방법 논문

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

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DOI:

10.3791/54511

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2016년 9월 14일

 ,  , 
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

초록

진핵 세포는 화학주성(chemotaxis)이라고 하는 세포 과정인 화학유인 구배(chemoattractant gradient)를 감지하고 이를 향해 움직입니다. 화학주성은 배발생, 뉴런 패턴화, 암세포의 전이, 염증 부위에 대한 호중구 동원, 모델 유기체인 Dictyostelium discoideum의 개발과 같은 많은 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 진핵 세포는 G 단백질 결합 수용체를 사용하여 화학 유인 물질을 감지합니다. 시각적 화학주성 분석법은 진핵 세포가 화학유인 물질에 의한 방향성 세포 이동을 어떻게 제어하는지 더 잘 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 1) 여러 화학주성 분석의 실시간 고분해능 모니터링, 2) 호중구 유사 HL60 세포에서 신호 이벤트의 화학유인 구배 및 시공간 역학을 동시에 시각화하기 위한 자세한 방법을 설명합니다.

서론

진핵 세포 감각 및 화학 유인 구배 내의 고농도 측으로 이동 셀룰러 과정은 화성이라한다. 화성은 배아 발생 하나, 신경 패터닝이 암세포 (3)의 전이, 염증 (4)의 부위에 호중구 모집하고, 모델 생물 Dictyostelium의 discoideum 5 개발 많은 생리 학적 과정에 중요한 역할을한다. 일반적으로, 진핵 세포는 G 단백질 결합 수용체 (5)를 이용하여 화학 유인 물질을 감지. 이 수용체와 화학 유인 물질의 결합은 결국 궁극적으로 세포 이동 5-9를 구동 할 수있는 액틴 세포 골격의 시공간 조직을 조절하는 다운 스트림 신호 전달 경로를 활성화 이종삼 G 단백질 Gα 및 Gβγ의 분해를 촉진한다.

세포 생물 학자 개발 및 chemotax을 개선 한분석이 G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 신호에서 중재가 세포 이동을 지시하는 방법을 검토하는 것입니다. 보이든 챔버 또는 트랜스 웰 마이그레이션 분석은 보이든 (10)에 의해 1960 년에 개발되었다. 상기 분석은 미세 다공성 막에 의해 분리되는 두 개의 웰 사이의 화학 유인 물질 화합물의 구배를 생성하여 작동한다. 단순성 및 사용의 용이성은 현재까지 가장 널리 사용되는 화성 분석 만든다. 그러나, 세포의 마이그레이션 프로세스를 사용하지 않고 분석이 가시화 될 수있다. Zigmond 챔버는 소스 화학 유인 물질 (11)을 향해 좁은 수축 걸쳐 커버 슬립에 대한 세포 이동의 명확한 영상을 허용하는 제 시각 미세 유동 장치이다. 던 12 Insall 13 변형 및 Zigmond 챔버 화성 분석의 고해상도 장기 이미징 성능을 개선 하였다. 때문에 유체 흐름의 높은 예측 확산 지배적 인 특성, 미세 유체는 다음-generati에 대한 솔루션을 제공하고있다이러한 EZ-TAXIScan (세포 이동 분석 장치) 등의 화학 주성 분석에서.

확보 그래디언트의 안정성, 장치는 여섯 화성 분석법 동시에 (도 1A)을 수행 할 수있다. 상기 다양한 챔버 분석에서 생성 된 고정 된 방향성 구배 달리의 Guenther Gerisch 의해 개발 바늘 또는 마이크로 피펫 분석은 가동 소스 (14)와 그라데이션을 생성한다. 상기 분석에서, 화학 유인 물질은 안정한 구배를 생성하도록 가동 마이크로 피펫으로부터 방출된다. 이 바늘 분석을 통해 연구자들은 다른 세포는 근본적으로 다른 특성을 가진 pseudopods를 생성하는 것으로 나타났습니다. 형광 현미경을 적용, 우리는 (15)에 걸쳐 정량적 측정을 용이하게하기 위해 경사를 시각화 할 수 있었다. 본 연구에서는 동시에 여러 화성 ASSA을 모니터링 화성 HL60 (인간 전 골수성 백혈병) 세포를 제조하는 자세한 방법을 설명세포 이동 분석 장치 및 표시, 예컨대 시공간으로 제어 가능한 화학 주성의 자극에 응답하여 이러한 하나의 살아있는 세포에서 단백질 키나제 D1 같은 시그널링 분자의 GPCR 매개 시공간 역학을 가시화와 YS. 앞선 화상 형성 방법은 일반적으로 주 화성 연구에 적용하고, 포유 동물 세포 시스템에 특히 적합 할 수있다.

프로토콜

1. 문화와 인간의 차별화 호중구와 같은 HL60 세포

  1. 준비 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) RPMI 1640 배지, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 0.1 mM의 피루브산 나트륨을 포함 1640 배지, 25 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- -piperazineethanesulfonic 산). 37 ° C에 RPMI 1640 배지를 따뜻하게.
  2. 사용한 혈구 세포를 로그 성장 단계 단계에 있는지 확인하는 HL60 세포의 세포 밀도를 결정한다.
    참고 : 세포 계대 후 셋째 날에 로그 단계에서 일반적입니다. 로그 상 세포의 밀도는 일반적으로 6-8 × 105 세포 / ml이다. 새로운 배양을 시작하는 데 필요한 세포 밀도는 약 1.5 × 105 세포 / ml이다.
    참고 : 예를 들어, T-75 평면 플라스크에 10 mL의 새 배양 로그 상 세포의 세포 밀도는 6 × 105 세포 / ㎖, 로그 상 세포 (2.5 ml를 6 × 105이면 ) 10m에 1.5 × 105 세포 / ml로 희석되고난 새로운 문화. 10 ml의 문화의 최종 부피, 추가 RPMI 1640 배지 7.5 mL로한다.
  3. 평평한 플라스크에 따뜻한 RPMI 1640 배양액의 계산 된 볼륨을 놓습니다. 은 T-75 플라스크 평면 배양, 세포 배양의 총 부피는 10 ㎖이다.
  4. 1.5 × 105 세포 / ml의 세포 밀도를 달성하기 위해 평면 플라스크에 로그 상 성장 HL60 세포의 계산 된 양을 추가한다.
  5. 5 % CO 2 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
    참고 : HL60의 배가 시간이 거의 24 시간입니다.
  6. RPMI 1640 배지와 통로는 세포를 2-3 일마다. HL60 세포의 세포 밀도 절대 1.5 × 106 세포 / ml를 초과하지 셀 통로가 더 이상 2개월보다 지속한다는 것이 중요하다.
  7. 실험 전에 HL60 세포 5 일 차별화.
    주 : RPMI 1640 분화 배지를 RPMI 1640 배지, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 0.1 mM의 피루브산 나트륨, 25 mM의 H를 포함EPES, 1.3 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO). 즉, RPMI 1640 배지에 1.3 %의 DMSO이다.
    1. HL60 세포를 구별하기 위해, 37 ° C로 RPMI 1640 배지를 미리 따뜻하게. 평평한 플라스크에 따뜻한 RPMI 1640 배지를 추가합니다.
    2. DMSO를 빠르게 RPMI 1640 배지로 희석되도록 형틀을 선회하면서 최종 10 ㎖ HL60 분화 배양, 평탄 플라스크 RPMI 1640 배지로 130 바로 UL DMSO를 추가한다.
    3. 최종 10 ㎖ RPMI 1640 분화 배지에 1.5 × 105 세포 / ml의 최종 세포 밀도로 기록 단계 HL60 세포를 추가한다. 배양 5 일간 5 % CO 2의 가습 된 배양기에서 37 ° C RPMI 1640 분화 배지의 HL60 세포.

2. 4well 상공 회의소의 커버 유리 표면을 코팅

  1. 냉장고에서 2 % 젤라틴 원액의 병을 70 % 에탄올로 청소하고, 후드에 넣습니다. 티아케 1 ml의 2 % 젤라틴 원액 즉시 냉장고에 남아있는 젤라틴 원액을 반환합니다.
  2. 젤라틴 용액이 완전히 37 ℃에서 액화하고 철저하게 피펫 할 수 있습니다. 9 ml의 예열 1X 행크스 밸런스 염 용액과 2 % 젤라틴 원액을 희석 (HBSS)은 0.2 % 젤라틴의 최종 농도 버퍼.
  3. 각각 바닥 커버 유리 4- 웰 챔버의 두 중간 또는 웰 1 웰 HBSS 챔버에 0.5 ㎖의 2 ml의 0.2 % 젤라틴을 추가한다. 액체가 전체 면적을 커버하도록 여러 방향으로 플레이트를 기울인다.
  4. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 플레이트는 1 시간에 사용하기위한 준비가 될 것입니다. 이들은 최대 5 일 동안 사용될 수있다. 그냥 세포를 파종하기 전에, 4 웰 또는 1 웰 챔버에서 젤라틴 용액을 제거합니다.

3. 화성 분석하여 세포 이동 분석 장치

  1. RPMI입니다 준비하고 따뜻하게 RPMI 1640 굶주리고 매체,0.1 mM의 피루브산 나트륨 (옵션) 및 25 mM의 HEPES를 포함하는 매체.
  2. 매체 굶주린 RPMI 1640에서 100 nm의 fMLP (N-formylmethionyl 로이 실 페닐알라닌)의 100 μl를 준비합니다.
  3. 1 % 소 혈청 알부민 3 ㎖ (BSA)를 준비 / RPMI 배지 0.1 % BSA / RPMI 1640 배지 10 ㎖ 배고파 RPMI 1640 1 % BSA를 포함 1640 매체.
  4. 코트 22mm 사각형 커버 슬립 갓 제조 된 1 % BSA로 5㎛의 세포 이동 분석 소자 칩 / RPMI 1640 배지 1 시간 동안 실온에서.
  5. 다음 절차에 따라 홀더를 조립 :
    1. 레버는 사용자쪽으로 기울 수 있도록 수직 위치에있는 레버와 홀더베이스를 놓습니다. 41 밀리 유리의 표면을 70 % 에탄올 용액을 적용한다. 주의 깊게 긁히지 않도록주의하면서 와이프와 표면을 닦으십시오.
    2. 홀더베이스에 41mm 유리를 삽입합니다. 홀더베이스에서 41mm 유리의 상단에있는 BSA 코팅 된 22mm 사각형 커버 슬립을 넣습니다.
      참고 : 코팅 된 사각형 C41 밀리미터 유리와 칩 사이에 overslip는 화성이 코팅 표면의 기질에서 발생 할 수 있습니다.
    3. 웨이퍼 하우징의 하단에 O 링 (소)을 삽입하고, 후방의 타원형 구멍 홀더베이스에 웨이퍼 하우징 마운트. 위치에 웨이퍼 하우징을 고정 할 수있는 수평 위치로 앞으로 홀더베이스의 내부 수준을 당깁니다.
    4. 공기 살포기와 웨이퍼 하우징의 내부에서 먼지를 불어. 웨이퍼 하우징에 0.1 % BSA / RPMI 1640 배지 4 ML을 추가합니다.
    5. 아래쪽 유리와 접촉하는 구조 얼굴 웨이퍼 하우징의 중심에 BSA 코팅 된 세포 이동 분석 소자 칩을 마운트.
      주 : 칩 뒷면에 위치 표시 (칩의 상부의 구멍)가 삽입 될 필요가있다.
    6. 구멍에 고무 가스켓에있는 두 개의 돌기를 끼워 맞춤으로써, 웨이퍼 클램프의 하단에 고무 개스킷 부착.
    7. 상에 O 링 (대) 탑재웨이퍼 하우징의 상단. 뒷면에있는 센서 구멍 웨이퍼 클램프를 탑재합니다. 대신에 웨이퍼 클램프를 고정 할 수있는 수평 위치로 앞으로 하우징베이스의 외부 레버를 당깁니다.
    8. 홀더의 조립 후, 웰 내에 기포가 존재하는지 확인하기 위해 광 박스의 홀더의 하단을 배치. 기포가 발견 된 경우, 샘플 로딩 팁 장착 제공된 플라스틱 주사기를 사용하여 제거한다.
    9. 덮개를 제거하고 세포 이동 분석 장치 유닛의 상단에있는 플레이트에 조립했습니다. 홀더에 센서 블록을 연결합니다.
  6. 화성 분석에 대한 HL60 세포를 준비합니다 :
    1. 혈구와 차별화 HL60 세포의 세포 밀도를 계산한다. 분화 5 일 후, 세포 밀도는 약 1.0 × 106 세포 / ml이다.
    2. 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도 HL60 세포의 최종 부피를 계산한다. 예를 들어,의 세포 밀도분화 된 HL60 세포를 1.0 × 106 세포 / 후 ㎖, 분화 된 HL60 세포를 10 ㎖, 2 × 106 세포 / ml에 도달하기 위해 5 ㎖ 0.1 %의 BSA / RPMI 1640 배지로 현탁 될 것이다.
    3. 원심 분리기 (200)에서 HL60 세포를 분화 RT에서 5 분 동안 XG. 0.1 % BSA의 계산 된 양을 가진 세포 상등액을 제거하고 재현 탁 / 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도로 RPMI 단계 3.6.2에서 1640).
  7. 이미지 수집을위한 세포 이동 분석 장치 유닛과 PC를 시작합니다. PC에 장치를 연결합니다. 세포 이동 분석 장치를 켭니다. PC를 켭니다.
  8. 셀 이동 분석 장치 소프트웨어를 시작합니다.
    1. 카메라, 히터, 촬영, 메모, 카메라 이미지 : 5 컨트롤 패널을 준수하십시오.
    2. 카메라 화상 제어 패널에서 카메라 영상 패널 카메라 중심을 실시간 홀더 / 뷰 위치를 조정하는 "수평 라인"또는 "수직선을"사용한다.
    3. 카메라 제어 패널에서 정의 된 채널에 카메라를 이동 CH6에 CH1을 선택합니다. 채널의보기 필드의 중심을하려면 카메라의 X 좌표와 수평으로 카메라의 위치를​​ 중심으로 조정하는 "R을 이동" "이동 L"을 클릭하거나.
    4. [조정 수직 화면 중앙에 이미지를 조절 세포 이동 분석 장치 본체의 전면 패널에 위치 된 손잡이를 돌려 카메라의 Y를 좌표.
    5. 히터 제어판에서 37.0 ° C에 "홀더 온도", 39 °의 C에 "플레이트 온도"로 설정하십시오. 가열을 시작합니다 "열"을 클릭합니다. 또한 홀더에 연결된 열 센서를 사용하여 온도를 제어하기 위해 "홀더"를 클릭합니다.
    6. 촬영 패널에서 "간격"에서 "15 초"와 간격을위한 "시간"에서 "30 분"및 화성 분석의 지속 시간을 입력합니다. 확인 안전을 위해 "촬영 끝에​​ 히터 오프". 드를 지정저장된 이미지 stination.
    7. 메모 패널에서 이러한 세포주와 실험 입력 구체적인 치료가 적용되었는지 여부를 사용하고, 화학 - 유인 제의 농도를 적용 하였다.
    8. 실험에 사용되는 모든 채널의 중심 위치를 확인하고, 필요한 경우 모든 채널에 대한 조정을 반복한다.
  9. 주사 다음과 같이 셀 정렬 :
    1. 홀더에서 버퍼를 제거하고 잘 각 채널의 상단에서 세 번째에서 버퍼 8 μl를 꺼내.
    2. 세포 수를 조절하고 사출 동안 흐름을 실시간으로 화면을 모니터하면서 동일 채널에서 제 2 웰에 세포를 2 μL를 주입하기 위해 주사기를 사용한다. 세포가 잘 정렬 한 후, 즉시 버퍼의 8 μl를 다시 추가합니다. 다른 채널 (도 1b)에 대해 동일한 절차를 반복한다.
  10. 다시 홀더에 버퍼 ㎖로 2를 추가하고 1 ㎕를 100 nm의 FM 추가상단에서 세 번째 우물에 LP. 이미지 수집을 시작하고 데이터를 저장합니다. 소프트웨어 이미지 (9)를 추적 (도 2)를 사용하여 얻은 데이터를 분석한다.

일렉트로 4. 형질

  1. 제 2의 지침에 따라 제 1에 코트 4 웰 또는 1 웰 챔버 바와 같이 실험 전에 HL60 세포 5 일 차별화.
  2. 준비하고 37 ° C로 RPMI 1640 배지, 20 % (V / V) FBS, 0.1 mM의 피루브산 나트륨, 25 mM의 HEPES를 포함 따뜻한 RPMI 1640 일렉트로 복구 매체.
  3. 오른쪽 형질 감염 실험을 시작하기 전에 각각 미리 피복 또는 4 웰 1 웰 챔버의 웰에 300 ㎕를 3 ㎖의 RPMI 1640 배지를 추가한다.
  4. 5 % CO 2와 가습 37 ° C 배양기에서 챔버를 품어. 나중에 사용하기 (이주)의 인큐베이터에서 즉시 또는 상점이 챔버를 사용합니다.
  5. 차별화 HL6의 셀 밀도를 계산혈구와 0 세포.
    주 : 세포 밀도는 종종 약 1.0 × 106 세포 / ㎖에 도달한다. 셀 밀도는 더 큰 3.0 × 106 세포보다 / ㎖ 보통 바람직하지 않은 형질 전환 효율을 제공한다. HL60 세포 현탁액 세포이기 때문에, 더 부유 할 필요가 없습니다.
  6. 200 세포를 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 XG. 상층 액을 제거하고 형질 전환 시약 100 ㎕에 2 × 10 6 HL60 세포를 재현 탁.
  7. 세포와 형질 전환 시약의 100 μl의 혼합물에 GFP-PKD1 플라스미드 (9)의 4 μg의 추가 부드럽게하고 철저하게 섞는다. 제공되는 큐벳에 혼합물을 추가합니다.
  8. 인간 백혈구 세포주 제조업체의 미리 설정된 프로그램을 선택하고 전기를 수행합니다.
    주 : 추가 정보는 제조 업체의 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다.
  9. 전기 후 즉시 부드럽게 추가 세포 500 μl의 RPMI 6140 전기 복구 매체를 미리 예열하고,부드럽게 제공된 플라스틱 피펫와 1.6ml 튜브에 큐벳에서 세포를 옮긴다.
  10. 5 % CO 2 가습 37 ° C의 배양기에서 30 분 동안 세포를 인큐베이션. 종자 100 μL 또는 각각 한 4 웰 잘 또는 1 웰 챔버에 세포 500 μL.
  11. 각각 1 ml의 또는 4 웰의 같은 아니라 4 ML의 최종 부피 또는 1 웰 챔버에 RPMI 1640 배지를 추가합니다. 3 시간 동안 5 % CO 2 가습 37 ° C의 배양기에서 세포를 인큐베이션. 사전 따뜻한 RPMI 1640 굶주리고 매체에 37 ° C를.
  12. 1 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 각각 4 잘 챔버의 잘 또는 1 웰 챔버에서 RPMI 1640 배양액 0.8 ml의 또는 3 ㎖를 제거합니다. 부드러운하고 준수 HL60 세포를 멀리 흡입하지 마십시오.
    참고 : HL60 세포의 성장과 서스펜션 미디어에서 차별화된다. 특정 치료 또는 차별화 된 후, HL60 세포는 폴리 라이신, 콜라겐, 젤라틴, 또는 파이로 코팅 된 기질에 부착bronectin.
  13. 각각 4 웰 또는 1 웰 챔버의 우물에 매체 굶주리고 0.8 ml의 또는 RPMI 1640의 3 ML을 추가합니다. 1 시간을 기다립니다.
    참고 :이 시점에서 세포 이미징 실험 구에 대한 준비가되어 있습니다.

5. 모니터링 GPCR 매개 멀티 채널 형광 현미경에 의해 PKD1의 막 전좌를

  1. 자극으로 매체 굶주린 RPMI 1640에서 100 nm의 fMLP 1 μg의 / ㎖ 알렉사 594의 신선한 혼합물을 준비합니다.
    참고 : fMLP 및 알렉사 594 요구의 혼합물을 갓 최대 효과를 보장하기 위해합니다.
  2. 마운트 한 4 웰 챔버는 40X 기름 렌즈를 통해 세포 시드.
  3. 다음과 같이 멀티 채널 구성에서 형광 현미경을 설정합니다 :
    1. 부착 HL60 세포를 식별하기위한 화학 유인 물질 fMLP에 대한 GFP - 태그 PKD1, 적색 발광 채널 (580-620 nm의) (알렉사 594) 녹색 배출 채널 (500-530 nm의), 및 투과광 채널을 설정합니다.
    2. 시작 "라이브"수집 및세 채널의 획득 조건을 최적화 :
    3. 세 가지 채널에 대한 강도와 레이저 파워 사이의 미세 조정은 이미지의 긴 기간 동안 photobleach을 최소화합니다.
    4. 필요한 경우, 영상의 더 나은 품질에 대한 배경 잡음 비율을 감소시킬 때마다 2 내지 4 프레임의 평균. 1 초 간격을 사용합니다.
  4. GFP의 및 DIC (미분 간섭 대비) 채널의보기에 강한 PKD1-GFP를 발현하는 세포 접착을 검색합니다. 준수 세포는 형태 학적으로 편평하고 신속하게 이동하지 않습니다.
  5. 장기 화상 (도 3a)에 photobleach을 감소시키는 채널마다 상기 검출기 이득을 증가시키면서 매우 고속 GFP-PKD1은 레이저 출력을 낮춤으로써 획득 조건을 최적화 부착 HL60 세포를 확인한 후에.
  6. 200 μL에 피펫으로 fMLP / 알렉사 594 용액 100 μl를 차지 따로 설정합니다. "시간 경과 인수"를 선택하고 간격을 설정2 초 및 프레임의 수 (100)에 취득한다.
    참고 : 간격으로 취득하는 프레임 수는 실험의 목적에 따라 달라집니다. 1-2 초 간격으로 100 프레임들은도 3에서와 같이, 촬상 실험에 사용된다. 서서히 세포 마이그레이션 긴 간격 장기 이미징 필요하다. 반대로, 빠르게 세포 마이그레이션 짧은 간격은 세포 이동의 연속적인 세부 사항을 관찰해야한다.
  7. 챔버의 위치가 변경되지 않도록 조심스럽게 4 잘 챔버의 뚜껑을 벗어. 획득을 즉시 시작하고 기준으로, 레이저 광의 스폿을 사용하여 셀을 통해 직접 200 μL 피펫에 위치하면서 자극되지 않은 세포의 3-5 이미지를 획득.
  8. 세포를 통해 fMLP / 알렉사 594 혼합물 흐름과 시간 경과 취득의 완전한 세트를 마무리도 빠른 이미지화 및되는 피펫. 이름 및 상기 데이터 분석을 실시한 될 데이터를 저장한다.

    9. 표시 및 제어 가능한 항암 치료 - 유인 자극 6. 이미징 Chemotaxing 세포

    1. 10 μL micropipetter 및 사출 팁을 사용, 갓 fMLP 및 Alexa594의 혼합물을 제조 30 μL와 마이크로 피펫을 백필.
    2. , 일정한 기울기를 생성하는 마이크로 피펫으로부터 fMLP / Alexa594 용액을 해제하도록 일정한 압력을 제공하는 장치를 현미경 스테이지의 상부에 장착되는 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 피펫을 부착하고, 유압 공급 장치에 튜브를 연결한다.
    3. 압력 공급 장치의 전원을 켜고 70 고전력 증폭기에 대한 보상 압력 (PC)를 설정합니다.
    4. 공 초점 현미경 또는 그와 동등한 형광 현미경에 40X 오일 렌즈를 통해 PKD1-GFP를 표현 HL60 세포와 시드 1 잘 챔버 커버 슬립을 마운트합니다.
    5. 다음과 같은 구성의 채널 모드에서 설정 인수 : GFP - 태그 PKD1 녹색 채널 (500-530 nm의); 화학 유인 fMLP (Alexa594)에 대한 빨강 채널 (580-620 nm의); 트랜스부착 HL60 세포를 식별하기위한 광 채널 소명에.
    6. "실시간"획득을 시작하고 3 개의 채널의 획득 조건을 최적화 : 촬상 데이터의 정량 분석​​을위한 각 채널의 강도를 조절; 세 가지 채널에 대한 강도와 레이저 파워 사이의 미세 조정은 최고의 품질과 이미지를 얻고 광 표백제를 최소화합니다. 필요한 경우, 더 좋은 화질이 매 4 프레임 평균. 우리는 일반적으로 1 초 간격을 사용합니다.
    7. "라이브"인수를 시작하여 GFP의 전망과 투과광 채널에서 강한 PKD1-GFP를 발현하는 세포 접착을 검색합니다. fMLP 구배를 시각화하기 위해 시야의 광학 중심도 (도 4A)의 중심 영역에서의 마이크로 피펫을 사용 PKD1-GFP를 발현하는 HL60 세포 부착.
    8. 시간 경과 수집을 선택하고 100에 취득 2 초 간격 및 프레임의 수와 간격을 설정합니다.
      참고 : 각 t를 수집 한 후IME 경과 시리즈 이름 및 상기 데이터 분석을 실시한 될 데이터를 저장한다.

결과

여러 HL60 세포의 주 화성의 동시 촬상 세포 이동 분석 장치를 사용하여

, 기울기가 1 분 이내에 발생 5 분 이내에 안정화하고, 2 시간에 걸쳐 유지 : 마이크로 유체 (16)의 원리에 따라, 제조자는 그라디언트 시뮬레이션 정보를 제공하고있다. 마이크로 유체에 의해 생성되는 안정 구배 높은 예측 정보는 여러 화학 주성 분석을 동시에 수행 할 수 있습니다. 본 연구에서 우리는 세 가지를 동시에 화성 분석 (그림 2A 및 영화 1)을 관찰했다. 우리는 화학 주성은 화학 주성의 웰에 주입 한 후 HL60 세포가 즉시 시작 chemotaxing 것을 발견하고, 그라데이션 안정성 시뮬레이션 결과와 일치하는 다음 60 분 동안 직선 경로 chemotaxing 있었다. 여행 경로와 형태를 추적세포 정량적 측정 및 셀 (도 2B)의 전체 경로 길이, 속도, 방향성, 및 원형을 포함하는 화성 인덱스를 사용하여 주 화성 행동 후속 비교를 허용한다. 전체 경로 길이는 경로의 무게 중심을 연결하는 선분의​​ 길이의 합이다. 속도가 시간에 전체 경로 길이를 분할함으로써 얻어진다. 전체 경로 길이로 나눈 값 (Y는 경로의 끝 좌표 마이너스 Y 처음 좌표) 방향성 상방 측정되고,로서 정의된다. 이것은 바로 위로 이동 객체 1.0을 제공합니다. 셀의 경계는 원형의 주어진 양 영역을 둘러싸 얼마나 효율적의 (백분율)을 측정한다. 원은 주어진 주변의 큰 지역이 100 %의 원형 매개 변수가 있습니다. 직선 영역은 없습니다 0 %의 원형 매개 변수가 있습니다. 선택한 화성 매개 변수에 의해 설명 된 바와 같이 우리는 정량적으로 측정 화성 동작을 보여줍니다(그림 2C).

시공간 표시 및 제어 fMLP 자극에 따라 HL60 세포에서 PKD 세포 내 현지화 모니터링

이 실험 시스템에 형광 표지 적용하려면 훌륭한 기술 사전 및 제어 화학 유인 물질의 자극이다. 역사적으로, 우리는 세포 반응과 행동을 관찰하는 동종 (또한 균일) 자극 또는 그라데이션 자극를 적용했습니다. 그러나 "장님"자극은 자극이 세포에 도달하는 방법에는 시공간 정보를 제공하지 않습니다뿐만 아니라, 우리가 자극이 표시되지 않습니다 간단하기 때문에, 자극에 대한 세포 반응의 "비정상적인"관찰에 의문을 던진다. 우리는 이전에 그 형광 염료 (Alexa594)에 도시 한 화학 유인 물질 농도 m 사이의 선형 관계를 설정 화학 유인 물질에 적용 할 수있다onitored 형광 염료 강도 15. 녹색 형광 단백질 (GFP), 형광 염료 (Alexa594), 및 투과광의 적색 발광의 취득 구성과 함께, 우리는 부착 세포 자극의인가 및 자극에 대한 세포 반응을 모니터링 할 수있다 (도 3A). 단백질 키나제는 D 관한 9,17 세포 이동에서 중요한 역할을하는 세린 / 트레오닌 키나아제 족이다. 응답하여 균일하게 도포 fMLP (적색) 자극, HL60 세포는 GFP 표지 된 단백질 키나아제 D1 (녹색)의 강력한 막 전위 (도 3b와 Movie 2)을 중재한다. fMLP 그라데이션 (적색) (그림 4A)에서, HL60 세포는 적극적으로 리딩 에지 (그림 4B 및 동영상 3)에 PKD1을 모집. 최첨단의 돌출부에 GFP의 세포 내 현지화의 확대 비교 PKD1가 (선두 가장자리의 뒤쪽에 편재되어 있음을 나타냅니다도 4c).

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도 1 세포 이동 분석 장치 (6)의 동시 화학 주성 분석까지 허용한다. (A) 반응식 6 독립적 화학 주성 분석을 동시에 모니터링하는 세포 이동 분석 소자 칩의 설계를 나타낸다. 레드 쇼 웰에 첨가 화학 유인 물질. 세포의 우물에 HL60 세포 (B) 소개 화학 유인 물질이 지속적으로 fMLP 그라데이션을 설정하는 확산하면서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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HL60 세포와 여러 화성 분석 그림 2. 동시 모니터링. (A ) 몽타주 세포 이동 분석 장치 화성 분석의 이미지가 PKD 별 0의 시간에 화성에 억제제 및 그라데이션 신청 후 12 분의 억제 효과를 조사하는 방법을 보여줍니다. 화성 HL60 세포를 30 분 동안 PKD 억제제 1 μM의 CID755673로 미리 처리 하였다. 또는 PKD 억제제의 치료없이 HL60 세포는 굶주 RPMI1640 배지, 12 분 동안 100 nM의 fMLP 구배 하나로 chemotax시켰다. (B) 기법은 추적 HL60 세포의 이동 경로 길이 및 형태를 나타낸다. 전체 경로 길이, 속도, 방향성, 및 원형 등의 화학 주성 (C) 부량. SD가 표시됩니다 ± 평균; N = CID755673 처리와 아니 그라디언트, fMLP 그라데이션 CID755673 처리없이, 그리고 fMLP 처리를위한 10, 12, 또는 11, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. 균일하게 적용 fMLP 자극에 반응 PKD1의 강력한 막 전위를 GPCR이 매개. (A) PKD1-GFP (녹색)의 멀티 채널 모니터링, 화학 유인 물질 (1 μM의 fMLP 0.1 μg의 혼합을 / ㎖ 형광 염료 알렉사 594, 레드) 및 DIC (차동 간섭 콘트라스트) RPMI 1640 배지에서 0.2 % 젤라틴으로 코팅 된 4well 챔버의 웰에 부착 HL60 세포의 동정을 행 하였다. 스케일 바는 10 μm의 =. (B) 몽타주 균일하게 적용 fMLP (빨간색) PKD1-GFP (녹색)의 강력한 막 전위를 유도하는 것을 알 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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FigurHL60 세포를 chemotaxing에서 PKD1의 전자 4. 첨단 현지화. (A) 채널 모드를 취득 구성은 fMLP 그라데이션의 시각화 및 PKD1의 시공간 역학을 용이하게한다. (A)에 - C, HL60 세포는 일시적으로 GFP - 태그 PKD1을 표현; 마이크로 피펫 (DIC), 100 nM의 fMLP (레드)에서 생성 fMLP 구배를 시각화 0.1 μg의 / ㎖ 알렉사 형광 염료 (594) (B)를 chemotaxing 셀의 리딩 에지에서의 농축 PKD1 지역화과 혼합 하였다. 스케일 바는 10 μm의 =. (C) 병합 된 이미지는 PKD1이 HL60 세포의 선단의 후방에 편재되어 있음을 보여준다. 그린 PKD1 셀룰러 지역화 나타내고, DIC 이미지 선단의 돌출 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 5 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 화성 분석의 두 가지 예 보여 셀 이동 분석 장치에 의해 여러 화학 주성 분석의 첫 번째 동시 모니터링; 그리고 두 번째로, 화학 유인 구배 시각화 실시간으로 동일한 세포에서 이벤트 신호의 시공간 역학.

여러 개의 동시 화성 분석을위한 세포 이동 분석 장치

본 연구에서는 세포 이동 분석 장치를 사용하여 다수의 동시 화학 주성 분석을 수행하는 상세한 프로토콜을 도입했다. 이 장치는 사용자가 기존의 밝은 필드 관찰에 10 배 대물 렌즈로 휴대 화성의 행동을 관찰 할 수 있습니다. 때문에 유체 흐름의 확산 특성을 보이면서, 세포 이동 분석 장치는 매우 예측 가능하고 안정적​​인 그라디언트를 생성 함과 동시에 수행 될 여섯 화성 분석법까지 허용한다. 프로토콜의 중요한 단계는신뢰할 수있는 그라데이션을 얻었다 테라스 행에 셀을 정렬 할 수 있습니다. 사용자는 엄격 화학 유인 물질과 세포의 홀더 조립 및 사출에 대한 제조업체의 지침을 따라야합니다. 자세한 설명은 또한 온라인으로 사용할 수 있습니다. 대안 화성 11-13,15 방법에 비해,이 장치는 상당히 화성 분석의 신뢰도와 효율을 향상시킨다. 크기의 세포 이동 분석 소자 칩의 네 크기는 4, 5, 6, 8 μm의 다른 유형의 세포의 크기가 수용 가능하다. 우리는 4 또는 5 μm의 세포 이동 분석 장치 칩이 HL60과 D. 적합한 것으로 약 10 내지 15 μm의 직경이다 discoideum 세포. 그러나, 하나의 제한은이 장치는 모든 셀에 적합하지 않다는 것이다. 우리 Raw267.4 세포를 세포 이동 분석 장치 화학 주성 분석을 이용하여 약간의 성공을 거두었 다. 그 이유는 Raw267.4 세포가 너무 느리게 마이그레이션하는 것이 될 수있다. 효율적인 체에 필요한 시간Raw267.4 세포의 motaxis은 그라데이션이 장치에 의해 유지되는 시간보다 훨씬 더 오래있을 수 있습니다. 대신, 트랜스 웰 마이그레이션 분석은 Raw267.4 세포 9 잘했다. 또 다른 한계는 형광 관찰 장치의 현재 불가능하다는 것이다. 향후 방향은 높은 배율과 형광 영상을 모니터하는 것입니다. 이것은 형광 검출 및 100X 대물 렌즈를 구비하는 개선 된 세포 이동성 분석 장치로 할 수있다. 또한, 동시적인 분석의 수가 모든 이러한 개선은 화학 주성 분석법 향상된 처리량과 세포에서 세포 내 마이그레이션 역학의 관​​찰을 용이하게 12로 증가된다.

HL60 세포의 높은 형질 전환 효율은 형광 단백질 태그 단백질을 발현하는

HL60 세포는 활발히 분할 백혈병 세포주이며, 현탁액에서 성장. 이전에보고 된 바와 같이 18 ~ 20, HL60 세포는 g에 강한엔 전송. 모두 지질 및 전기 유전자 전달이 시험되었고, 전기 천공 후 때문에 일렉트로으로 인한 심각한 피해 높은 형질 전환 효율을 얻기위한 중요한 높은 가능성을 취득 수단 (4)에 상세히 기술 된 바와 같이 높은 형질 전환 효율은 전기 얻었다. 그 후, 철저하고 부드러운 세포 처리는 특히 전기 후 필요합니다. 모든 미디어는 미리 가온하고 부드럽게 일렉트로 후 임의의 단계에서 세포에 첨가해야한다. 또한 전기 시약으로 세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 중요하다. 세포 사멸을 방지하기 위해, 전기 천공 한 후, RPMI 1640 일렉트로 복구 매체 즉시 세포에 첨가되어야한다. 우리는 회복 배지에서 20 % FBS를 10 % FBS보다 훨씬 높은 세포 회수율을주는 것을 발견했다. 전기 천공 후, 30 분 동안 전기 RPMI 1640 회복 배지에서 배양 큰 생존하고 형질 감염에 중요한능률. 상기 형질 전환 효율을 증가시키기 위해, 또한 제조자에 의해 추천 된 플라스미드의 대략 두 배 크기이며 형질 당 4 μg의 플라스미드 DNA를 사용 하였다.

단백질 발현과 조로 셀 번호 제한 (형질 전환 당 2 × 106 세포) : 전기 형질 전환에 두 가지 제한이있다. 벡터 플라스미드를 각각의 세포 분열 후 절반으로 희석되기 때문에, 미분화 세포에서 발현 만 세포 분열의 처음 몇시 검출된다. 차별화 된 HL60를 들어 세포는 더 이상 48 시간을 생존하지 않습니다. 그 결과, 모든 실험은 새로운 형질을 실험하기 전 6 시간을 필요로한다. 한 전기의 세포 수는 단지 어떤 생화학 적 분석을위한 최소 요구 사항을 충족합니다. 반복 사용하거나 다량의 목적을 위해, 강하게 미분화 HL60 세포주 안정적 WHI 관심의 단백질을 발현하는 것이 확립 될 것을 권장바이러스 벡터가 사용 가능하며 구성 될 수있는 경우 CH는 바이러스 벡터에 의해 형광 단백질 태그로하고있다.

공개 사항

저자는 이 작업에 대해 경쟁적인 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 NIAID, NIH의 교내 기금의 지원을 받습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640 매체 GlutaMAXLife technologies61870-036
피루브산 나트륨Thermo Fisher Scietific11360-070
소 태아 혈청Gemini Bio-Products100-106
1 M HEPES 멸균 용액, pH 7.3Quality Biological Inc.A611-J848-06
페니실린 스트렙토마이신 용액Fisher Scientific15140122
NucleofectorTM 2bLonzaAAB-1001
AmaxaTM 세포주 NucleofectorTM NucleofectorTM 용액, Singe 사용 피펫, AmaxaTM 인증 100ml 알루미늄 전극 큐벳LonzaVCA-1003
Lab-Tek 챔버 #1.0 붕규산 커버 글라스Nalge Nunc International Inc155383
2% 젤라틴 용액Sigma-AldrichG1393
FibronectinSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks' 균형 잡힌 소금 솔루션)Life technologies14025-076
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA3803
단일 웰 Lab-Tek II 커버 글라스 챔버Nalge Nunc International Inc155361
Four-well Lab-Tek II 커버 글라스 챔버Nalge Nunc International Inc155383
Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-10438
fMLPSigma -AldrichF3506-5MG
커버 유리 두께 (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScanEffector Cell Institute, Inc.MIC-1001
EZ-TAXIScan 칩(5mm)Effector Cell Institute, Inc.EZT-F01-5
1701RN 10 & l 주사기Hamilton80030
Femtotips II 주입 팁Eppendorf5242956003
Femtotips IIEppendorf930000043
TransferMan NK2, 모터 모듈, 각도 조절 장치가 있는 X 헤드 및 포지셔닝 보조 장치 포함 Eppendorf5188900056
DIAS 소프트웨어Solltech Inc.
LSM 780 META 또는 40X 1.3 NA 또는 60X 1.4 NA 오일 DIC Plan-Neofluar 대물 렌즈Carl Zeiss
가 있는 동급 컨포칼 현미경

참고문헌

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