है कि इन विवो स्थिति के समान करने के लिए शुरू पुनर्गठित।

Protocol

1. Microfluidics चिप्स की तैयारी

नोट: धुरी विधानसभा के नीचे अप अध्ययन के लिए, गोलाकार पानी में तेल पायस बूंदों का इस्तेमाल किया जाता है। इन जलीय फॉस्फोलिपिड और surfactant की एक monolayer द्वारा आसपास के तेल चरण से अलग microdroplets हैं। ये पायस-बूंदों microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) चिप्स के भीतर उत्पादन कर रहे हैं। चैनल geometries और प्रवाह दरों में परिवर्तन धुन बूंद आकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ वर्णित microfluidic डिजाइन में, बूंदों एक स्तनधारी mitotic सेल के ज्यामितीय कारावास की नकल करने के बारे में 15 माइक्रोन की एक व्यास के साथ उत्पन्न कर रहे हैं।

  1. Photomask डिजाइन और मोल्ड निर्माण
    1. एक photomask तीन इनलेट चैनल के 31 युक्त डिजाइन। इनलेट चैनल 1 पानी चरण है, जो छोटी बूंद सामग्री (धारा 3 देखें "बुनियादी microtubule asters पुनर्गठन") शामिल है को जोड़ता है। इनलेट चैनल 2 तेल चरण (देखें अनुभाग 2.1 "लिपिड / तेल-पीएचए को जोड़ता हैएसई तैयारी ")। पहले अवलोकन (वैकल्पिक) (चित्रा 2A बी अतिरिक्त लिपिड / तेल चरण के साथ पायस-बूंदों को कमजोर करने के इनलेट चैनल 3 उपयोग)।
      नोट: सभी इनलेट चैनल के जाल धूल, PDMS कणों और (प्रोटीन) समुच्चय को एक धूल फिल्टर (2 माइक्रोन चैनलों की भूलभुलैया) द्वारा पीछा कर रहे हैं और उन्हें microfluidic चैनलों (चित्रा 2 डी) अवरुद्ध से रोकने के लिए। चैनल 75 माइक्रोन चौड़ा और 12.5 माइक्रोन विस्तृत जंक्शन जहां पायस-बूंदों के रूप में होगा (चित्रा 2 सी) में लिपिड / तेल चरण और पानी चरण पूरा करते हैं।
    2. आदेश और एक फिल्म सब्सट्रेट पर मुद्रित photomasks प्राप्त है, एक नकारात्मक polarity के साथ (photomask पारदर्शी रूप से डिजाइन संरचनाओं के साथ अंधेरा हो जाएगा)।
  2. मोल्ड निर्माण
    1. एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर एक स्पिन coater (500 आरपीएम, 10 सेकंड, 1,800 आरपीएम, 45 सेकंड के बाद) एक साफ-रूम के माहौल में का उपयोग करने पर स्पिन कोटिंग SU-8 3025 photoresist द्वारा नए नए साँचे बनाना।
    2. बेनकाब SU-8 लेपितphotomask के माध्यम से सिलिकॉन वेफर। निर्माता के निर्देशों के अनुसार ~ 40 माइक्रोन मोटाई चैनलों बनाने के लिए वेफर्स का विकास करना।
  3. एक microfluidic चिप बनाने
    1. एक नाव की तरह पोत एक प्लास्टिक रंग का उपयोग कर में 1 भाग इलाज एजेंट (कुल ~ 40 जीआर) के साथ मिश्रण 10 भागों पूर्व बहुलक PDMS। प्लेस ~ 30 मिनट के लिए एक निर्वात चैम्बर में नाव की तरह पोत युक्त PDMS। हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए। मोल्ड चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी लपेटें ~ 1 सेमी किनारों ऊपरवाला के साथ एक कप बनाने के लिए।
    2. PDMS डालो (~ कुल मात्रा का 75%) मोल्ड में, एक निर्वात चैम्बर में एक और ~ 30 मिनट के लिए छोड़ दें। (हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए) और एक ओवन में 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इलाज।
    3. स्पिन कोट गिलास स्लाइड पर शेष PDMS (200 rpm पर 5 सेकंड 4,000 आरपीएम पर 30 सेकंड के बाद) 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इलाज के बाद। का उपयोग कर संकुचित हवा / एन 2 -flow, पूर्व सफाई आवश्यक नहीं है गिलास स्लाइड से धूल हटाने।
      नोट: PDMS लेपित गिलास स्लाइड mic के लिए दोनों का इस्तेमाल किया जा सकताrofluidic चिप और प्रवाह सेल उत्पादन (भी 2.2 देखें)।
    4. धीरे ढालना एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर के बंद PDMS पट्टी और छेद (inlets के लिए 0.5 मिमी, आउटलेट के लिए 0.75 मिमी) पंच microfluidic चिप और एक PDMS लेपित गिलास स्लाइड कुछ सेकंड के लिए एक प्रयोगशाला कोरोना सतह treater का उपयोग कर .Corona का इलाज ।
    5. गिलास स्लाइड पर microfluidic चिप (चैनलों नीचे का सामना करना पड़) प्लेस और ओ चिप्स सेंकना / n 100 डिग्री सेल्सियस पर (चित्रा 3 ए)। एक धूल से मुक्त वातावरण में कई महीनों के लिए microfluidic चिप्स की दुकान।

2. Microfluidic सेटअप

नोट: पानी में तेल पायस बूंदों एक microfluidics सेटअप और microfluidic चिप्स ऊपर वर्णित का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं। लिपिड / तेल चरण की संरचना प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर अलग किया जा सकता है। तेल-solubilized लिपिड के अंदर पानी का सामना करना पड़ उनकी ध्रुवीय सिर-समूहों के साथ पानी-तेल इंटरफेस में एक monolayer बनेगी। आदेश में प्रोटीन को निशाना बनाने में(जैसे dynein) छोटी बूंद सीमा तक, biotinyl-phosphatidylethanolamine की कम मात्रा (biotinyl पीई) लिपिड जोड़ा जा सकता है। यह biotinylated dynein की भर्ती streptavidin की मध्यस्थता के माध्यम से multimerization (धारा 4.1 "dynein छोटी बूंद कोर्टेक्स करने का लक्ष्य" देखें) की अनुमति देता है। बूंदों एक surfactant के अलावा द्वारा स्थिर और PDMS लेपित प्रवाह कोशिकाओं में जमा हो जाती है।

  1. लिपिड / तेल चरण तैयारी
    1. मिक्स क्लोरोफॉर्म-भंग 1,2-dioleoyl- sn- glycero-3-phospho एल सेरीन (DOPS) और एक 4 में biotinyl पीई लिपिड: कांच pipets का उपयोग कर एक ग्लास ट्यूब में 1 दाढ़ अनुपात (बड़े पैमाने पर पहले क्लोरोफॉर्म के साथ pipets कुल्ला उपयोग)। ~ के 0.5 मिलीग्राम / एमएल एक लिपिड एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप, ~ 250 माइक्रोग्राम लिपिड की कुल तैयार करें।
    2. ध्यान से एन 2 -flow के साथ और बाद में ~ 1 घंटे के लिए एक निर्वात चैम्बर में लिपिड मिश्रण सूखी। 0.5 मिलीग्राम / एमएल (~ 500 μl बनाने के लिए) के लिए खनिज तेल और 2.5% surfactant में सूखे लिपिड भंग।
    3. एक में लिपिड / तेल नमूना प्लेसअल्ट्रासोनिक स्नान और 30 मिनट के लिए Sonicate। 40 kHz पर पूरी तरह से लिपिड भंग करने के लिए।
  2. प्रवाह सेल तैयारी
    1. स्पिन कोट PDMS कवर चश्मे पर (200 rpm पर 5 सेकंड 4,000 आरपीएम पर 30 सेकंड के बाद) (यह भी खंड 1.3 देखें) और गिलास स्लाइड (100 rpm पर 5 सेकंड 30 सेकंड 1500 rpm के बाद) आदेश सजातीय परत जमा करने में PDMS की।
      नोट: इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता के लिए, एक मोटाई कि खुर्दबीन उद्देश्य मैच के साथ कवर चश्मे का उपयोग सुनिश्चित करें। 1.5 (~ 0.17 मिमी): इस मामले में।
    2. एक ओवन में 100 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए PDMS लेपित कवर चश्मा और गिलास स्लाइड का इलाज। बारीकी से रिक्ति द्वारा प्रवाह कोशिकाओं को बनाने (~ 2 मिमी) प्रयोगशाला सील फिल्म के पतले स्लाइस (~ चौड़ाई में 3 मिमी) PDMS लेपित गिलास स्लाइड पर। जब एक धूल से मुक्त वातावरण में संग्रहीत, चैनलों है कि इस्तेमाल नहीं किया गया है अन्य समय में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. प्रयोगशाला सील फिल्म ~ 1 मिनट पिघलने से एक PDMS लेपित coverslip और मुहर के साथ प्रवाह कोशिकाओं को कवर। 100 डिग्री सेल्सियस पर, प्रेसधीरे (चित्रा 3 सी)। Valap (चित्रा 3 सी) के साथ प्रयोगशाला सील फिल्म कांच-सीमाओं को बंद करें। स्टोर प्रवाह कोशिकाओं को एक धूल से मुक्त वातावरण में कई महीनों के लिए।
  3. PDMS कप तैयारी
    1. लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए, एक PDMS कप, (~ 3 मिमी मोटी) बनाने PDMS का एक टुकड़ा में एक 4 मिमी व्यास छेद छिद्रण द्वारा
    2. PDMS टुकड़ा और एक PDMS लेपित गिलास को कवर कोरोना-इलाज के लिए और एक दूसरे के शीर्ष पर उन्हें जगह है। PDMS कप ओ / एन (100 डिग्री सेल्सियस) (चित्रा 5 ए) बनाओ।
  4. पायस-छोटी बूंद गठन
    1. एक औंधा उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर छोटी बूंद गठन की निगरानी। Microfluidic चिप तिरछी ट्यूब का उपयोग करने के लिए दबाव नियंत्रक कनेक्ट (व्यास: 510 माइक्रोन (बाहरी) और 125 माइक्रोन (आंतरिक)) (चित्रा 3 ए)। पूरी तरह से इनलेट 2 से लिपिड / तेल चरण के साथ microfluidic चिप्स भरें।
    2. MRB80 आधारित पानी चरण का परिचय (देखें धारा 3 "पुनर्गठन बुनियादी microtubule asters4;) बदलते लिपिड / तेल चरण और पानी चरण के दबाव से इनलेट 1. नियंत्रण छोटी बूंद आकार से की बूंदों बनाने के लिए ~ व्यास में 15 माइक्रोन (चित्रा 3 बी)।
      नोट: इस सेटअप का उपयोग करना, पानी चरण के लिए लिपिड / तेल चरण और ~ 200 मिलीबार के लिए उपयोग ~ 800 मिलीबार वांछित आकार की बूंदों बनाने के लिए।
    3. वांछित छोटी बूंद आकार और आवश्यक राशि प्राप्त करने के बाद (~ नमूना प्रति 10 μl), आउटलेट चैनल और लोड से बूंदों प्रवाह सेल में इकट्ठा (प्रवाह सेल पूरी तरह से भरने के लिए)।
    4. प्रवाह सेल ध्यान Valap का उपयोग कर के सिरों बंद (अधूरे बंद प्रवाह कोशिकाओं बूंदों के व्यापक आंदोलन में परिणाम कर सकते हैं, यह उन्हें छवि के लिए मुश्किल बना रही है)। इसके अलावा, हवा के बुलबुले जो छोटी बूंद आंदोलन में जो परिणाम के गठन को रोकने के।
    5. isopropanol साथ बड़े पैमाने पर तिरछी नलियों कुल्ला करने से पहले और उपयोग के बाद नमूना पार संदूषण और clogging रोकने के लिए।

3. पुनर्गठन बेसिक microtubule Asters

नोट: छोटी बूंद सामग्री प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर अलग किया जा सकता है। सभी बफ़र्स MRB80 आधारित (80 मिमी पाइप, 1 मिमी EGTA, 4 मिमी 2 MgCl (6.8 पीएच)) हैं, और सभी के नमूने बर्फ पर तैयार किया जाता है। सामान्य में, बूंदों हमेशा centrosomes, microtubule polymerization, एक ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली और अवरुद्ध एजेंट के लिए आवश्यक घटक होते हैं (अनुभाग 3.1 देखें)। अगर वांछित microtubule बल-जनरेटर और आवश्यक सहकारकों और लक्षित कर कारकों को शामिल किया जा सकता है (वर्गों 4.1 और 4.2 देखें)।

  1. पायस बूंदों में एस्टर गठन के लिए जनरल सेटअप (चित्रा 3 डी)
    1. -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में अग्रिम और दुकान में ग्लूकोज oxidase (20 मिलीग्राम / 200 मिमी डीटीटी और 10 मिलीग्राम / एमएल catalase में मिलीलीटर ग्लूकोज oxidase) मिश्रण तैयार करें।
    2. एक 'अवरुद्ध मिश्रण' κ-कैसिइन, गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) युक्त तैयार करें, बीच -20 और (एक तटस्थ मार्कर के रूप में) फ्लोरोसेंट dextran अग्रिम और छोटे aliquo में दुकान में (1 टेबल देखें)-80 डिग्री सेल्सियस पर टीएस। दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र रोकें। सभी घटकों को सुनिश्चित हौसले से तैयार कर रहे हैं।
    3. मानव लिम्फोब्लासटिक KE37 सेल लाइनों के रूप में छोटे aliquots में -150 डिग्री सेल्सियस पर Moudjou एट अल। 32 और स्टोर द्वारा वर्णित से centrosomes शुद्ध।
    4. कमरे के तापमान पर centrosomes गला लें और ~ के लिए 20 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। उपयोग करने से पहले उचित microtubule nucleation सुनिश्चित करने के लिए।
      नोट: इस प्रयोग के दौरान microtubule केंद्रक को बढ़ावा देता है।
    5. मतलब समय में, 'परख मिश्रण' तैयार tubulin (फ्लोरोसेंट और 'अंधेरे'), ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी), एक ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली से युक्त (ग्लूकोज, ग्लूकोज oxidase, catalase और 1,4-dithiothreitol (डीटीटी)), आणविक बल जनरेटर (जैसे microtubule मोटर्स / पार linkers), adenosine triphosphate (एटीपी) और एक एटीपी regenerating प्रणाली (phosphoenolpyruvate (पीईपी), पाइरूवेट काइनेज (पी) और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH)) बर्फ पर (2 टेबल देखें)।
    6. पूर्व शांतबर्फ पर airfuge रोटर। ठंडा airfuge रोटर (3 मिनट के लिए 30 साई) .Add पूर्व गर्म centrosomes (1-2 centrosomes युक्त बूंदों के लिए उद्देश्य के centrosomes की राशि का अनुकूलन) में नमूना स्पिन।
    7. संयुक्त मिश्रण का उपयोग करें तरीकों धारा 2.3 में वर्णित का उपयोग कर पायस बूंदों का उत्पादन करने के लिए।
अंग शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता (परख में) आयतन टिप्पणी
Dextran-647nm 75 माइक्रोन के 3.75 उम (0.6 माइक्रोन) के 5 μl
κ-कैसिइन 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर 12.5 मिलीग्राम / एमएल (2 मिलीग्राम / एमएल) 62.5 μl
बीच -20 5% 0.375% (0.06%) 7.5 μl
बीएसए 200 मिलीग्राम / मिलीलीटर 12 मिलीग्राम / एमएल (1.9 मिलीग्राम / एमएल) 6 μl
MRB80 19 μl
100 μl अंतिम 2 μl aliquots में स्टोर

तालिका 1: 'अवरूध्द मिक्स' के संघटक अवरुद्ध मिश्रण के घटक, पानी में तेल पायस बूंदों में धुरी की तरह संरचनाओं के पुनर्गठन के लिए जरूरी है।। विवरण के लिए, मुख्य पाठ खंड 3 देखें "बुनियादी microtubule asters पुनर्गठन"। सामग्री पर जानकारी के लिए, "सामग्री तालिका देखें।

अंग स्टॉक concentration अंतिम एकाग्रता आयतन टिप्पणी
अवरूध्द मिश्रण 1.6 μl
ट्यूबिलिन 500 माइक्रोन 30 माइक्रोन के 0.6 μl
ट्यूबिलिन-488/561 50 माइक्रोन के 3 सुक्ष्ममापी 0.6 μl
जीटीपी 50 मिमी 5 मिमी 1.0 μl
Dynein-TMR 178 एनएम 30 एनएम 1.7 μl
streptavidin 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर 200 एनएम 0.4 μl cortical dynein के लिए केवल
Kinesin -5 1.6 मिमी 80 एनएम 0.5 μl
एटीपी 25 मिमी 1 मिमी 0.4 μl मोटर्स के लिए केवल
पीईपी 0.5 एम 25.6 मिमी 0.5 μl मोटर्स के लिए केवल
पी / LDH 800 यू / 1,100 U 23 यू / 32 यू 0.3 μl मोटर्स के लिए केवल
Ase1-GFP 400 एनएम 80 एनएम 2.0 μl
शर्करा 2.5 एम 50 मिमी 0.3 μl अंतिम चरण
ग्लूकोज oxidase 50x 1.0x 0.3 μl अंतिम चरण
MRB80 एक्स
9 μl अंतिम

तालिका 2: 'परख मिक्स' के संघटक। सामग्री तालिका देखें।

4. परिचय धुरी विधानसभा कारकों

नोट: यहाँ वर्णित assays में एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) एस के छोटा संस्करण -tagged cerevisiae dynein इस्तेमाल किया गया था कि कृत्रिम रूप से एक एमिनो टर्मिनल glutathione एस ट्रांसफेरेज़ (जीएसटी) के माध्यम से dimerized है -tag 33। यह प्रोटीन एक समानता टैग है कि प्रोटीन की दो प्रतियां एक आईजीजी बाध्यकारी डोमेन शामिल है के माध्यम से शुद्ध होता है। यहां इस्तेमाल किया संस्करण carboxy टर्मिनल और एन टर्मिनल स्नैप-टैग शुद्ध प्रोटीन biotinylate करने के लिए प्रयोग किया जाता है पर एक tetramethylrhodamine (टीएमआर) लेबल के साथ लेबल है। निर्माण जानकारी के लिए, रोथ एट अल वहाँ 31। शुद्धि जानकारी के लिए, आरईसी देखनाकश्मीर पीटरसन एट अल। 33। GFP-बायोटिन dynein-TMR बायोटिन streptavidin परिसरों कि लिंक dynein को biotinyl पीई लिपिड (3E चित्रा) के गठन के माध्यम से छोटी बूंद-कोर्टेक्स को निशाना बनाया जा सकता है।

  1. Dynein बूंद कॉर्टेक्स के लिए लक्ष्य निर्धारण
    1. 'परख मिश्रण' में GFP-बायोटिन dynein-TMR शामिल 30 एनएम के एक अंतिम छोटी बूंद-एकाग्रता में (2 टेबल देखें)। 'परख मिश्रण' में streptavidin शामिल 200 एनएम के अंतिम छोटी बूंद-एकाग्रता में (2 टेबल देखें)।
      नोट: dynein सूक्ष्मनलिकाएं पर कदम वार आंदोलन के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस पर निर्भर करता है। इसलिए, एटीपी और एक एटीपी regenerating प्रणाली 'परख मिश्रण' में (पीईपी और पी / LDH युक्त) शामिल हैं (तालिका 2 देखें)।
      नोट: संयोजक पूर्ण लंबाई एस pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) कृपया Diez प्रयोगशाला (आण्विक जैव अभियांत्रिकी, Technische Universität ड्रेसडेन, ड्रेस्डेन, जर्मनी के लिए केंद्र) द्वारा प्रदान किया गया था, देखते हैं। संयोजक पूर्ण एलength हिस्टिडीन टैग एस pombe GFP-Ase1 कृपया Jansons लैब (विश्वविद्यालय, प्राकृतिक वातावरण, नीदरलैंड) से प्रदान की है और 80 एनएम पर सांद्रता में 'परख मिश्रण' के लिए जोड़ा गया है।

5. इमेजिंग

नोट: प्रयोग के दौरान, microtubule विकास तापमान बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है। इमेजिंग शर्तों को चुनने में, व्यापार-नापसंद उच्च गुणवत्ता इमेजिंग और लंबे समय अवधि के लिए धुरी विधानसभा निगरानी करने की क्षमता के बीच किया जाना है। अलग अलग परिस्थितियों में धुरी गठन के कैनेटीक्स तुलना करने के लिए, विभिन्न सामग्री के साथ बूंदों मिलाया और एक ही प्रवाह चैनल में imaged किया जा सकता है।

  1. बेसिक इमेजिंग सेटिंग्स
    1. एक तापमान नियंत्रित वातावरण में छवि एक संलग्न कक्ष का उपयोग। ~ 30 मिनट में 26 डिग्री सेल्सियस के बाद अलग-अलग सूक्ष्मनलिकाएं कल्पना। जबकि इमेजिंग, अप करने के लिए ~ 30 डिग्री सेल्सियस तापमान में वृद्धि से microtubule-विकास को बढ़ावा देने।
      नोट: एसनीचे सेटिंग- हमारे माइक्रोस्कोप सेटअप करने के लिए विशिष्ट होते हैं और विभिन्न प्रणालियों और अलग ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के साथ भिन्न हो सकते हैं। यहाँ वर्णित assays के सभी एक कताई डिस्क confocal सिर के साथ एक मोटर चालित उल्टे सिस्टम पर imaged और ऐसे Andor बुद्धि 3.1 के रूप में इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संचालित कर रहे हैं। एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य और EMCCD कैमरा के साथ सभी छवियों को प्राप्त करते हैं।
    2. उत्तेजना लेज़रों सेट 488, 561 और मोटे तौर पर ~ 10% तीव्रता के 641 एनएम। 'अधिग्रहण' पैनल के लिए जाओ 10% करने के लिए 'AOTF' टैब और स्लाइड लेजर तीव्रता पर क्लिक करें। सेटिंग्स स्टोर करने के लिए 'रिकॉर्ड' पर क्लिक करें।
    3. जेड -projections के लिए, 1 माइक्रोन अंतराल (~ 20 छवियों / छोटी बूंद) के साथ ढेर ले। 'पैनल पर क्लिक करें' मुख्य "कैमरे के लिए जाएं संपादित जेड 'और सेट' जेड 'कदम 1.0। पर क्लिक करें' सेटिंग दुकान के बगल में '।
    4. 'अधिग्रहण' पैनल में 'कैमरा' टैब पर क्लिक करके अधिकतम रेखीय ईएम-लाभ सेट और 300 सेट जोखिम के लिए उन्हें लाभ बार स्लाइडएक ही टैब में 200 मिसे बार। सेटिंग्स स्टोर करने के लिए 'रिकॉर्ड' पर क्लिक करें।
  2. लाइव इमेजिंग
    1. लाइव इमेजिंग के लिए, सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग कर Z -projections हर 2 मिनट बनाते हैं। ~ 100 मिसे के लिए जोखिम को कम करने से बार 1-2 घंटा की अवधि के लिए। (के रूप में 5.1.4 में वर्णित) और 2 माइक्रोन के लिए Z -intervals वृद्धि (5.1.3 में वर्णित के रूप में)। मुख्य 'कैमरा' पैनल में समय श्रृंखला सेट, 'दोहराने टी' पर क्लिक करें और 2 मिनट के लिए निर्धारित किया है। 120 मिनट की कुल समय के लिए अंतराल।
    2. लाइव assays के लिए, एक PDMS कप के बजाय एक नियमित प्रवाह सेल का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कि बूंदों के रूप में संभव के रूप में स्थिर रहे हैं।
  3. 2 शर्तों के संयुक्त इमेजिंग
    1. microfluidics का उपयोग कर बूंदों का उत्पादन और बर्फ पर एक PDMS लेपित गिलास स्लाइड के शीर्ष पर दुकान। इस microtubule nucleation रोकता है जब तक बूंदों के दूसरे सेट का गठन किया गया है। बूंदों के दूसरे सेट का निर्माण करने से पहले, तिरछी ट्यूब और साथ microfluidic चिप कुल्लाMRB80 और पूरी तरह से लिपिड / तेल चरण के साथ microfluidic चिप फिर से भरना।
    2. साथ और क्रम में विभिन्न रंगों के साथ बूंदों के बीच भेदभाव करने में फ्लोरोसेंट dextran (या अलग तरंग दैर्ध्य fluorophores साथ dextran का उपयोग) के बिना बूंदों उत्पन्न करता है। बूंदों के दूसरे बैच के उत्पादन के बाद, धीरे pipetting द्वारा बूंदों का मिश्रण है और एक भी प्रवाह सेल / PDMS कप में लोड।
  4. छवि विश्लेषण।
    1. फिजी (खुला स्रोत सॉफ्टवेयर उपलब्ध ऑनलाइन) 34 का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण।
    2. 'Hyperstack करने के लिए ढेर' - 'hyperstacks' - लाइव assays के लिए, 'छवि' का उपयोग hyperstacks में ढेर परिवर्तित। जेड स्लाइस और समय फ्रेम की सही संख्या सेट करें।
    3. 'ढेर' - - 'जेड' परियोजना के आदेश, जेड अनुमानों बनाने के लिए 'छवि' चुनें। 'अधिकतम तीव्रता' प्रक्षेपण चुनें।
    4. 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, पहली बार 'छवि' के लिए जाने - 'गुण' और साथ, पिक्सेल ऊँचाइ, voxel गहराई और मंगलवार उचित पिक्सेल सेटAME अंतराल। ओके पर क्लिक करें'। 'छवि' चुनें - 'ढेर' - '3 डी परियोजना', 'लगाना' बॉक्स की जाँच करें और क्लिक करें 'ठीक है'।

Representative Results

पिछले वर्गों में प्रस्तुत तरीकों बढ़ती जटिलता पानी में तेल पायस बूंदों के ज्यामितीय कारावास का उपयोग के साथ धुरी की तरह संरचनाओं के पुनर्गठन के लिए अनुमति देते हैं। यह खंड प्रतिनिधि परिणाम है कि गुणात्मक इन परीक्षणों की क्षमता का प्रदर्शन वर्णन करता है।

बँटवारा के दौरान, जब द्विध्रुवी धुरी इकट्ठा किया है, कोशिकाओं के रूप में मानव कोशिकाओं के लिए मापा जाता है, मोटे तौर पर 15 माइक्रोन की एक व्यास के साथ क्षेत्रों के लिए फार्म का दौर। यह विशेषता mitotic सेल आकार एक ज्यामितीय सीमा है कि दोनों प्रतिबंधित करता है और धुरी आकार और ओरिएंटेशन 35,36 को निर्देश प्रदान करता है। Microfluidic तकनीक, ज्यामितीय कारावास का एक स्तर है कि सही स्थिति जीवित कोशिकाओं में मनाया जैसा दिखता है और इसलिए इन विट्रो में mitotic स्पिंडल के नीचे अप पुनर्निर्माण परमिट प्रदान करते हैं।

(चित्रा -4 ए, बाएं पैनल) के भीतर फैलाना। के बारे में 20-30 मिनट के बाद, पहली सूक्ष्मनलिकाएं बनने दिखाई और केंद्रपिंड प्रसार के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं सभी दिशाओं में कोर्टेक्स के खिलाफ बढ़ने सीमित हो जाता है। मध्यवर्ती लंबाई (मोटे तौर पर छोटी बूंद व्यास का 50%) के साथ सूक्ष्मनलिकाएं asters कर सकते हैं (sterically) प्रत्येक एक और, एक दूसरे को, अन्य centrosomes और कोर्टेक्स के खिलाफ जोर दे सूक्ष्मनलिकाएं साथ पीछे हटाना। यह एक विशिष्ट 'द्विध्रुवी' धुरी की तरह एक दूसरे को (चित्रा -4 ए, मध्यम पैनल) का विरोध कर दो centrosomes के साथ व्यवस्था में यह परिणाम है। जब सूक्ष्मनलिकाएं से छोटी बूंद-व्यास का ~ 50% लंबी नहीं हो पातीमीटर, centrosomes छोटी बूंद कोर्टेक्स (चित्रा -4 ए, सही पैनल) के साथ बढ़ रही है सूक्ष्मनलिकाएं के साथ छोटी बूंद के विरोध सीमाओं को आगे धकेल दिया हो। यह ध्यान रखें कि इन assays में microtubule विकास दर दोनों तापमान और tubulin-सांद्रता के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं महत्वपूर्ण है। इन मानकों इसलिए दृढ़ता से समय को प्रभावित करेगा जब nucleation पहले मनाया जाता है और जब स्थिर राज्य एस्टर पदों पर पहुँच रहे हैं।

कोशिकाओं में, cortical खींच बलों microtubule प्लस समाप्त होता है और कॉर्टेक्स-जुड़े dynein के बीच लोड असर अनुलग्नकों के गठन के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। पशु कोशिकाओं में, इस संघ Gαi / LGN / नूमा जटिल है, जो Gαi 1 के एन टर्मिनल myristoylation के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को निशाना बनाया जाता है पर निर्भर करता है। इन पुनर्गठन assays में Gαi / LGN / नूमा परिसर की आवश्यकता के माध्यम से सीधे biotinylated लिपिड dynein युग्मन द्वारा नजरअंदाज कर रहा हैबायोटिन streptavidin बायोटिन परिसरों के गठन। ये बांड अपेक्षाकृत स्थिर (कश्मीर डी ~ 10 -14 एम) 37 कर रहे हैं और तेजी से फार्म (आमतौर पर पायस छोटी बूंद गठन के बाद 10 मिनट के भीतर, इससे पहले microtubule nucleation स्पष्ट हो जाता है) (चित्रा 4 बी)। Cortical dynein की उपस्थिति में, centrosomes आम तौर पर, एक और अधिक केंद्रीय स्थिति बनाए रखने के लिए, जबकि dynein के अभाव में, centrosomes छोटी बूंद कोर्टेक्स (चित्रा 4C) की विपरीत दिशा में धकेल रहे हैं। हम कारण यह दो प्रभाव है, जो रोकने और microtubule धक्का बलों प्रतिक्रिया का परिणाम है। (1) dynein सीधे microtubule आपदाओं, जिससे microtubule लंबाई सीमित और अत्यधिक microtubule buckling को रोकने, और (2) cortical खींच बलों व्यक्ति asters 8, जो एस्टर-एस्टर प्रतिकर्षण बलों प्रतिक्रिया पर शुद्ध एकत्रित बलों के नेतृत्व को बढ़ावा देता है।

प्रसारण पार linker Ase1 लाती चorces कि जाते हैं विरोधी समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं 29 के अतिव्यापी क्षेत्र बढ़ाने के लिए। इस के साथ संगत, Ase1 की उपस्थिति (और dynein के अभाव) में centrosomes करीब एक साथ पाए जाते हैं Ase1 interpolar सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 4D) बंडल करने के लिए स्थानीयकरण के साथ। kinesin -5 परिवार के सदस्य धुरी के भीतर से धक्का बलों प्रदान करके केंद्रपिंड जुदाई ड्राइव (परिचय देखें)। Cut7 (एस pombe kinesin -5 ortholog) की उपस्थिति में, centrosomes, पायस बूंदों के विपरीत दिशा में धकेल रहे हैं यहां तक कि Ase1 (चित्रा 4E) की उपस्थिति में। cortical और अंतर-ध्रुवीय बल जनरेटर के संयोजन से, जटिलता का स्तर आगे इन प्रयोगों में बढ़ाया जा सकता है, अंत में द्विध्रुवी mitotic धुरा विधानसभा की एक व्यापक समझ के लिए अग्रणी। इन परिणामों की एक विस्तृत मात्रात्मक विवरण भविष्य में उपलब्ध हो जाएगा (रोथ एट अल।, तैयारी में पांडुलिपि)।

(चित्रा 5C) के लिए केंद्रीकृत के माध्यम से स्वतंत्र रूप से diffusing centrosomes से एस्टर विधानसभा और स्थिति की निगरानी (0 मि।) की अनुमति देता है (12 मि।)। यह दोनों स्थिर राज्य व्यवहार और धुरी विधानसभा कैनेटीक्स के अध्ययन की सुविधा। एक ही नमूने में विभिन्न सामग्री के साथ बूंदों के संयोजन से, यह उदाहरण के लिए, यदि संभव हो सीधे केंद्रपिंड स्थिति और धुरी विधानसभा कैनेटीक्स बूंदों के साथ और cortical बल जनरेटर के बिना (चित्रा 5 ब) की तुलना करने के लिए है।


चित्रा 1: बलों mitotic धुरा पर अभिनय कई बल पैदा अणुओं mitotic धुरी धुरी गठन और स्थिति को बढ़ावा देने के सूक्ष्मनलिकाएं पर काम करते हैं।। सूक्ष्मनलिकाएं कि सेल कोर्टेक्स के रूप में विकसित केंद्रपिंड पर एक धक्का बल उत्पन्न करते हैं। Cortical dynein (बैंगनी) depolymerizing सूक्ष्मनलिकाएं कब्जा है और centrosomes पर एक खींच बल उत्पन्न करता है। धुरी के भीतर, kinesin-5 / Cut7 मोटर प्रोटीन, विरोधी समानांतर सूक्ष्मनलिकाएं पर एक जावक फिसलने बल प्रदान करते हैं, जबकि PRC1 / Ase1 परिवार के पार linkers एक जावक बल रपट का विरोध उत्पन्न करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2
चित्रा 2:। Microfluidic चिप डिजाइन (ए) 4 इंच 4 microfluidic चिप्स युक्त photomask के डिजाइन। (बी) के एक चिप की विस्तृत प्रतिनिधित्व। चिप्स एक आउटलेट चैनल और तीन इनलेट चैनल के एक धूल फिल्टर द्वारा पीछा होते हैं। इनलेट चैनल 1 पानी चरण होता है, लिपिड / तेल चरण और चैनल 3 2 चैनल अतिरिक्त लिपिड / तेल चरण के साथ बनाई बूंदों को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (सी) जंक्शन जहां लिपिड / तेल चरण (ऊपर और नीचे से आ रही) पानी चरण (बाएं से आ रही है) के साथ मिलता है की विस्तृत प्रतिनिधित्व। जंक्शन पर, बूंदों के रूप में और सही पर आउटलेट चैनल की ओर बहेगा। (डी) 2 माइक्रोन चैनल के साथ एक धूल फिल्टर की विस्तृत प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। पानी में तेल पायस छोटी बूंद गठन के लिए क्रियाविधि (ए) microfluidic चिप और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर microfluidics ट्यूबिंग। दोनों पानी और लिपिड / तेल चरण नलियों क्रमश: चिप inlets 1 और 2 से जुड़े हैं। (बी) microfluidics चिप जहां पानी और लिपिड / तेल चरणों को पूरा करने पर प्रतिबंध। दबावों बदल रहा है, बूंदों के आकार को नियंत्रित किया जा सकता है। (सी) PDMS लेपित प्रवाह कोशिकाओं के डिजाइन। प्रवाह सेल में बूंदों लोड करने के बाद, खुले सिरों अतिरिक्त Valap के साथ बंद हो जाती हैं। (डी) छोटी बूंद गठन के योजनाबद्ध। बूंदों centrosomes, ट्यूबिलिन और mitotic धुरा गठन के लिए आवश्यक अतिरिक्त घटकों encapsulate करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (ई) cortical-dynein लक्ष्य-निर्धारण के योजनाबद्ध। Biotinylated (बायो) dynein streptavidin (strp) के माध्यम से biotinylated लिपिड करने का लक्ष्य है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। बढ़ती जटिलता के साथ धुरी-reconstitutions के प्रतिनिधि परिणाम (ए), लघु मध्यवर्ती, और लंबे समय सूक्ष्मनलिकाएं के उदाहरण दिखा दो centrosomes युक्त बूंदों की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों। Centrosomes और सूक्ष्मनलिकाएं 10% HiLyte-488 लेबल ट्यूबिलिन के अलावा द्वारा कल्पना कर रहे हैं। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। (बी) के अभाव में GFP बायोटिन dynein-TMR का स्थानीयकरण (-, बाएं) और streptavidin (strp) की उपस्थिति (+, दाएं)। Cortical GFP-बायोटिन dynein-TMR की उपस्थिति या (+, दाएं) - (ग) microtubule एस्टर अभाव में स्थिति (बाएं)। (डी) microtubule एस्टर (बाएं पैनल, जीआरeen) Ase1 की उपस्थिति में स्थिति (मध्यम पैनल, लाल)। (ई) microtubule एस्टर (बाएं पैनल, हरा) Ase1 और Cut7 (kinesin-5) (मध्यम पैनल, लाल) की उपस्थिति में स्थिति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: इन विट्रो में इमेजिंग एस्टर पोजिशनिंग डायनेमिक्स (ए) एक PDMS कप कई मानव संसाधन तक के लिए छोटी बूंद इमेजिंग की अनुमति देता है कि डिजाइन।। (बी) के उत्पादन, भंडारण और बूंदों की इमेजिंग (प्रेषित) विभिन्न सामग्री, फ्लोरोसेंट dextran की अनुपस्थिति (बाएं) शामिल किए जाने (दाएं) (एलेक्सा 647) से यह साफ होता है। (सी) एक 60 मिनट का समय व्यतीत हो जाने के एक विमान छवियों (2 मिनट के अंतराल) विज्ञापन का एक Z ढेर (2 माइक्रोन दूरी) से ली गईएक भी केंद्रपिंड युक्त roplet। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

विधियों के पानी में तेल पायस बूंदों में बुनियादी mitotic स्पिंडल पुनर्गठित करने के लिए यहां उपस्थित हाल के प्रयासों का वर्णन किया। ज्यामितीय सीमाओं के भीतर धुरी विधानसभा के अध्ययन के अनेक लाभ प्रदान करता है। महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया तंत्र mitotic धुरी के सूक्ष्मनलिकाएं और ज्यामितीय बाधाओं जिसमें वे इकट्ठा कर रहे हैं के बीच मौजूद हैं। सूक्ष्मनलिकाएं बलों को आगे बढ़ाने के लिए जब वे ज्यामितीय सीमाओं, जो mitotic धुरा विस्थापन में परिणाम कर सकते हैं के रूप में विकसित उत्पन्न कर सकते हैं। इसके अलावा, एक शारीरिक बाधा में बढ़ microtubule आपदाओं के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, एक सीमित ज्यामिति के भीतर धुरी विधानसभा में इस तरह के tubulin के रूप में अलग-अलग घटकों, जो बारी में सीधे microtubule विकास दर को प्रभावित करता है 36 के एक क्रमिक कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। ये धुरी विधानसभा की सभी आवश्यक निर्धारकों, जो assays यहाँ वर्णित का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।

वर्णित assays छोटे एकाग्रता विभिन्न करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैंछोटी बूंद घटकों के NCES। इस tubulin, जहां नाबालिग एकाग्रता मतभेद या तो बहुत धीमी गति से या बहुत तेजी से microtubule विकास में परिणाम कर सकते हैं के लिए मामला है। इस मामले में, microtubule विकास दर अक्सर अभी भी प्रयोग के पहले ~ 30 मिनट के दौरान तापमान समायोजन करके सुधारा जा सकता है। Mitotic धुरा विधानसभा और स्थिति भी (cortical) बल जनरेटर की एकाग्रता में बदलाव करने के लिए बहुत संवेदनशील है। यह एकाग्रता, पवित्रता और शुद्ध घटकों की गतिविधि पर निर्भर होने की संभावना है और हर हाल में शुद्ध प्रोटीन के लिए ध्यान से titrated किया जाना चाहिए।

इसके अलावा, कुछ व्यापार-नापसंद परख की प्रकृति पर निर्भर करता है इमेजिंग सेटिंग्स में किए जाने के लिए है। प्रारंभ में, घुलनशील फ्लोरोसेंट ट्यूबिलिन dimers के उच्च स्तर पर यह छवि व्यक्तिगत सूक्ष्मनलिकाएं करने के लिए कठिन बनाते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं लंबी नहीं हो पाती और घुलनशील tubulin धीरे-धीरे समाप्त हो गया है के रूप में, संकेत करने वाली शोर अनुपात धीरे-धीरे उच्च हो जाता है और individu की इमेजिंग की अनुमति देता हैअल सूक्ष्मनलिकाएं। खुली प्रणाली के साथ setups के विपरीत, ज्यामितीय कारावास, एक थोक जलाशय के भीतर फ्लोरोसेंट अणु और ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली घटकों के आदान-प्रदान को रोकता महत्वपूर्ण विरंजन में जिसके परिणामस्वरूप। विशेष रूप से समय के साथ धुरी विधानसभा और स्थिति की निगरानी के लिए, यह कम रोशनी की तीव्रता के साथ छवि के लिए आवश्यक है, यह भी एक शक्तिशाली ऑक्सीजन मेहतर प्रणाली की उपस्थिति में।

इन तरीकों में इन विट्रो में सरलीकृत धुरी की तरह संरचनाओं के नीचे अप पुनर्गठन सक्षम करें। घटकों यहां पेश करने के अलावा, कई अन्य कारकों द्विध्रुवी धुरी गठन, स्थिति, अभिविन्यास, आकार देने, आदि 3 प्रभावित करने के लिए वर्णित किया गया है। इस प्रणाली को आगे अतिरिक्त बल जनरेटर के व्यक्तिगत और संयुक्त प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। कि वर्तमान में इस प्रणाली से अनुपस्थित रहे हैं धुरी गठन के लिए महत्वपूर्ण योगदान mitotic गुणसूत्रों हैं। Mitotic क्रोमेटिन दिखाया गया है(1) chromokinesins प्रत्यक्ष धुरी गठन उत्पन्न कर सकते हैं तथाकथित 'ध्रुवीय-इजेक्शन ताकतों' 3, (2) क्रोमेटिन बाध्य RanGEF RCC1 38 से एक RanGTP ढाल के गठन, (3) गुणसूत्रबिंदुओं कि (depolymerizing के साथ बातचीत कर सकते हैं ) सूक्ष्मनलिकाएं 39 और (4) क्रोमेटिन ही है, जो विरोध कर सूक्ष्मनलिकाएं 40 के बीच में एक यांत्रिक वसंत के रूप में कार्य कर सकते हैं।

अंत में, वर्णित प्रणाली वर्तमान गतिविधि पर सीमित अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण और शुरू बल-जनरेटर का स्थानीयकरण प्रदान करता है। कोशिकाओं में, कई धुरी विधानसभा कारकों विशिष्ट डिब्बों को स्थानीय बनाना या एक प्रतिबंधित समय खिड़की के भीतर सक्रिय हैं। एक हड़ताली उदाहरण dynein की गतिविधि है, जो विशेष रूप से सी के पीछे की ओर से समृद्ध है एलिगेंस एक सेल चरण भ्रूण विषम धुरी स्थिति और कोशिका विभाजन को बढ़ावा देने के लिए। इस प्रणाली में, हम वर्तमान में ऐसी टी नकल उतार की संभावना तलाश रहे हैंemporal और विषम गतिविधि का उपयोग तरीकों ऑप्टो आनुवंशिक तकनीक से उधार लिया। इसके अलावा, के रूप में सी के लिए मामला है एलिगेंस भ्रूण और एक कठोर सेल की दीवार के साथ कोशिकाओं, कई कोशिकाओं बँटवारा में ऊपर दौर नहीं है। ज्यामितीय कारावास की आकृति बलों धुरी 41 पर अभिनय पर एक मौलिक प्रभाव पड़ेगा। इसलिए यह धुरी विधानसभा और गैर गोलाकार बूंदों में स्थिति को पुनर्गठित करने के साथ ही, संभवतः अधिक जटिल microfluidic प्रणाली है कि आकार देने की अनुमति है और पायस के भंडारण बूंदों 42,43 का उपयोग कर महत्वपूर्ण होगा। अंत में, ऊतकों में, सेल सेल और सेल सब्सट्रेट संकेतन और लगाव बाहरी संकेत है कि निर्देशित धुरी उन्मुखीकरण में अनुवाद किया जा सकता है, प्रदान के रूप में अक्सर उपकला कोशिकाओं में मनाया जाता है और स्टेम कोशिकाओं। इन विशिष्ट पहलुओं के सभी खाते में इस मौजूदा अध्ययन में नहीं लिया गया है और mitotic धुरा assemb से अधिक में विवो तरह reconstitutions की दिशा में बनाने के लिए भविष्य की चुनौतियों प्रदान हो सकता हैLy और स्थिति।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Preparation of microfluidic chips
Photomask (Photomask on film substrate) Selba S.A. Switzerland
SU-8 3025 MicroChem
Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) WRS Materials 4P0SSP-005
Spin coater  Polos SPIN150I
PDMS pre-polymer RVT615 A+B Lubribond 9481
Corona treater Electro-technic products BD-20ACV
2. Microfluidic setup
Name Company Catalog Number Comments
DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) Avanti Polar Lipids 840035
Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) Avanti Polar Lipids 870285
Chloroform Sigma-Aldrich 650498
Glass pipets
Glass tubes
Vacuum pump Laboport KNF
Vacuum chamber Kartell Polypropylene Vacuum Desiccator
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Surfactant (Span80) Sigma-Aldrich 85548
Sonicator Branson M2800H
Coverslips 24 mm x 60 mm, thickness 1.5
Glass-slides 26 mm x 76 mm
Puncher Harris Uni-Core 135840/135841/135843
Laboratory sealing film Parafilm
Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) Home made
Brightfield Microscope Leica PMIRB  Any inverted brightfield would suffice
Pressure controler Fluigent MFCS-FLEX-4C-1000
PEEK Tubing Cluzeau Info. Labo, France
Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) VWR, The Netherlands
3. Reconstituting spindle formation and positioning
Name Company Catalog Number Comments
Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) Life Technologies
Tween-20 Sigma-Aldrich
BSA - Bovine serum albumin Sigma-Aldrich
Glucose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) Sigma-Aldrich G6125
DTT (DL-dithioltheitol) Sigma-Aldrich 646563
Catalase (Catalase form bovine liver) Sigma-Aldrich C9322
Tubulin (Tubulin from bovine brain) Cytoskeleton Inc.
Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) Cytoskeleton Inc.
GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) Sigma-Aldrich 51120
κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) Sigma-Aldrich C0406
Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) Beckman-Coulter CLS
4. Introducing spindle-assembly factors
Name Company Catalog Number Comments
Neutravidin Sigma-Aldrich A2666
ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) Sigma-Aldrich A9187
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) Sigma-Aldrich P0564
PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) Sigma-Aldrich P0294

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References

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Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets. J. Vis. Exp. (114), e54278, doi:10.3791/54278 (2016).

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