Introduction
Durante la mitosis, los cromosomas del genoma replicado se organizan en el ecuador celular para asegurar la distribución equitativa de las cromátidas hermanas sobre las células hijas recién formadas. posicionamiento y la segregación cromosómica está mediada por su unión a los microtúbulos del huso se originan a partir de dos centrosomas opuestos. Además de garantizar la distribución cromosómica fieles, la orientación del huso mitótico también dicta el plano de división celular 1. Coordinado orientación de la división celular es esencial durante muchas etapas de desarrollo y para la homeostasis del tejido 2. Específicamente, regulado mitótico husillo de posicionamiento puede resultar en la distribución asimétrica de contenidos celulares, o incluso producir células hijas de diferentes tamaños 2. Ensamblaje del huso mitótico y la orientación comienza en la profase y está orquestada por una compleja interacción entre cooperar y antagonizar fuerza generadores 3,4. Las fuerzas generadas consisten en btirar y empujar fuerzas OTH. Estas fuerzas se originan tanto desde los contactos de huso con la corteza celular, así como desde el interior del husillo, y pueden ser generados por la dinámica de microtúbulos, así como por motores moleculares y reticulantes (Figura 1).
fuerzas de empuje se pueden generar cuando microtúbulos crecen contra estructuras rígidas tales como la corteza celular. Dependiendo de la fuerza de resistencia total generado dentro del sistema, esto puede resultar en el reposicionamiento del huso mitótico (fuerzas bajas) o desencadenar el pandeo de los microtúbulos o catástrofe (altas fuerzas) 5-8. La cantidad de fuerza que se puede generar empujando depende de la longitud de los microtúbulos, ya que la longitud es un fuerte determinante de microtúbulos pandeo 9. Además, los microtúbulos que se originan de un centrosoma pueden empujar contra el otro centrosoma, un mecanismo que se ha sugerido para impulsar la separación del centrosoma a principios de la profase 3,10.
En anunciocondición para empujar las fuerzas generadas por los microtúbulos en crecimiento, los microtúbulos termina en contacto con la corteza celular también puede mediar fuerzas de tracción 11. Estudios de varios laboratorios han demostrado que se requiere la actividad controlada de generadores de fuerza corticales para el posicionamiento asimétrico de husos mitóticos in vivo 1. Esencial para estas fuerzas de tracción es Cortex-localizada dineína citoplasmática (en lo sucesivo, "dineína '), una menos de fin de microtúbulos dirigida proteína motora 8,12,13. Por ejemplo, en la levadura en ciernes, interacciones laterales de dineína cortical con el resultado de celosía de los microtúbulos en los microtúbulos motor dependiente de deslizamiento a lo largo de la corteza 14. Sin embargo, fuerzas de tracción corticales también se pueden generar por la capacidad de dineína para formar accesorios de extremo-a despolimerización de microtúbulos 8. La energía generada por la contracción de los microtúbulos puede dar lugar a fuerzas que son generalmente de un orden de magnitud mayor (~ 50 pN (referencia 15 16)). Final en la unión de la dineína cortical a los microtúbulos depolymerizing promueve el posicionamiento del cabezal en la levadura en ciernes 17 y C. elegans 13. Ya sea tanto dependiente del motor, deslizamiento y microtúbulos despolimerización expulsado a las fuerzas de tracción corticales pueden cooperar o se excluyen mutuamente en vivo es desconocida en la actualidad.
Además de fuerzas de empuje de los microtúbulos y fuerzas de tracción corticales de dineína mediada por, el posicionamiento centrosoma se controla desde el interior del huso mitótico por numerosas otras proteínas. Kinesin-5 motores, por ejemplo, existen como tetrámeros que pueden cruzar de enlace de microtúbulos antiparalelos interpolares, lo que resulta en la generación de las fuerzas de deslizamiento hacia afuera 18-20. Se requiere que los miembros de la familia de motor kinesin-5 para la separación del centrosoma y montaje de huso bipolar en todos los eucariotas estudiados, con la excepción de C. elegans (revisado en referencia 21).
Además, también se conocen difusibles reticulantes de la familia / PRC1 ASE1 para localizar a la superposición de las regiones de los microtúbulos de microtúbulos interpolares in vivo e in vitro 22-27. Las fuerzas generadas por la expansión impulsada por ASE1 de la zona de solapamiento microtúbulos son lo suficientemente grandes para contrarrestar la quinesina-14 fuerzas de deslizamiento mediadas in vitro 28,29. En las células, se requiere ASE1 / PRC1 para la formación estable de la superposición de las regiones de los microtúbulos en el huso midzone 25-27,30, lo que sugiere que las fuerzas generadas por difusibles reticulantes pueden contribuir significativamente a la organización del husillo. Por último, las fuerzas de la cromatina mitótico y cinetocoros influyen ensamblaje del huso mitótico y posicionamiento a través de diversas vías 3. Dado que estos componentes no son parte de los ensayos de reconstitución que se describen aquí, no se discutirán en detalle.
jove_content "> Existen diferentes teorías sobre cómo los diferentes componentes moleculares y las fuerzas descritas anteriormente cooperan en conjunto del husillo y el posicionamiento, pero aún están lejos de una comprensión cuantitativa. Además de los experimentos en células vivas, los experimentos in vitro con componentes purificados proporcionan una poderosa ruta para ayudar a alcanzar este objetivo. Aquí presentamos una guía visual para una versión adaptada y extendida de los métodos publicados recientemente (Roth et al. 31), en el que los husillos básicos se reconstituyen en gotitas de emulsión de agua-en-aceite, comenzando con una número mínimo de componentes. Usando técnicas de microfluídica, gotas esféricas se generan con tamaños que son comparables a las células mitóticas. Dentro de estas gotas, centrosomas purificadas y tubulina se pueden combinar con el fin de estudiar la dinámica de aster microtúbulos, generación de fuerzas y aster-aster interacciones. Por introducir corticales (como dineína) e inter-polares (tales como kinesin-5 / ASE1) de fuerza generadores, nosreconstituir estructuras de huso como cada vez más complejos que comienzan a parecerse a la situación in vivo.Protocol
1. Preparación de chips microfluidos
NOTA: Para el estudio de abajo hacia arriba del conjunto del husillo, se utilizan gotas de la emulsión esféricas de agua en aceite. Estos son microgotas acuosas separadas de la fase de aceite que rodea por una monocapa de fosfolípidos y tensioactivos. Estos emulsión gotitas se producen dentro de polidimetilsiloxano de microfluidos chips (PDMS). Los cambios en las geometrías de canal y las velocidades de flujo se pueden utilizar para sintonizar tamaño de las gotas. En el diseño de microfluidos se describe aquí, las gotitas se generan con un diámetro de aproximadamente 15 micras para imitar el confinamiento geométrico de una célula mitótica de los mamíferos.
- Fotomáscara Diseño y fabricación de moldes
- Diseñar una fotomáscara que contiene tres canales de entrada 31. 1 canal de entrada se conecta a la fase acuosa, que contiene el contenido de gotitas (véase la sección 3 "Reconstitución de ásteres de microtúbulos básicos"). canal de entrada 2 se conecta a la fase de aceite (ver sección 2.1 "de lípidos / aceite-phaSE preparación "). Utilice el canal de entrada 3 para diluir la emulsión con gotitas / aceite-fase lipídica adicional antes de la observación (opcional) (Figura 2a-b).
NOTA: Todos los canales de entrada vienen seguidas de un polvo de filtro (un laberinto de canales 2 micras) para atrapar el polvo, partículas y agregados (PDMS-proteína) y para evitar que bloqueen los canales de microfluidos (Figura 2d). Los canales son de 75 micras de ancho y la reunión de lípidos / fase oleosa y la fase acuosa en un amplio cruce de 12,5 micras, donde la emulsión se formarán gotas (Figura 2c). - El orden y la obtención de máscaras impresas sobre un sustrato de película, con una polaridad negativa (la fotomáscara será oscuro con estructuras diseñadas transparentes).
- Diseñar una fotomáscara que contiene tres canales de entrada 31. 1 canal de entrada se conecta a la fase acuosa, que contiene el contenido de gotitas (véase la sección 3 "Reconstitución de ásteres de microtúbulos básicos"). canal de entrada 2 se conecta a la fase de aceite (ver sección 2.1 "de lípidos / aceite-phaSE preparación "). Utilice el canal de entrada 3 para diluir la emulsión con gotitas / aceite-fase lipídica adicional antes de la observación (opcional) (Figura 2a-b).
- fabricación de moldes
- Fabricar moldes por-recubrimiento por rotación SU-8 3025 fotorresistente sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas utilizando un spin-coater (500 rpm, 10 seg, seguido de 1.800 rpm, 45 seg) en un entorno de sala limpia.
- Exponer el SU-8 recubiertooblea de silicio a través de la fotomáscara. Desarrollar obleas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para crear canales de ~ espesor 40 micras.
- Hacer un chip de microfluidos
- Mezclar 10 partes PDMS pre-polímero con agente de curado de 1 parte (en total ~ 40 gr) en un recipiente de barco como el uso de una espátula de plástico. Lugar de PDMS que contienen buque barco-como en una cámara de vacío durante ~ 30 min. para eliminar las burbujas de aire. Envolver papel de aluminio alrededor del molde para formar una taza con ~ 1 cm erectos bordes.
- Verter el PDMS (~ 75% del volumen total) en el molde, dejar en una cámara de vacío para otro ~ 30 min. (Para eliminar las burbujas de aire) y curar durante 1 hora a 100 ° C en un horno.
- Spin-capa de PDMS los restantes en portaobjetos de vidrio (5 seg a 200 rpm seguido por 30 segundos a 4.000 rpm), seguido por curado durante 1 hora a 100 ° C. Eliminar el polvo del portaobjetos de cristal utilizando aire comprimido / N 2 -flow, limpieza previa no es necesaria.
NOTA: Los portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS se pueden utilizar tanto para micrófonoviruta rofluidic y la producción de células de flujo (véase también 2.2). - tira suavemente de los PDMS fuera del molde usando una cuchilla de afeitar y perforar agujeros (0,5 mm para las entradas, 0,75 mm para salida) .Corona-tratar el chip microfluídico y un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS utilizando un tratador de corona superficie laboratorio durante unos segundos .
- Coloque el chip de microfluidos en el portaobjetos de vidrio (canales hacia abajo) y cocer las patatas fritas o / n a 100 ° C (Figura 3a). Almacenar chips de microfluidos durante varios meses en un ambiente libre de polvo.
2. Configuración de microfluidos
NOTA: El agua-en-aceite gotitas de la emulsión se generan utilizando una configuración de microfluídica y los chips de microfluidos descritos anteriormente. La composición de la / aceite-fase lipídica se puede variar dependiendo de los requisitos experimentales. lípidos de aceite-solubilizado formarán una monocapa en la interfase agua-aceite con sus polares de cabeza grupos que enfrenta el agua en el interior. Con el fin de proteínas diana(Por ejemplo, la dineína) hasta el límite de las gotas, (biotinil-PE) lípidos se puede añadir pequeñas cantidades de biotinil-fosfatidiletanolamina. Esto permite que el reclutamiento de dineína biotinilado (ver sección 4.1 "Dynein la orientación a la corteza gotita") a través de multimerización mediada estreptavidina. Las gotitas se estabilizan mediante la adición de un agente tensioactivo y se almacenan en las células de flujo PDMS recubiertos.
- Lípido / aceite en fase de preparación
- Mezclar cloroformo-disuelto 1,2-dioleoyl- sn- glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS) y los lípidos biotinil-PE en una relación molar 4: 1 en un tubo de vidrio utilizando pipetas de vidrio (ampliamente enjuague pipetas con cloroformo antes utilizar). Preparar un total de ~ 250 g de lípidos, resultando en una concentración de lípidos de ~ 0,5 mg / ml.
- Secar cuidadosamente la mezcla de lípidos con N 2 -flow y posteriormente en una cámara de vacío para ~ 1 hr. Disolver los lípidos secos en aceite mineral y 2,5% de tensioactivo a 0,5 mg / ml (hacer ~ 500 l).
- Coloque la muestra de lípidos / aceite en unabaño de ultrasonidos y sonicar durante 30 min. a 40 kHz para disolver completamente los lípidos.
- Preparación de células de flujo
- PDMS spin-coat (véase también la sección 1.3) sobre cubiertas de vidrio (5 seg a 200 rpm seguido por 30 segundos a 4.000 rpm) y portaobjetos de vidrio (5 seg a 100 rpm seguido por 30 seg 1.500 rpm) con el fin de depositar la capa homogénea de PDMS.
NOTA: Para obtener una calidad de imagen óptima, asegúrese de utilizar cubiertas de vidrio con un espesor que coincide con el objetivo del microscopio. En este caso: 1.5 (~ 0,17 mm). - Curar las cubiertas de vidrio recubiertas PDMS y portaobjetos de vidrio durante 1 hora a 100 ° C en un horno. Hacer las células de flujo espaciando cerca (~ 2 mm) lonchas finas de lámina de sellado de laboratorio (~ 3 mm de ancho) en el cristal toboganes PDMS recubiertos. Cuando se almacena en un entorno libre de polvo, los canales que no han sido utilizados se pueden utilizar en otros momentos.
- Frente al flujo de células con un cubreobjetos recubierto de PDMS y la junta de sellado por fusión del laboratorio de cine ~ 1 min. a 100 ° C, pulsesuavemente (Figura 3c). Cierre la película de sellado de laboratorio -vidrio-límites con valap (Figura 3c). flujo células de varios meses en un ambiente libre de polvo tienda.
- PDMS spin-coat (véase también la sección 1.3) sobre cubiertas de vidrio (5 seg a 200 rpm seguido por 30 segundos a 4.000 rpm) y portaobjetos de vidrio (5 seg a 100 rpm seguido por 30 seg 1.500 rpm) con el fin de depositar la capa homogénea de PDMS.
- PDMS Copa Preparación
- Para imágenes a largo plazo, hacer una taza de PDMS, por la perforación de un agujero de 4 mm de diámetro en una rebanada de PDMS (~ 3 mm de espesor)
- Corona-tratamiento de la rebanada de PDMS y una cubierta de vidrio revestida de PDMS y colocarlos en la parte superior de uno al otro. Hornear la copa PDMS o / n (a 100 ° C) (Figura 5a).
- Formación de la emulsión de gotitas
- Supervisar la formación de gotas en un microscopio de campo brillante invertida. Conectar el controlador de presión al chip microfluídico utilizando tubos de PEEK (diámetro: 510 mm (exterior) y 125 m (interior)) (Figura 3a). Llenar completamente chips de microfluidos con lípidos / aceite de la fase de entrada 2.
- Introducir fase acuosa a base de MRB80 (ver sección 3 "Reconstitución de ásteres de microtúbulos básicos4;) de la entrada 1. Control de gotitas de tamaño por el cambio de las presiones de lípidos / aceite de la fase y de fase de agua para crear gotitas de ~ 15 m de diámetro (Figura 3b).
NOTA: El uso de esta configuración, utilice ~ 800 mbar para el lípido / aceite de fase y ~ 200 mbar durante la fase de agua para crear gotitas del tamaño deseado. - Después de obtener la gota de tamaño deseado y la cantidad requerida (~ 10 l por muestra), recoger las gotas de canal de salida y la carga en la celda de flujo (llenar la celda de flujo completo).
- Cerrar los extremos de la celda de flujo utilizando cuidadosamente valap (incompletamente células de flujo cerradas pueden dar lugar a un extenso movimiento de las gotitas, lo que dificulta la imagen ellos). Además, evitar la formación de burbujas de aire que resulta en el movimiento de las gotas.
- Enjuagar los tubos de PEEK extensamente con isopropanol antes y después de su uso para evitar que muestra la contaminación cruzada y la obstrucción.
3. reconstituir básicos microtúbulos Aster
NOTA: El contenido gotitas respiratorias pueden variarse dependiendo de los requerimientos experimentales. Todos los tampones son-MRB80 base (80 TUBOS mM, EGTA 1 mM, 4 mM MgCl 2 (pH 6,8)), y todas las muestras se preparan en hielo. En general, las gotas siempre contienen centrosomas, componentes requeridos para la polimerización de microtúbulos, un sistema depurador de oxígeno y agente de bloqueo (ver sección 3.1). fuerza-generadores de microtúbulos y cofactores requeridos y de orientación-factores puede incluirse si se desea (ver secciones 4.1 y 4.2).
- Configuración general para la formación de aster en gotas de la emulsión (Figura 3d)
- Preparar la glucosa oxidasa (20 mg / ml de glucosa oxidasa en la TDT 200 mM y 10 mg / ml de catalasa) mezcla con antelación y almacenar en pequeñas alícuotas a -80 ° C.
- Preparar una "mezcla de bloqueo» que contiene κ-caseína, albúmina de suero bovino (BSA), Tween-20 y dextrano fluorescente (como un marcador neutro) (ver Tabla 1) con antelación y almacenar en pequeña aliquots a -80 ° C. Prevenir los ciclos de congelación-descongelación. Asegurar que todos los componentes se preparan al momento.
- Purificar centrosomas de líneas de células linfoblásticas KE37 humanos como se describe por Moudjou et al. 32 y se almacena a -150 ° C en alícuotas pequeñas.
- Descongelar centrosomas a temperatura ambiente y se incuba a 37 ° C durante ~ 20 min. antes de su uso para asegurar la nucleación de microtúbulos adecuada.
NOTA: Esto promueve la nucleación de microtúbulos durante el experimento. - Por el momento, preparar 'mezcla de ensayo', que contiene tubulina (fluorescente y "oscuro"), guanosina trifosfato, un sistema de barrido de oxígeno (GTP) (glucosa, glucosa-oxidasa, catalasa y 1,4-ditiotreitol (DTT)), generadores de fuerza molecular (por ejemplo, motores de microtúbulos / reticulantes), trifosfato de adenosina (ATP) y un sistema ATP-regeneración (fosfoenolpiruvato (PEP), piruvato quinasa (PK) y lactato deshidrogenasa (LDH)) sobre hielo (ver Tabla 2).
- Pre-enfriar elrotor Airfuge en hielo. Centrifugar la muestra en el rotor enfriado Airfuge (30 psi durante 3 min) .Add centrosomas pre-calentadas (optimizar la cantidad de centrosomas apuntar a gotitas que contienen 1-2 centrosomas).
- Usar la mezcla combinada para producir gotas de la emulsión usando los métodos descritos en la sección 2.3.
| Componente | de la concentración | Concentración final (en el ensayo) | Volumen | Comentario |
| Dextrano-647nm | 75 M | 3.75 uM (0,6 M) | 5 l | |
| κ-caseína | 20 mg / ml | 12,5 mg / ml (2 mg / ml) | 62,5 l | |
| Tween-20 | 5% | 0,375% (0,06%) 7,5 l | ||
| BSA | 200 mg / ml | 12 mg / ml (1,9 mg / ml) | 6 l | |
| MRB80 | 19 l | |||
| 100 l definitiva | Almacenar en 2 ml de alícuotas |
Tabla 1: Los componentes de 'bloqueo Mix' Constituyentes de la mezcla bloqueo, necesarios para la reconstitución de las estructuras de huso como en gotas de la emulsión de agua en aceite.. Para la descripción, véase la sección texto principal 3 "Reconstitución de ásteres de microtúbulos básicos". Para más detalles sobre los materiales, consulte "Tabla de Materiales.
| Componente | Stock concentrationorte | concentración final | Volumen | Comentario |
| El bloqueo de mezcla | 1,6 l | |||
| tubulina | 500 M | 30 micras | 0,6 l | |
| Tubulina-488/561 | 50 micras | 3 M | 0,6 l | |
| GTP | 50 mM | 5 mM | 1.0 l | |
| Dineína-TMR | 178 nM | 30 nM | 1,7 l | |
| estreptavidina | 5 mg / ml | 200 nM | 0,4 l | Para cortical solamente Dynein |
| Kinesin-5 | 1,6 mM | 80 nM | 0,5 l | |
| ATP | 25 mM | 1 mM | 0,4 l | Para los motores sólo se |
| ENERGÍA | 0,5 M | 25,6 mM | 0,5 l | Para los motores sólo se |
| PK / LDH | 800 U / 1100 U | 23 U / U 32 | 0,3 l | Para los motores sólo se |
| ASE1-GFP | 400 nM | 80 nM | 2.0 l | |
| Glucosa | 2,5 M | 50 mM | 0,3 l | Último paso |
| La glucosa-oxidasa | 50x | 1.0x | 0,3 l | Último paso |
| MRB80 | x | |||
| 9 l definitiva |
Tabla 2: Constituyentes de 'Ensayo Mix'. Tabla de Materiales.
4. La introducción de husillo de montaje-factores
NOTA: En los ensayos descritos aquí, una proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados versión truncada de S. se utilizó cerevisiae dineína que se dimeriza artificialmente por medio de una glutatión S-transferasa amino-terminal (GST) -tag 33. Esta proteína se purificó a través de una etiqueta de afinidad que contiene dos copias de la proteína un dominio de unión a IgG. La variante usada aquí se etiqueta con una etiqueta tetrametilrodamina (TMR) en el carboxi-terminal y la SNAP-tag N-terminal se utiliza para biotinilar las proteínas purificadas. Para más detalles construir, véase Roth et al. 31; para más detalles de purificación, ver Reck-Peterson et al. 33. GFP-biotina-dineína-TMR se puede dirigir a la gotita-corteza a través de la formación de complejos de biotina-estreptavidina que enlazan lípidos dineína a biotinil-PE (Figura 3E).
- Dineína Orientación a la corteza de la gotita
- Incluir GFP-biotina-dineína-TMR en la "mezcla de ensayo '(véase la Tabla 2) en una gotita-concentración final de 30 nM. Incluyen estreptavidina en "mezcla de ensayo '(véase la Tabla 2) en una gotita-concentración final de 200 nM.
NOTA: La dineína depende de la hidrólisis de ATP para el movimiento paso a paso en los microtúbulos. Por lo tanto, incluyen ATP y un sistema de regeneración de ATP (que contiene PEP y PK / LDH) en la "mezcla de ensayo '(véase la Tabla 2).
NOTA: de longitud completa recombinante S. pombe GFP-Cut7 (kinesin-5) fue proporcionado amablemente por el laboratorio Diez (Center for Molecular Bioingeniería, Universidad Técnica de Dresde, Dresden, Alemania), ver. Recombinante L Completaength marcado con histidina S. pombe GFP-ASE1 fue proporcionado amablemente desde el laboratorio Jansons (Universidad de Wageningen, Wageningen, Países Bajos) y se añade a la 'mezcla de ensayo' a concentraciones a las 80 nM.
- Incluir GFP-biotina-dineína-TMR en la "mezcla de ensayo '(véase la Tabla 2) en una gotita-concentración final de 30 nM. Incluyen estreptavidina en "mezcla de ensayo '(véase la Tabla 2) en una gotita-concentración final de 200 nM.
5. Imaging
NOTA: Durante el experimento, el crecimiento de los microtúbulos se puede controlar cambiando la temperatura. En la elección de las condiciones de formación de imágenes, las compensaciones tienen que hacerse entre las imágenes de alta calidad y la capacidad de supervisar el montaje del husillo durante largos periodos de tiempo. Para comparar la cinética de la formación del huso en diferentes condiciones, las gotas con diferentes contenidos se pueden mezclar y la imagen en el mismo canal de flujo.
- Ajustes de imagen básicos
- Image en un ambiente de temperatura controlada usando una cámara cerrada. Visualizar los microtúbulos individuales después de ~ 30 min a 26 ° C. Aunque la imagen, promover el crecimiento de los microtúbulos mediante el aumento de la temperatura hasta ~ 30 ° C.
NOTA: Los settings continuación son específicas de nuestra configuración de microscopio y pueden variar con diferentes sistemas y diferentes software operativo. Todos los ensayos descritos aquí son proyectados en un sistema invertido motorizado con una cabeza confocal de disco giratorio y operarán utilizando software de imágenes tales como Andor iQ 3.1. Obtener todas las imágenes con un objetivo de inmersión en aceite 100X y la cámara EMCCD. - Conjunto láseres de excitación 488, 561 y 641 nm y la intensidad más o menos ~ 10%. Ir al panel de 'adquisición', haga clic en la pestaña deslizante y láser del 'AOTF' intensidades al 10%. Haga clic en "record" para guardar la configuración.
- Para -projections z, tome las pilas con intervalos de 1 m (~ 20 imágenes / gotitas). Ir a la principal "cámara 'panel, haga clic en' Editar z 'y establecer' paso Z 'a 1,0. Haga clic en" siguiente "para guardar la configuración.
- Ajuste máximo lineal EM-ganancia haciendo clic en la pestaña "cámara" en el panel de 'adquisición' y deslice la barra de ganancia EM exposición a 300. Conjuntomomento a 200 mseg en la misma pestaña. Haga clic en "record" para guardar la configuración.
- Image en un ambiente de temperatura controlada usando una cámara cerrada. Visualizar los microtúbulos individuales después de ~ 30 min a 26 ° C. Aunque la imagen, promover el crecimiento de los microtúbulos mediante el aumento de la temperatura hasta ~ 30 ° C.
- imágenes en vivo
- Para imágenes en vivo, utilizando los controles de software hacen z -projections cada 2 min. durante la duración de 1 a 2 hr mediante la reducción de los tiempos de exposición a ~ 100 mseg. (como se describe en 5.1.4) y aumentar -intervalos z a 2 micras (como se describe en 5.1.3). Establecer las series de tiempo en el panel principal "cámara", haga clic en "repetición t 'y se puso a 2 min. intervalos para un tiempo total de 120 min.
- Para los ensayos en vivo, utilice una taza PDMS en lugar de una celda de flujo regular para asegurar que las gotitas son tan inmóvil como sea posible.
- Imagen combinada de 2 Condiciones
- Producir gotitas utilizando microfluídica y almacenar en la parte superior de un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS en hielo. Esto evita que la nucleación de microtúbulos hasta que se ha formado el segundo conjunto de gotas. Antes de producir el segundo conjunto de gotas, enjuague los tubos de PEEK y con chip de microfluidosMRB80 y llenar por completo el chip de microfluidos con el / aceite-fase lipídica.
- Generar gotas con y sin dextrano fluorescente (o el uso de dextrano con diferentes fluoróforos de longitud de onda) con el fin de discriminar entre las gotitas con diferentes colores. Después de producir el segundo lote de gotitas, mezclar suavemente las gotitas mediante pipeteo y cargar en una sola celda de flujo / PDMS-cup.
- Análisis de imagen.
- Analizar las imágenes utilizando Fiji (software de código abierto disponible en línea) 34.
- Para los ensayos en vivo, convertir pilas en hyperstacks usando "imagen" - '' - hyperstacks 'pila para HyperStack'. Establecer el número correcto de z-rebanadas y plazos.
- Con el fin de hacer que z-proyecciones, seleccione "imagen" - 'pilas' - 'z-proyecto'. Elija proyección "intensidad max '.
- Para reconstrucciones en 3D, primero vaya a "imagen" - 'propiedades' y establecer el píxel apropiado con, heigth píxel, profundidad y voxel frintervalos Ame. Haga clic en Aceptar'. Elija "imagen" - 'pilas' - 'del proyecto 3D', marca la casilla 'interpolación' y haga clic en 'Aceptar'.
Representative Results
Los métodos presentados en las secciones anteriores permiten la reconstitución de las estructuras de huso como con el aumento de la complejidad mediante el confinamiento geométrico de gotitas de la emulsión de agua-en-aceite. Esta sección describe los resultados representativos que muestran cualitativamente la capacidad de estos ensayos.
Durante la mitosis, cuando el huso bipolar está montado, las células completan para formar esferas con un diámetro de aproximadamente 15 micras, medido para las células humanas. Esta forma de la célula mitótica característica proporciona un límite geométrico que tanto restringe y dirige tamaño husillo y orientación 35,36. Técnicas de microfluídica, proporcionan un nivel de confinamiento geométrica que se asemeja con precisión la situación observada en las células vivas y por lo tanto permite la reconstrucción de abajo hacia arriba de husos mitóticos in vitro.
(Figura 4A, panel izquierdo). Después de aproximadamente 20 a 30 min, los primeros microtúbulos se convierten difusión visible y centrosoma se restringe como microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones. Ásteres con los microtúbulos de longitud intermedia (aproximadamente el 50% del diámetro de gota) puede (estéricamente) se repelen entre sí, con los microtúbulos que empujan uno contra el otro, los otros centrosomas y la corteza. Esto se traduce en un típico 'bipolar' disposición de tipo huso con los dos centrosomas opuestos entre sí (Figura 4a, panel central). Cuando microtúbulos crecen más de ~ 50% de la gotita-diametro, los centrosomas conseguir empujado más a los límites opuestos de la gota, con los microtúbulos crecen a lo largo de la corteza de gotas (Figura 4A, panel derecho). Es importante señalar que las tasas de crecimiento de los microtúbulos en estos ensayos son muy sensibles a la temperatura y la tubulina concentraciones. Por consiguiente, estos parámetros afectarán fuerte en el momento en el que se observa primero la nucleación y cuando se alcanzan posiciones aster de estado estable.
En las células, fuerzas de tracción corticales se generan a través de la formación de los accesorios de carga entre los microtúbulos más los fines de dineína y la corteza asociada. En las células animales, esta asociación depende del complejo Gαi / LGN / NuMA, que se dirige a la membrana plasmática a través de miristoilación N-terminal de Gαi 1. En estos ensayos de reconstitución, el requisito del complejo Gαi / LGN / NuMA se omite acoplando directamente dineína a los lípidos biotinilados a través de laformación de complejos de biotina-estreptavidina-biotina. Estos enlaces son relativamente estables (K D ~ 10 -14 M) 37 y forman rápidamente (generalmente dentro de 10 min después de la formación de gotitas de emulsión, antes de la nucleación de los microtúbulos se hace evidente) (Figura 4b). En presencia de dineína cortical, centrosomas típicamente retienen una posición más central, mientras que en ausencia de dineína, centrosomas son empujados a los lados opuestos de la corteza de gotas (Figura 4c). Estamos razón de esto es el resultado de dos efectos, que prevenir y contrarrestar las fuerzas de empuje de los microtúbulos. (1) La dineína promueve directamente catástrofes microtúbulos, restringiendo así la longitud de los microtúbulos y prevenir el pandeo de los microtúbulos excesiva, y (2) fuerzas de tracción corticales conducir a las fuerzas de centrado netas en los ásteres individuales 8, que contrarrestan las fuerzas de repulsión-aster aster.
El difusible reticulante ASE1 induce fOrcés que tienden a aumentar la zona de solapamiento de los microtúbulos antiparalelos 29. Consistente con esto, en presencia de ASE1 (y ausencia de dineína) centrosomas se encuentran muy juntos con ASE1 localizar a los microtúbulos incluido interpolares (Figura 4D). Los miembros de la familia kinesin-5 coche la separación del centrosoma, proporcionando fuerzas de empuje desde dentro del husillo (véase la introducción). En presencia de Cut7 (el S. pombe kinesin-5 ortholog), centrosomas son empujados a lados opuestos de las gotitas de la emulsión, incluso en presencia de ASE1 (Figura 4e). Mediante la combinación de generadores corticales e inter-polares de fuerza, el nivel de complejidad puede incrementarse aún más en estos experimentos, llevando eventualmente a una comprensión global del conjunto de huso mitótico bipolar. Una descripción cuantitativa detallada de estos resultados estarán disponibles en el futuro (Roth et al., Manuscrito en preparación).
(Figura 5c). Esto facilita el estudio de la conducta, tanto en estado estacionario y la cinética de ensamblaje del huso. Mediante la combinación de gotas con diferentes contenidos en la misma muestra, es, por ejemplo, posible comparar directamente de posicionamiento y montaje del husillo cinética centrosoma en gotitas con y sin generadores de fuerza corticales (Figura 5b).
Figura 1: fuerzas que actúan sobre el huso mitótico Varias moléculas de generación de fuerza actúan sobre los microtúbulos del huso mitótico para promover la formación del huso y posicionamiento.. Los microtúbulos que crecen en la corteza de células generan una fuerza de empuje sobre el centrosoma. dineína cortical (púrpura) captura los microtúbulos depolymerizing y genera una fuerza de tracción sobre los centrosomas. Dentro del husillo, Kinesin-5 proteínas motoras / Cut7 proporcionan una fuerza de deslizamiento hacia el exterior sobre los microtúbulos antiparalelos, mientras que agentes de reticulación de la familia PRC1 / ASE1 generan un opuestas hacia afuera fuerza de deslizamiento. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 2:. Microfluidos de diseño de chips (A) Diseño de fotomáscara 4 pulgadas que contiene 4 chips de microfluidos. (B) la representación detallada de un solo chip. Fichas contienen un solo canal de salida y tres canales de entrada, seguido de un polvo de filtro. canal de entrada 1 contiene la fase acuosa, el canal 2 del lípido / aceite de fase y el canal 3 puede ser usado para diluir las gotitas formadas con / aceite-fase lipídica adicional. (C) Representación detallada de la unión donde el / la fase de aceite de lípidos (que viene de la parte superior e inferior) se reúne con la fase acuosa (que viene de la izquierda). En el cruce, las gotas se forman y fluyen hacia el canal de salida a la derecha. (D) la representación detallada de un polvo de filtro con 2 micras canales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Metodología para la Formación de agua-en-aceite de emulsión de gotas (A) chip microfluídico y el tubo de la microfluídica en un microscopio de campo brillante. Tanto los tubos el agua y de la fase de aceite de lípidos / están conectados a las entradas de chip 1 y 2 respectivamente. (B) Restricción de chip de microfluidos en el que el agua y los lípidos / aceite-fases se encuentran. Al cambiar las presiones, las gotas de tamaño puede ser controlada. (C) Diseño de las células de flujo recubiertas con PDMS. Después de cargar las gotas en la celda de flujo, los extremos abiertos se cierran con valap adicional. (D) Esquema de la formación de gotas. Las gotitas se utilizan para encapsular los centrosomas, tubulina y componentes adicionales requeridos para la formación del huso mitótico. (E) Esquema de la focalización cortical-dineína. Biotina (Bio) dineína está dirigido a los lípidos a través de biotina estreptavidina (GECT). 
Figura 4:. Los resultados representativos de huso Reconstituciones con complejidad creciente (A) proyecciones de máxima intensidad de gotitas que contienen dos centrosomas que muestran ejemplos de los microtúbulos cortos, intermedios y largos. Centrosomas y los microtúbulos se visualizaron mediante la adición de 10% HiLyte-488 marcado con la tubulina. Barras de escala = 10 m. (B) La localización de GFP-biotina-dineína-TMR en ausencia (-, izquierda) y presencia (+, derecha) de estreptavidina (GECT). Posicionamiento (C) de microtúbulos aster en ausencia (-, izquierda) o presencia (+, derecha) de cortical GFP-biotina-dineína-TMR. (D) aster microtúbulos (panel izquierdo, green) posicionamiento en presencia de ASE1 (panel central, de color rojo). (E) de microtúbulos aster (panel izquierdo, verde) de posicionamiento en presencia de ASE1 y Cut7 (kinesin-5) (panel central, de color rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 5: Imaging Aster de Posicionamiento Dinámico in vitro (A) Diseño de una taza de PDMS que permite obtener imágenes de gotitas de hasta varias horas.. (B) Generación, almacenamiento y obtención de imágenes de gotitas (transmitida) que contiene diferentes contenidos, ilustrados por la ausencia (izquierda) inclusión (derecha) de dextrano fluorescente (Alexa 647). (C) imágenes planas individuales de una 60 minutos de lapso de tiempo (intervalos de 2 min) tomada de una pila Z (2 micras distancias) del anuncioroplet que contiene un solo centrosoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los métodos descritos aquí presentes los recientes esfuerzos para reconstituir husos mitóticos básicos en gotas de la emulsión de agua-en-aceite. El estudio de conjunto del eje dentro de los límites geométricos ofrece numerosas ventajas. Existen mecanismos importantes de retroalimentación entre los microtúbulos del huso mitótico y las limitaciones geométricas en el que están montados. Los microtúbulos pueden generar fuerzas de empuje cuando crecen en los límites geométricos, que puede resultar en el desplazamiento del huso mitótico. Además, la creciente en una barrera física puede inducir catástrofes microtúbulos. Además, conjunto del eje dentro de una geometría confinada puede conducir a un agotamiento progresivo de los componentes individuales, como la tubulina, que a su vez afecta directamente a la tasa de crecimiento de microtúbulos 36. Estos son todos los factores determinantes esenciales del conjunto del husillo, que se pueden estudiar usando los ensayos descritos aquí.
Los ensayos descritos son muy sensibles a differe concentración pequeñaNCES de los componentes de las gotitas. Este es el caso de la tubulina, donde las diferencias de concentración menores pueden resultar en el crecimiento de los microtúbulos demasiado lento o demasiado rápido. En este caso, las tasas de crecimiento de los microtúbulos a menudo pueden todavía ser corregidos mediante el ajuste de la temperatura durante la primera ~ 30 min del experimento. ensamblaje del huso mitótico y la colocación es también muy sensible a las variaciones en la concentración de generadores (cortical) de fuerza. Es probable que esto dependerá de la concentración, pureza y actividad de los componentes purificados y necesita ser valorada cuidadosamente para cada nueva proteína purificada.
Además, ciertas soluciones de compromiso tiene que ser realizado en la configuración de imagen, dependiendo de la naturaleza del ensayo. Inicialmente, los altos niveles de dímeros de tubulina fluorescentes solubles hacen que sea difícil de imagen microtúbulos individuales. Como microtúbulos crecen más y tubulina soluble se agota lentamente, la relación señal a ruido se vuelve gradualmente más altas y permite la obtención de imágenes de IndividuAL microtúbulos. En contraste con las configuraciones con sistemas abiertos, el confinamiento geométrico impide el intercambio de moléculas fluorescentes y componentes del sistema eliminador de oxígeno dentro de un depósito a granel, lo que resulta en el blanqueo significativo. Especialmente para el control de ensamblaje del huso y el posicionamiento en el tiempo, se requiere a la imagen con bajas intensidades de luz, incluso en presencia de un sistema eliminador de oxígeno potente.
Estos métodos permiten la reconstitución de abajo hacia arriba de las estructuras de huso como simplificados in vitro. Además de los componentes introducidos aquí, muchos otros factores se han descrito para influir en la formación bipolar husillo, el posicionamiento, orientación, configuración, etc. 3. Este sistema se puede ampliar para estudiar los efectos individuales y combinados de generadores de fuerza adicionales. importantes contribuyentes a la formación del huso que actualmente están ausentes de este sistema son los cromosomas mitóticos. cromatina mitótica Se ha demostrado quela formación del huso de particular (1) chromokinesins que puede generar la llamada, (2) la formación de un gradiente de RanGTP por la cromatina determinada RanGEF RCC1 38, (3) cinetocoros que puede interactuar 'fuerzas polar de eyección' 3 con (despolimerizar ) microtúbulos 39 y (4) la cromatina en sí, que puede funcionar como un resorte mecánico en el medio microtúbulos opuestas 40.
Por último, el sistema descrito actualmente proporciona un control temporal y espacial limitado sobre la actividad y la localización de la fuerza-generadores introducidas. En las células, muchos factores de ensamblaje del huso se localizan en compartimentos específicos o están activos dentro de una ventana de tiempo restringido. Un ejemplo notable es la actividad de la dineína, que está enriquecido específicamente en el lado posterior de la C. elegans de una sola célula de embrión en su fase asimétrica para promover el posicionamiento del cabezal y la división celular. En este sistema, actualmente estamos explorando la posibilidad de imitar tales tactividad utilizando métodos emporal y asimétricas prestadas de las técnicas opto-genéticos. Además, como es el caso de la C. elegans embriones y células con una pared celular rígida, muchas células no se completan en la mitosis. La forma geométrica del confinamiento tendrá un impacto fundamental sobre las fuerzas que actúan sobre el eje 41. Por tanto, será importante para reconstituir conjunto de husillo y posicionamiento en gotas no esféricas, así, potencialmente el uso de sistemas de microfluidos más complejos que permiten que dan forma y el almacenamiento de la emulsión de gotitas de 42,43. Por último, en los tejidos, célula-célula y célula-sustrato de señalización y el apego proporcionan señales externas que se pueden traducir en la orientación del cabezal dirigida, como se observa a menudo en las células epiteliales y las células madre. Todos estos aspectos especializados no han sido tenidas en cuenta en este estudio actual y podría proporcionar los retos del futuro para construir más hacia in vivo -como reconstituciones de assemb huso mitóticoLy y posicionamiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
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