Summary
Este protocolo descreve a aplicação de tomografia combinada fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) e imagiologia de micro-computadorizada (microCT) para visualizar tromboêmbolos cerebral. Esta técnica permite a quantificação da carga de trombo e evolução. A técnica de imagem NIRF visualiza fluorescente etiquetado trombo no cérebro extirpado, enquanto que a técnica microCT visualiza trombo no interior de animais vivos usando ouro-nanopartículas.
Abstract
imaging trombo direta visualiza a causa raiz de infarto tromboembólica. Ser capaz de trombo imagem permite diretamente muito melhor investigação de acidente vascular cerebral do que depender de medições indiretas, e será uma ferramenta de pesquisa vascular potente e robusto. Nós usamos uma abordagem de imagem óptico que rotula trombos com um marcador trombo imagiologia molecular - um Cy5.5 fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) sonda que está ligado de forma covalente às cadeias de fibrina do trombo pela acção enzimática-reticulação de fibrina de activado factor de coagulação XIII, durante o processo de maturação coágulo. Uma abordagem baseada tomografia computadorizada-micro (microCT) utiliza nanopartículas de ouro de procura de trombo (AuNPs) funcionalizados para atingir o principal componente do coágulo: fibrina. Este documento descreve um protocolo detalhado para o combinado in vivo microCT e ex vivo NIRF imagem de tromboembolismo em um rato modelo de acidente vascular cerebral embólico. Mostra-se que in vivo </ em> microCT e AuNPs glicol-quitosana-alvejado fibrina (FIB-GC-AuNPs) pode ser usado para visualizar tanto em trombos situ e trombos embolia cerebral. Nós também descrevem a utilização de imagiologia de trombos in vivo directa baseada microCT para monitorizar os efeitos terapêuticos em série de plasminogénio de tecido mediada por activador de trombólise. Após a última sessão de imagens, demonstramos por ex vivo NIRF imagem da extensão e a distribuição de tromboembolismo residual no cérebro. Finalmente, descrevemos imagem análises quantitativas de dados de imagem microCT e NIRF. A técnica de imagiologia de trombos combinado directa permite dois métodos independentes de visualização de trombo a ser comparados: a área de sinal fluorescente relacionadas com o trombo em ex vivo NIRF de imagem em relação ao volume de trombos hiperdenso microCT in vivo.
Introduction
Uma em cada 6 pessoas vão ter um acidente vascular cerebral em algum momento de sua vida. acidente vascular cerebral isquêmico é de longe o tipo de acidente vascular cerebral mais comum, e é responsável por cerca de 80 por cento de todos os casos de AVC. Porque tromboêmbolos fazer com que a maioria destes acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, existe um interesse crescente em imagem direta do trombo.
Estima-se que cerca de 2 milhões de células cerebrais morrem durante cada minuto de oclusão da artéria cerebral média 1, levando ao slogan "Tempo é cérebro". A tomografia computadorizada (TC) estudos pode ser feito rapidamente, e estão amplamente disponíveis; por esta razão, CT continua a ser a imagem de escolha para o diagnóstico e tratamento de acidente vascular cerebral isquêmico hyperacute inicial. CT é particularmente valioso para informar as decisões iniciais críticos: a administração de ativador do plasminogênio tecidual (tPA) para trombólise e / ou triagem para endovascular coágulo de recuperação de 2. De corrente baseado CT imagiologia de trombos, no entanto, não é possível controlar em série cerebral tromboêmbolos in vivo, porque ele usa métodos indiretos para demonstrar trombos: após opacificação da poça de sangue por contraste iodado, os trombos são demonstrados como preenchimento de defeitos nos vasos. Há limites de dose e riscos associados com a administração repetida de contraste iodado, que impedem repetidas imagens de trombos desta maneira.
Assim, há uma necessidade crítica para uma metodologia de imagem directa para trombo cerebral em pacientes com AVC, para permitir melhores decisões de tratamento mais rápido e a ser feita. Propomos para alcançar este através do aumento do valor de TC, a modalidade de imagem de primeira linha actualmente utilizado para acidente vascular cerebral, com a utilização de um agente de imagiologia molecular nanoparticular de procura de trombo.
Demonstrámos a utilização deste agente por meio de tomografia computadorizada de micro (microCT), um de alta resolução ex vivo ou in vivo (animal pequeno) versão imagiologia de CT que permite a aquisição de dados rápida <sup> 3,4. Mesmo com a relativamente pobre contraste tecido mole disponível para pequena microCT animais (muito pior do que disponível a partir de scanners de tamanho humano), o agente de imagem foi capaz de procurar e marcar trombos, tornando-os hiperdensa na CT, um "sinal navio densa" reforçada pela molecular imagiologia.
Complementando a técnica de CT, o nosso grupo previamente desenvolveu uma técnica de imagem trombo óptico directo usando sonda Cy5.5 fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) para visualizar fardo trombo cerebral 5. Esta é uma técnica ex vivo em post mortem cérebros, mas é altamente sensível, e serve para confirmar dados in vivo no ambiente de pesquisa.
Tendo CT e NIRF base técnicas de imagem em busca de trombo nos permite comparar e contrastar estas técnicas para obtenção de dados altamente informativos sobre o papel do trombo e imagem trombo no processo de desenvolvimento de acidente vascular cerebral isquêmico.
Here, nós descrevemos um protocolo detalhado de uma técnica combinada de microCT in vivo e ex vivo NIRF imagiologia para visualizar diretamente tromboêmbolos num modelo de rato de acidente vascular cerebral embólico. Estes métodos simples e robustas são úteis para fazer avançar nossa compreensão de doenças trombóticas, permitindo que o precisas na avaliação in vivo de trombo carga / distribuição e caracterização da evolução trombo dinâmica de uma forma rápida e quantitativa in vivo durante a terapia, seguido de dados ex vivo que serve como um controle e padrão de referência para a confirmação da in vivo achados de imagem.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais demonstraram neste protocolo ter sido analisado e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade Dongguk Ilsan Hospital Animal e conduzida de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais.
1. Preparação do coágulo formado exogenamente etiquetado com fluorescência do marcador (Figura 1)
- Anestesiar um rato numa câmara de indução, utilizando 3% de isoflurano misturado com 30% de oxigénio (1,5 L / min de 100% de oxigénio). Assegurar profundidade de anestesia adequada, observando tónus muscular e confirmando a ausência do reflexo do pé pitada.
- Colocar o animal em uma cortina estéril em decúbito ventral, e mantê-lo sob anestesia utilizando uma máscara de inalação e 2% de isoflurano misturado com 30% de oxigênio. Execute os seguintes procedimentos utilizando técnicas assépticas e vestidos / máscaras / luvas / instrumentos esterilizados. Manter condições estéreis por limpeza e desinfecção da área experimental com álcool 70% antes de umaND após os procedimentos.
- Recolha de sangue cerca de 300 ~ 1.000 l arterial após punção cardíaca 6. Misturar 70 ul de sangue total com 30 ul de sonda de C15 5 (20 umol / L de concentração), uma sonda fluorescente sensível a Cy5.5 a actividade de reticulação de fibrina do factor XIII activado (FXIIIa) da enzima de coagulação, para marcar por fluorescência do coágulo (Figura 1A ). Injectar a mistura de sangue utilizando uma seringa de 3 ml (agulha de calibre 23) para um tubo de polietileno de 20 cm de comprimento (PE-50, ID de 0,58 milímetros). tubos PE devem ser esterilizados (ou certificado estéril pelo fabricante) e os coágulos deve ser preparada assepticamente em uma capa de cultura de tecidos.
- Verifique a morte do animal, observando a falta de respiração e pulsação cardíaca.
- Deixar o tubo carregado de sangue à temperatura ambiente durante 2 h, em seguida a 4 ° C durante 22 h, e executar os seguintes procedimentos, como descrito anteriormente 7.
- Cortar o tubo contendo trombo em pedaços de 1,5 cm de comprimento. Utilizando uma seringa de 3 ml cheio com solução salina tamponada com fosfato (PBS), para expelir o trombo uma placa de 6 poços contendo PBS por injecção delicadamente com fosfato em cada pedaço de tubo. Lavar os trombos três vezes com PBS (Figura 1B).
- Carregar a porção de extremidade distai de um PE-10 cm de comprimento de tubo de 15 (ID de 0,28 milimetro) com um 1,5 cm de comprimento trombo desenhando cuidadosamente o trombo lavada, evitando ao mesmo tempo as bolhas de ar, utilizando uma seringa de 1 ml de solução salina com um 30 agulha de calibre que é inserida dentro da extremidade proximal do tubo.
- Ligar o tubo de PE-10 carregadas com trombo com um PE-50 tubo 3 cm de comprimento (ID 0,58 milímetros) modificado para ter uma extremidade cónica (ID 200 uM), que será colocada na artéria cerebral média (MCA) - anterior cerebral área da artéria (ACA) bifurcação da artéria carótida interna (ICA) num modelo de rato de acidente vascular cerebral embólico (Figura 1C).
2. Modelando um modelo do rato do curso tromboembólica (Figura 2)
- AnesthetizEA rato diferente a ser riscada como previamente relatado 7 em uma câmara de indução, utilizando 3% de isoflurano misturado com 30% de oxigénio (1,5 L / min). Injectar de meloxicam (5 mg / kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica. Assegurar profundidade de anestesia adequada, observando tónus muscular e confirmando a ausência do reflexo do pé pitada.
- Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinária para cada olho para evitar a secura durante a anestesia. Execute os seguintes procedimentos cirúrgicos utilizando técnicas assépticas e vestidos / máscaras / luvas / instrumentos esterilizados. Manter condições estéreis por limpeza e desinfecção da área cirúrgica com 70% de álcool antes, durante e após a cirurgia.
- Mova o rato para uma mesa de operação. Colocar o animal em uma cortina estéril em decúbito ventral, e mantê-lo sob anestesia utilizando uma máscara de inalação e 2% de isoflurano. Em seguida, fixar a temperatura do corpo a 36,5 ° C utilizando um cobertor homeotérmico com feedback de um termómetro rectal.
- após SurgiCAL prep com Betadine e álcool a 70%, fazer uma incisão vertical 1 centímetro usando um bisturi no couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho. Cole a extremidade distai da fibra óptica de um medidor de fluxo de laser Doppler para a superfície exposta do osso temporal esquerdo (1 mm esquerda e 4 mm abaixo do bregma). Em seguida, iniciar o monitoramento do fluxo Doppler (Figura 2A).
- Consagram o animal. Endireitar o pescoço, puxando o dente frontal superior com uma corda presa a um pino de barbear e a área do pescoço. Em seguida, fazer uma 3 cm verticais incisão mediana, espalhá-lo aberto, e expor a área lâmpada carótida esquerda dissecando tecidos moles peri-vasculares. Tenha cuidado para não lesar o nervo vago.
- Ligar a artéria esquerda proximal carótida comum (ACC), utilizando um 6-0 seda preta estéril, e ligar o ACI esquerda ea artéria pterigopalatina esquerda (PPA) usando estéreis 7-0 suturas de seda preta.
- Cauterizar a artéria tireóide superior esquerda, que é um ramo da USI artéria carótida externa esquerdang um cautério elétrico monopolar e ligar a artéria esquerda proximal externa carótida (ECA) frouxamente eo local mais distal firmemente usando estéreis 7-0 suturas de seda preta.
- Usando um micro-tesoura, faça um pequeno furo (cerca de 0,2 ~ 0,25 mm de diâmetro) entre os sites ligados da ECA.
- Insira o cateter contendo trombo dentro do buraco no ECA, enquanto soltando a ligadura ECA proximal. Aperte a ligadura ECA proximal novamente depois de fazer avançar o cateter no CCA, a fim de apertar o cateter no lugar.
- Cauterizar para cortar a parte distal ECA, que é distal ao local ligadura distal, e gire o proximal ECA livre no sentido horário para alinhá-lo para a direção do ICA ao retirar o cateter da CCA. Em seguida, avançar o cateter cerca de 9 mm no MCA - área de bifurcação ACA da ACI distal imediatamente depois de solta a ligação ICA. Em seguida, aperte a ligação ICA.
- Colocar o trombo na área de bifurcação por suavementepressionar a seringa de 1 ml para injectar o trombo. Verifique a diminuição de Doppler do fluxo sanguíneo cerebral (CBF), que deve ser reduzido em 30%, ou inferior em comparação com o valor basal, se o trombo ocluso com sucesso do vaso (Figura 2B).
- Remover o cateter, e ligar o sítio proximal ECA imediatamente e firmemente. Além disso, unligate o CCA ea PPA.
- Feche o local da incisão usando 6-0 seda. Pare de anestesia depois de continuar o acompanhamento Doppler ao longo de um período de tempo necessário (aqui, por 30 minutos após a injeção de trombo). Devolver o rato em uma gaiola vazia, e mantê-lo aquecido com uma lâmpada de aquecimento. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele ganhou consciência suficiente para manter decúbito esternal.
3. In Vivo MicroCT Imagiologia Cerebral de trombo (Figura 3)
- Re-anestesiar o rato com 2% de isoflurano, conforme descrito na etapa 2.1 em um ponto de tempo pré-especificado (aqui, 1 h) após o iníciode acidente vascular cerebral embólico, devido à colocação de trombo na artéria cerebral. Assegurar profundidade de anestesia adequada, confirmando a ausência do reflexo do pé pitada. Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinária para cada olho para evitar a secura durante a anestesia.
- Ressuspender alvo para a fibrina nanopartículas de ouro (FIB-GC-AUNP 4) a uma concentração de 10 mg Au / ml em PBS 10 mM, e sonicar o agente de imagiologia de trombos durante 30 minutos para assegurar a dissolução e a dispersão de nanopartículas. Injectar 300 ul FIB-GC-AUNP (10 mg / ml) para dentro da veia peniana.
- Colocar o animal na cama de uma máquina microCT e endireitar o pescoço, puxando o dente frontal superior com uma corda presa a um pino para reduzir artefatos de movimento.
- Em 5 minutos após a injecção de FIB-GC-AUNP, começam a obtenção de imagens do cérebro microCT. Para os experimentos aqui descritos, use os seguintes parâmetros de imagem: 65 kVp, 60 mA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm3 campo de visão, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm3 tamanho do voxel, 100 milissegundos por quadro, uma média, de 360, 512 x 512 matriz de reconstrução, 600 fatias, 64 seg tempo de varredura.
- Devolver o rato em uma gaiola vazia, e mantê-lo aquecido com uma lâmpada de aquecimento. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele ganhou consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Transformar os dados de imagem brutos em Digital Imaging e Comunicações em formato de Medicina (DICOM), utilizando o comando 'Start' no painel da "reconstrução" em um pacote de software instalado no scanner microCT.
- Para as análises quantitativas de imagens (no passo 6), transforma os dados para o formato TIFF DICOM usando um pacote de software disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
- Para análises qualitativas, bem como análises quantitativas de uma forma mais simples e mais rápido, usar o pacote de software e os originais 0.054 mm imagens grossas em formato DICOM para gerar um novo conjunto deimagens axial e coronal fundidas para ter uma espessura de 1 ou 2 mm (aqui, 2 mm), como se segue.
- Selecione a pasta DICOM na árvore o "Fonte de Dados", clique no botão direito do rato, e importar a pasta para 'MasterDB' ou 'PrivateDB'.
- Clique no botão 'MasterDB' ou 'PrivateDB' em árvore a "Fonte de Dados", e selecione a pasta importada. Depois de clicar na guia '3D' no painel de mais à esquerda, quando a janela dos Carregando Opções 'aparece, pressione "OK" para importar uma sequência de imagens na pasta como uma pilha.
- Alterar a representação da imagem para o formato projeção de intensidade máxima (MIP), clicando na palavra "MRP 'na axial e janelas de imagem coronal e escolhendo" MIP "no menu pop-up. Em seguida, alterar a espessura para 2 mm após o clique "TH: 0 [mm] 'nas mesmas janelas.
- Usando a 2 mm Largura 3D nabar vigator que permite explorar uma pilha de imagens e cortando-o em um ângulo e local apropriado, prepare a imagem da seção de um axial de espessura 2 mm, com cobertura total do círculo de Willis (COW), que abriga trombos. Clique no botão de captura (ícone da câmera) no painel 'saída'. Salvar a imagem no formato TIFF.
- Então, prepare cinco 2 mm de espessura imagens corte coronal que cobrem de forma contígua do lobo frontal para o cerebelo.
- Em primeiro lugar, preparar a segunda fatia, alinhando com cuidado a barra de navegação na imagem axial para que a imagem coronal pode melhor visualizar o MCA - trombos ACA.
- Em seguida, preparar os outros quatro fatias de uma forma contígua. Clique no botão de captura (ícone da câmera) no painel 'saída'. Salvar as imagens no formato TIFF.
4. A trombólise e In Vivo MicroCT Imagiologia Cerebral de trombo (Figura 3)
- Preparar um comprimento de 100 cm-1 PE0 tubo com uma agulha de calibre 30 numa extremidade e uma seringa de 1 mL, na outra extremidade. Encher o tubo com solução salina (600 ul) ou tPA (aqui, 24 mg / kg, 600 ul), evitando bolhas de ar.
- Re-anestesiar o rato, tal como descrito na etapa 2.1. Inserir a ponta da agulha dentro da veia peniana do animal. Colocar o animal cuidadosamente sobre a cama da máquina microCT. Então, imobilizar e estabilizar a parte injetada por via intravenosa do sistema de cateter gravando-o para a cama.
- Realizar uma sessão de imagem de seguimento como linha de base pré-tratamento. Em seguida, injectar quer 60 ul de solução salina normal ou tPA, pressionando o êmbolo da seringa para o sistema de cateter. Após a injecção de bolus, começam a infundir a solução restante (540 mL) ao longo de um período de tempo (aqui, 30 min).
- Obtenção de imagens microCT utilizando os mesmos parâmetros que no passo 3.4 a pré-especificado pontos de tempo: aqui, a 3 e 24 h após a injecção de bolus. Para executar o seguinte ex vivo NIRF Thromimaging autocarro do cérebro, sacrificar o animal sob anestesia por deslocamento cervical.
5. Ex Vivo NIRF Trombo Imagem e cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) de coloração do tecido cerebral (Figura 4)
- Após a decapitação, retire o couro cabeludo e cortar através do crânio com uma tesoura do forame magno-se em direção à sutura sagital. Remova a calota craniana, elevando cuidadosamente as bordas do crânio incisão com uma tesoura, evitando lesão no cérebro subjacente, assim, pôr a nu os hemisférios.
- Cortar os nervos ópticos na base do cérebro tão perto quanto possível da superfície do cérebro, porque eles poderiam se sobrepõem com o círculo de Willis artérias que devem ser visualizados na imagem NIRF. Em seguida, a fim de visualizar claramente o em forma de Y 'MCA / ACA / ACI distal' para a imagiologia de trombos NIRF, cortar o ICAs distal tanto quanto possível à superfície do cérebro depois de comprimir suavemente a base para expor cerebelar the pontos de corte (Figura 4A).
- Execute NIRF imagem (excitação / emissão, 675/690 nm; 1 a exposição seg) do tecido cerebral removido com a sua base apontando para cima (Figura 4B, C), que visualiza a tromboêmbolos fluorescente etiquetado nas artérias da vaca (Figura 4D) . Em seguida, realizar imagem adicional com o vértice do cérebro apontando para cima, que visualiza tromboêmbolos corticais. Evitar a secagem do cérebro, colocando algumas gotas de solução salina no tecido.
- Utilizando um dispositivo de matriz de cérebro de acordo com as instruções do fabricante, preparar rapidamente 2 mm de espessura fatias de cérebro coronalmente: 6 partes de 2 mm de espessura (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm do bregma). Evitar a secagem das fatias de cérebro usando gotas salinas, e executar NIRF imagiologia de tanto a frente e para trás da superfície das secções.
- Coloque as fatias de cérebro em solução a 2% de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) durante 20 min, evitando ao mesmo tempo a exposição a light. Em seguida, mover as fatias em solução de formaldeído a 4% a 4 ° C, evitando a exposição à luz.
6. Quantificação de trombo área usando microCT Imagens e ImageJ (1.49d) Software (Figura 5)
- Imagens abertos (Figura 5A).
- Abrir arquivos de sequência de imagem para criar um arquivo de pilha, escolhendo 'Arquivo> Importar> Sequência de Imagens "ou" File> Open ". Converter as imagens para 8 bits em tons de cinza usando 'Imagem> Tipo> 8-bit'.
- Converter a Unidade de polegada a milímetros (Figura 5A).
- Quando um pixel de arquivos de imagem CT corresponde a 0,053 mm, use "Analisar> Definir Escala 'para entrar' 1 ',' 0,053", e "mm" para "Distância em pixels ',' distância conhecida" e "Unidade de comprimento ', respectivamente.
- Quando (apenas) uma barra de escala está disponível,utilizando a ferramenta 'Linha Reta "desenhar uma linha com o seu comprimento igual ao da barra de escala. Em seguida, use "Analisar> Definir Escala 'para entrar o comprimento da barra de escala em milímetros.
- Subtracção de fundo (Figura 5B)
- Ao usar "Editar> Seleção> Especifique" lugar uma região circular ou retangular de interesse (ROI) em uma área do parênquima cerebral, sem regiões hiperdensas relacionadas com os ossos trombo ou. Porque o ROI especificado se aplica a cada fatia de pilha, verifique se se não for sobreposto com regiões hiperdensas em cada fatia.
- Escolha 'Plugin> ROI> BG subtração de ROI "e entre 2,0 para o" Número de stdev da média ".
- Segmentação de lesões hiperdensas relacionadas com o tromboembolismo (Figura 5C)
- Escolha 'Image> Adjust> Threshold ", e digite os valores de' Lower Nível de limite "e" Nível de limite 'superior como 22 e 255, respectivamente. Selecione 'Over / Under' para exibir pixels abaixo do valor limiar inferior em azul, pixels limiarizadas em tons de cinza e pixels acima do valor limiar superior em verde.
- Utilizar a 'Ferramenta de seleção à mão livre' para desenhar ROIs que cercam lesões hiperdensas relacionados com tromboêmbolos sem incluir áreas ósseas. Durante o desenho, mantenha pressionando [turno] ou [alt] para adicionar ou remover uma região, respectivamente.
Nota: Se as lesões tromboembólicos hiperdensas estão distantes de estruturas ósseas, em vez do 'ferramenta de seleção Freehand "," Wand ferramenta "pode ser utilizada com segurança, sem alterar seu nível de' Tolerância '.
- Quantificação de lesões segmentadas (Figura 5D)
- Use "Analisar> Definir Medidas 'para escolher' Area ',' Média Cinza Valor" e "Densidade Integrada (Área X Média)9 ;. Verifique as seguintes opções: 'Limit to Threshold "e" Rótulo de Exibição ". Use "Analisar> Medida 'para obter os dados quantificados. Em seguida, salvar os resultados como um arquivo ".xls".
- Salve o arquivo de pilha no formato TIFF. Além disso, use "Analisar> Ferramentas> Gerenciador ROI 'para guardar as ROIs.
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Representative Results
Imagens da linha de base microCT, obtido in vivo após a administração de FIB-GC-AUNP (10 mg / ml, 300 ul) à 1 h após acidente vascular cerebral embólico, claramente visualizada trombo cerebral no MCA - área de bifurcação ACA da artéria carótida interna distai (Figura 6 ). imagiologia de seguimento microCT não mostrou nenhuma mudança no trombo COW com o tratamento salino. No entanto, o tratamento com tPA mostrou uma dissolução gradual do trombo COW (setas azuis na Figura 6). Esta constatação demonstra que microCT imagem trombo pode permitir o monitoramento terapêutico de trombólise. Há um excelente correspondência entre in vivo densidade CT e ex vivo para NIRF tromboêmbolos residual a 24 horas. Note-se que as áreas hiperdenso microCT devido a trombo-marcação endógena pelos AuNPs de metas de fibrina bem co-localizados, com áreas de sinal NIRF devido a exógena trombo-marcação, que foi realizada antes emboLIC acidente vascular cerebral, utilizando uma sonda fluorescente Cy5.5 sensível ao factor de coagulação mediada por XIIIa actividade no processo de maturação do coágulo pré-formado-reticulação de fibrina (Figura 6). A técnica de imagiologia de trombos combinado directa para demonstrar o efeito trombolítica de tPA-mediada resultado reflecte acidente vascular cerebral histológica como medida por coloração de TTC. TTC coloração mostrou uma clara redução na quantidade de dano cerebral isquêmico (áreas esbranquiçadas na Figura 6) para o animal que recebeu tPA trombólise.
Figura 1:. Resumo da Preparação do coágulo de sangue marcado por fluorescência (a) a mistura de sangue total fresco com Cy5.5 fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) sonda (C15) que está ligado de forma covalente às cadeias de fibrina dos trombos de fibrina pela ação enzimática -crosslinking de coagu activadafator XIIIa lação durante o processo de maturação do coágulo. O sangue misturado é injectado para um polietileno (PE) -50 tubo e deixados repousar durante 24 h, para permitir a formação de coágulos e maturação. (B) imagem NIRF para confirmar a rotulagem óptica do trombo com a sonda de C15. Note-se a fluorescência persistente após a lavagem do trombo que foi removida do tubo de PE. (C) PE-10-tubo carregado de trombos com um tubo de PE-50 modificado para ter uma extremidade cónica (200 um de diâmetro) para o tromboembolismo na artéria cerebral média - anterior área de bifurcação da artéria cerebral da artéria carótida interna em ratos. Barras de escala:. 2 milímetros Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da Modelagem de um modelo de rato com Thromboembolic infarto cerebral. (A) monitorização de Laser Doppler do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) antes e após a oclusão da artéria cerebral média (MCA), com a extremidade distai da fibra óptica do medidor de fluxo de laser Doppler colada à superfície do osso temporal esquerda (1 mm esquerda e 4 mm abaixo do bregma). Observe a redução pós-oclusão do Doppler CBF, que deve ser reduzida em 30% ou menor em relação à linha de base. (B) Inserção do cateter contendo trombo (ou seja, o polietileno-tubo de 50 distalmente afunilada na Figura 1C) no orifício da artéria carótida externa (ECA), seguido (eventualmente) com o avanço do cateter de cerca de 9 mm na MCA - região anterior da artéria cerebral (ACA) bifurcação da artéria carótida interna distal (ICA). CCA, artéria carótida comum; PPA, artéria pterigopalatina. Por favor clique aqui para veruma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão geral do In vivo direto do trombo imagem utilizando fibrina-alvo do ouro nanopartículas para Visualize Cerebral tromboêmbolos e Monitor Ativador do Plasminogênio Tecidual (tPA) mediada por Efeitos trombolíticos baseada MicroCT (A) A injecção intravenosa de nanopartículas de ouro de glicol-quitosana-alvejado fibrina. (FIB-GC-AuNPs) em um rato com acidente vascular cerebral tromboembólico. (B) O rato é colocado no leito de um gerador de imagens microCT. (C) Obtenção de imagens microCT a 5 min após a injecção de FIB-GC-AuNPs. (D) a reconstrução de imagens para transformar os dados de imagem brutos em Digital Imaging e Comunicações em formato de Medicina (DICOM) usando um pacote de software instalado no scanner microCT. (E) A análise de imagens e preparação de axial / cimagens oronal prestados ter 2 mm de espessura usando o modo de projeção de intensidade máxima. Trombólise (F) intravenosa tPA-mediada, que podem ser monitorados e analisados utilizando-se o método de imagem trombo directo à base de microCT. (C - E) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visão geral do Ex Vivo Near-Infrared Fluorescente (NIRF) Imagiologia Cerebral de tromboembolismo (A e B) Um tecido cerebral representante removido de um rato com acidente vascular cerebral tromboembólico.. Tome precauções para não perder tromboêmbolos (seta vermelha) na artéria cerebral média (MCA) - área da artéria cerebral (ACA) bifurcação anterior da artéria carótida interna distal (ICA,setas azuis) ao remover o cérebro. (C e D) ex vivo NIRF imagiologia de trombos. O tecido cerebral é colocado no interior da câmara estanque à luz de um gerador de imagens NIRF (C) para a visualização do trombo (seta vermelha em D), pré-marcado com o marcador fluorescente Cy5.5 C15 antes da oclusão embólica da MCA - ACA bifurcação área. Compare a Figura 5 para o aparecimento CT. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visão geral de quantificar trombo Volume usando microCT Imagens e ImageJ (1.49d) (A) Importar imagens para um novo arquivo de pilha, converter o formato de arquivo para a escala de cinza de 8 bits, e alterando a unidade.milímetros. (B) A subtração. (C) A segmentação das lesões tromboembólicas pelo desenho da região de interesse (ROI) em torno das áreas hiperdensas enquanto excluindo estruturas ósseas. (D) Adquirindo os dados quantitativos para o ROI usando o menu "Analisar> Medida '. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. Representante direto cerebral trombo Imagiologia dados adquiridos antes e depois de tratar ratos afagado com Saline vs. Ativador do Plasminogênio Tecidual (tPA) imagem (A) microCT (MCT) trombo para permitir o monitoramento terapêutico de ativador do plasminogênio tecidual (tPA) trombólise mediada . (B e
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Discussion
Nós demonstramos o uso de duas técnicas de imagem molecular complementares para a imagem latente trombo direta em modelos experimentais de acidente vascular cerebral embólico: a fibrina alvo de nanopartículas de ouro (FIB-GC-AUNP) para imagens com base em microCT in vivo, e uma FXIIIa alvo sonda de imagem óptico para ex vivo de imagens fluorescentes.
Após a administração intravenosa de FIB-GC-AuNPs, trombos tornou-se visível a CT como estruturas densas, causado pelas partículas fique retido nas trombos por acção dos péptidos de direccionamento de fibrina (sobre a superfície das partículas) após concentração-gradient- difusão dependente na estrutura porosa, isto é, os trombos. Este processo parece ocorrer em apenas uma direcção, e rapidamente causado as concentrações relativamente baixas de nanopartículas no sangue para tornar-se concentrada no coágulo, e mudando a sua densidade CT suficientemente para permitir a detecção. A in vivo de imagem final, microCT às 24 horasbem correlacionada com a exame post mortem NIRF imagiologia do cérebro ex vivo, que mostra pós-tPA Residua dos trombos inicial que tinha sido marcado por fluorescência com a sonda óptica reconhecendo a actividade de reticulação de fibrina de FXIIIa antes de ser colocado na artéria cerebral. Desta forma, duas sondas de imagem molecular, utilizando diferentes mecanismos de ação e modalidades de imagem diferentes, cada relatório e cross-verificar as conclusões do outro.
A evolução de trombos pode ser seguido usando o mesmo método; especificamente, a terapia trombolítica com tPA poderia ser seguido in vivo, permitindo uma leitura rápida e atempada do sucesso da trombólise a serem executadas pelo CT. Isto tem profundas implicações para a trombólise clínica, e também tem aplicações de pesquisa para o desenvolvimento de novas terapias anti-trombóticos ou trombolíticos.
Anteriormente, o nosso grupo era capaz de detectar uma complicação comum em terapia de acidente vascular cerebral, o re-trombose 3 ocorrendo muitas vezes em torno de um coágulo parcialmente tratados, com posterior re-oclusão e resultados agravamento. Re-trombose foi modelada através da aplicação de um milímetro FeCl 3 -soaked papéis de filtro (grau 42) sequencialmente em 4 locais diferentes (esquerdo distal CCA, proximal esquerda CCA, CCA distal direita, e então proximal direito CCA) em momentos diferentes nos mesmos animais . Em todos os casos, circulando fib-GC-AUNP foram demonstrados acumulando no trombos, e tornando estes visível a imagem com CT. Esta duração deste efeito parece estar limitado apenas para a semi-vida biológica da fib-GC-AUNP, que é actualmente desconhecida, e foi observada por um tempo prolongado (até 3 semanas) após a injecção inicial de fib- GC-AUNP. Isto é de grande interesse clínico, porque uma única dose de agente de nanopartículas pode revelar-se eficaz para a observação tanto o sucesso e falhas de regimes de tratamento clínico. Mais estudos são necessários para avaliar a farmacocinética e biodistribuição de fib-GC-AUNP.
A síntese química de FIB-GC-AuNPs foi previamente descrito em detalhe 4. Resumidamente, os péptidos de direccionamento de fibrina (tirosina-D-glutamina-cisteína-hidroxiprolina-L-3-clorotirosina glicina-leucina-cisteína-tirosina-isoleucina-glutamina) utilizado na ressonância magnética EP-2104R (MRI) agente 8 são sintetizada por Fmoc de fase sólida padrão de química de péptidos, e conjugado com a superfície de AuNPs revestidos por GC usando 1-etil-3- carbodiimida (3-dimetilaminopropil) e N-hidroxi succinimida. Os produtos finais, purificados fib-GC-AuNPs são recolhidos por centrifugação.
A sonda C15 NIRF para a rotulagem de trombo óptico pré-formado é um péptido de ácido 15-amino reconhecido por FXIIIa e colocados nos grupos amino de resíduos de lisina £ 9,10 Cy5.5 com corante fluorescente. O agente de imagiologia óptica é ligada covalentemente às cadeias de fibrina dos trombos através da acção enzimática do actoivated factor de coagulação, quando se reticula cadeias de fibrina durante o processo de maturação coágulo 11,12. A síntese química do marcador trombo C15 NIRF tem também sido anteriormente descrita em pormenor 4. Resumidamente, os péptidos FXIIIa afinidade (glicina-asparagina-alanina-glutamato-glutamina-valina-serina-prolina-leucina-treonina-leucina-leucina-lisina triptofano) com base no N-terminal da alph-2-antiplasmina são sintetizados por sólida síntese de péptidos em -fase e então marcadas com Cy5.5 fluorocromos através da cadeia lateral cisteína. Utilizando cromatografia líquida de elevado rendimento, o produto é purificado e o composto final é recolhido.
O sucesso de ambas as NIRF e agentes de nanopartículas de ouro é provável por causa das fortes características de design biológicas destes agentes. FXIIIa 11 é uma transglutaminase fundamentalmente importante tetramérica activado pela trombina, a enzima que medeia a resistência a coagulação fibrinolítico. A actividade destaenzima é considerada como uma indicação de trombos recém-formadas. Ambos os nossos agentes interagem fortemente com esta enzima fundamentais coagulação do sangue (pelo agente óptico C15 FXIIIa-sensing) ou seu substrato (pelo agente fib-GC-AUNP CT-alvo de fibrina).
Estudos de co-localização mostrou que houve uma excelente correspondência entre ex vivo de fluorescência (exógeno marcador trombo) e in vivo microCT densidade (endógena marcador trombo) para trombo cerebral fotografada com a nanopartícula-ligação à fibrina, que é esperado, devido à mutuamente mecanismos de aprisionamento biológicos relacionados para ambos os agentes.
Há várias coisas a considerar quando se utiliza a técnica de imagem direta do trombo dual-modal. Em primeiro lugar, para evitar FIB-GC-AuNPs de agregação e de alcançar biocompatibilidade, glicol de quitosano é utilizado para o revestimento de superfície 13. Antes da injecção intravenosa no entanto, o agente de imagiologia de trombos deve ser resuspenDED em PBS, e sonicadas para assegurar a dissolução e a dispersão de nanopartículas. Além disso, a estabilidade de nanopartículas pode ser avaliado pelo uso de (UV-VIS), espectroscopia de absorção no ultravioleta-visível de superfície para comparar picos de ressonância plasmónica de estoques antigos comparada frescas de FIB-GC-AuNPs, ambos dos quais deve ser de cerca de 519 nm.
Por outro lado, a resolução das imagens trombo microCT pode ser melhorada através da alteração dos parâmetros de verificação: como o aumento da 'Número Scan' de 600 a 1200 fatias ou aumentando a 'médio' de 1 a 3, que, no entanto aumentar o tempo necessário para completar a digitalização.
Em terceiro lugar, o sangue e agente de imagiologia C15 NIRF foram misturados na proporção de 7: 3 5 para a marcação fluorescente de trombo no presente estudo. De acordo com nossa experiência, um volume de sangue relativamente baixo pode dificultar a formação de trombos, enquanto um volume de sangue relativamente alta poderia reduzir a detecção de trombodevido à atenuação de sinal fluorescente ex vivo que emitem luz do trombo. Além disso, é notável que diversas aproximações diferentes podem ser usados para a visualização fluorescente de vários componentes de um trombo 14.
Em quarto lugar, em comparação com o modelo de trombose FeCl3 mediada in situ, onde a artéria alvo é apenas parcialmente ocluído, visualização microCT de tromboembolismo cerebral que obstruir completamente o vaso requer relativamente elevadas doses de FIB-GC-AuNPs 4. Assim, poderia haver preocupações de toxicidade, apesar de os colóides de ouro são considerados biocompatíveis e de fib-GC-AuNPs não mostrou toxicidade sistémica / neurocomportamentais perceptível em estudo anterior 4.
Em quinto lugar, os ensaios clínicos mostraram que plaquetas-alvo ou agentes de ressonância magnética segmentada por fibrina gadolínio (Gd) à base poderia aumentar a hiperintensidade dos trombos nas câmaras cardíacas, artérias carótidas e arco aórtico nas imagens ponderadas em T1 15. Apesar de ressonância magnética tem uma excelente contraste de tecido mole e uma alta resolução espacial, RM é um teste demorado. CT sofre de contraste de tecidos moles relativamente pobre, no entanto tomografia computadorizada pode ser realizada rapidamente. Por conseguinte, a TC continua a ser a técnica de imagem mais amplamente utilizado no tratamento de acidente vascular cerebral 16 aguda. Além disso, os sistemas de microCT para imagens de pequenos animais não necessitam de proteção contra radiações de arquitetura para ser instalada, e oferecem imagens de alta resolução. Assim, microCT combinado com ex vivo imagens de fluorescência de reflectância ou na tomografia de fluorescência vivo 17 é muito útil para pesquisas com animais de pequeno porte. Alternativamente, MRI / CT imagem dual-modal usando Au-Fe nanopartículas 18-20 pode também ser uma plataforma poderosa para a imagem latente trombo em ambos os animais e seres humanos; MRI e CT poderiam complementar-se mutuamente e, ao contrário de imagem óptico, eles não sofrem com o problema de baixa penetração nos tecidos.
content "> Em conclusão, CT combinados e imagens fluorescentes para a visualização direta do trombo é uma poderosa ferramenta de pesquisa para a investigação de acidente vascular cerebral isquêmico, prometendo melhorar a detecção de trombo, a monitorização da terapêutica, ea detecção de re-trombose complicando terapia. Além disso, existe um potencial significativo para aplicações clínicas destas técnicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, Ch.A e KK são os detentores de patentes da nanopartícula de ouro alvo da fibrina (10-1474063-0000, coreano Intellectual Property Office). Os demais autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Coréia Healthcare Tecnologia R & D Project, Ministério da Saúde e Bem-Estar (HI12C1847, HI12C0066), o Programa Bio & Medical Technology Development (2010-0019862) e do programa de Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) do Fundação nacional de Pesquisa, financiado pelo governo coreano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
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