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Biology

इमेजिंग जी प्रोटीन युग्मित न्युट्रोफिल की तरह HL60 कोशिकाओं में रिसेप्टर की मध्यस्थता chemotaxis और इसके संकेत घटनाओं

Published: September 14, 2016 doi: 10.3791/54511
Automatic Translation
1, 1, 1
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

विजुअल chemotaxis assays कैसे कोशिकाओं chemoattractant की मध्यस्थता दिशात्मक सेल प्रवास पर नियंत्रण का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक हैं। 1) वास्तविक समय, कई chemotaxis assays के उच्च संकल्प निगरानी, ​​और 2) एक साथ chemoattractant ढाल visualizing और न्यूट्रोफिल की तरह HL60 कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं का संकेत के spatiotemporal गतिशीलता: यहाँ, हम करने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन।

Introduction

कोशिकाओं भावना और एक chemoattractant ढाल के भीतर उच्च एकाग्रता की ओर ले जाते हैं, एक सेलुलर प्रक्रिया chemotaxis के रूप में भेजा। Chemotaxis निभाता ऐसे embryogenesis 1, न्यूरॉन patterning 2, कैंसर की कोशिकाओं को 3 की मेटास्टेसिस, सूजन 4 की साइटों के लिए न्यूट्रोफिल की भर्ती, और मॉडल जीव Dictyostelium discoideum 5 के विकास के रूप में कई शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका। सामान्य में, कोशिकाओं जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स 5 का उपयोग कर chemoattractants भावना। इन रिसेप्टर्स के साथ chemoattractants की सगाई heterotrimeric जी प्रोटीन Gα और Gβγ, जो बारी में नीचे की ओर संकेत पारगमन मार्ग है कि अंततः actin cytoskeleton के spatiotemporal संगठन सेल प्रवास 5-9 ड्राइव करने के लिए विनियमित सक्रिय की हदबंदी को बढ़ावा देता है।

सेल जीव विकसित किया गया है और chemotax में सुधारassays जांच करने के लिए कैसे जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) संकेत मध्यस्थता सेल प्रवास का निर्देश दिया है। Boyden कक्ष या transwell प्रवास परख Boyden 10 द्वारा 1960 में विकसित किया गया था। परख दो कुओं कि एक microporous झिल्ली से अलग हो रहे हैं के बीच chemoattractant यौगिकों की एक ढाल बनाने के द्वारा काम करता है। अपनी सादगी और उपयोग में आसानी यह सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने की तारीख chemotaxis परख करते हैं। हालांकि, परख कोशिकाओं के पलायन की प्रक्रिया सक्षम नहीं है कल्पना की जा सके। Zigmond चैम्बर पहला दृश्य microfluidic युक्ति एक स्रोत chemoattractant 11 की ओर एक संकीर्ण कसना भर में एक coverslip पर सेल प्रवास के स्पष्ट इमेजिंग की अनुमति देता है। डन 12 और 13 insall संशोधित और उच्च संकल्प और Zigmond चैम्बर chemotaxis परख के दीर्घकालिक इमेजिंग क्षमता में सुधार हुआ। क्योंकि द्रव का प्रवाह की अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक, प्रसार प्रमुख विशेषताओं में से, microfluidics अगली Generati के लिए समाधान प्रदान किया गया हैऐसे ईज़ी TAXIScan (एक सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस) के रूप में chemotaxis assays पर।

ढाल सुनिश्चित किया की स्थिरता के साथ, उपकरण छह chemotaxis assays एक साथ (चित्रा 1 ए) से बाहर ले जाने के लिए अनुमति देता है। ऊपर विभिन्न चैम्बर assays में उत्पन्न directionally तय ढ़ाल के विपरीत, गींतर Gerisch द्वारा विकसित की सुई या micropipette परख एक जंगम स्रोत 14 के साथ एक ढाल उत्पन्न करता है। परख में, chemoattractant एक स्थिर ढाल उत्पन्न करने के लिए एक जंगम micropipette से जारी है। इस सुई परख के साथ, शोधकर्ताओं ने पाया कि विभिन्न कोशिकाओं मौलिक रूप से अलग विशेषताओं के साथ pseudopods उत्पन्न करते हैं। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी लागू है, हम 15 भर में अपने मात्रात्मक माप की सुविधा के लिए ढाल कल्पना करने में सक्षम थे। इस अध्ययन में, हम एक साथ कई chemotaxis Assa की निगरानी कीमोटैक्टिक HL60 (मानव प्रोमाईलोसाईटिक ल्यूकेमिया) कोशिकाओं, तैयार करने के लिए विस्तृत विधियों का वर्णनसेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण है, और दृश्य, spatiotemporally चलाया chemoattractant उत्तेजनाओं के जवाब में इस तरह के एक जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन काइनेज डी 1 के रूप में संकेतन अणुओं की GPCR मध्यस्थता spatiotemporal गतिशीलता visualizing के साथ वाई एस। हमारे उन्नत इमेजिंग तरीकों सामान्य chemotaxis के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, और स्तनधारी सेल प्रणाली के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं।

Protocol

1. संस्कृति और मानव के भेदभाव न्युट्रोफिल की तरह HL60 प्रकोष्ठों

  1. तैयार RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) 1640 संस्कृति के माध्यम से जो RPMI 1640 मध्यम, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 0.1 मिमी सोडियम पाइरूवेट होता है, और 25 मिमी HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazineethanesulfonic एसिड)। 37 डिग्री सेल्सियस तक RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से गर्म।
  2. एक hemocytometer का उपयोग सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं लॉग चरण विकास के चरण में हैं बनाने के लिए HL60 कोशिकाओं की सेल घनत्व का निर्धारण।
    नोट: कोशिकाओं passaging के बाद तीसरे दिन लॉग चरण में आम तौर पर कर रहे हैं। लॉग चरण कोशिकाओं के घनत्व आम तौर पर 6-8 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल है। सेल घनत्व एक नई संस्कृति शुरू करने के लिए आवश्यक के बारे में 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल है।
    नोट: उदाहरण के लिए, एक टी -75 फ्लैट फ्लास्क में एक 10 मिलीलीटर नई संस्कृति के लिए, यदि लॉग चरण कोशिकाओं की सेल घनत्व 6 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल, तो लॉग चरण कोशिकाओं (2.5 मिलीलीटर 6 x 10 5 ) 10 मीटर में 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पतला हैएल नई संस्कृति। 10 मिलीलीटर संस्कृति के अंतिम मात्रा, RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से 7.5 एमएल जोड़ा जाता है बनाने के लिए।
  3. गर्म RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से गणना की मात्रा एक फ्लैट फ्लास्क में रखें। एक टी -75 फ्लैट कुप्पी संस्कृति के लिए, सेल संस्कृति की कुल मात्रा 10 मिलीग्राम है।
  4. लॉग चरण बढ़ रही HL60 कोशिकाओं की गणना की मात्रा फ्लैट फ्लास्क में जोड़े 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल घनत्व तक पहुँचने के लिए।
  5. 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
    नोट: HL60 की दुगनी समय लगभग 24 घंटा है।
  6. पैसेज RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं हर 2-3 दिनों के लिए। यह महत्वपूर्ण है कि HL60 कोशिकाओं की सेल घनत्व कभी नहीं 1.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक है और सेल पारित होने में 2 महीने से अधिक समय नहीं रहता है।
  7. प्रयोगों से पहले HL60 कोशिकाओं 5 दिन का अंतर।
    नोट: RPMI 1640 भेदभाव माध्यम RPMI 1640 मध्यम, 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 0.1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 25 मिमी एच शामिलEPES, और 1.3% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO)। दूसरे शब्दों में, यह 1640 RPMI संस्कृति के माध्यम में 1.3% DMSO है।
    1. HL60 कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से। एक फ्लैट फ्लास्क में गर्म RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
    2. एक अंतिम 10 मिलीलीटर HL60 भेदभाव संस्कृति के लिए, 130 उल DMSO सीधे RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से फ्लैट फ्लास्क में जबकि कुप्पी घूमता है, ताकि तेजी से DMSO RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से पतला है जोड़ें।
    3. एक अंतिम 10 मिलीलीटर RPMI 1640 भेदभाव माध्यम में 1.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम सेल घनत्व करने के लिए लॉग-चरण HL60 कोशिकाओं जोड़ें। संस्कृति HL60 5 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर RPMI 1640 भेदभाव माध्यम में कोशिकाओं।

2. 4well चैंबर के कवर ग्लास सतह कोटिंग

  1. रेफ्रिजरेटर से 2% जिलेटिन शेयर समाधान की बोतल ले लो, 70% इथेनॉल के साथ यह साफ है, और हुड में जगह है। टीake 1 मिलीलीटर 2% जिलेटिन शेयर समाधान और रेफ्रिजरेटर के लिए शेष जिलेटिन शेयर समाधान तुरंत वापस।
  2. जिलेटिन समाधान पूरी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस पर दव्र और इसे अच्छी तरह पिपेट करने की अनुमति दें। 9 मिलीलीटर पूर्व गर्म 1x हैंक्स 'संतुलित नमक के घोल के साथ 2% जिलेटिन शेयर समाधान पतला (HBSS) 0.2% जिलेटिन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बफर।
  3. 0.5 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर 0.2% जिलेटिन 4 अच्छी तरह चैम्बर के दो मध्य कुओं या एक 1-अच्छी तरह से चैम्बर के तल में एक गिलास को कवर के साथ क्रमश: HBSS में जोड़ें। कई दिशाओं में प्लेटें झुकाव इतना है कि तरल पूरी सतह क्षेत्र शामिल हैं।
  4. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें। प्लेटों 1 घंटे में इस्तेमाल के लिए तैयार हो जाएगा। वे ऊपर से 5 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बस कोशिकाओं को बोने से पहले, 4 अच्छी तरह से या 1-अच्छी तरह कक्षों से जिलेटिन समाधान निकालने।

3. chemotaxis परख का उपयोग सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस

  1. तैयार है और गर्म RPMI 1640 को भूख से मर माध्यम है, जो RPMI हैमध्यम 0.1 मिमी सोडियम पाइरूवेट (वैकल्पिक) और 25 मिमी HEPES युक्त।
  2. भूख से मर मध्यम RPMI 1640 में 100 एनएम FMLP (एन formylmethionyl-leucyl फेनिलएलनिन) के 100 μl तैयार करें।
  3. (बीएसए) 1% गोजातीय सीरम albumin के 3 मिलीलीटर की तैयारी / 1640 RPMI माध्यम है जिसके RPMI 1640 में 1% बीएसए भूख से मर मध्यम और 0.1% बीएसए / 1640 RPMI माध्यम के 10 मिलीलीटर होता है।
  4. कोट एक 22 मिमी वर्ग coverslip और हौसले से तैयार 1% बीएसए के साथ एक 5 माइक्रोन सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप / 1640 RPMI आरटी पर 1 घंटे के लिए मध्यम।
  5. निम्न कार्यविधि का उपयोग धारक इकट्ठा:
    1. ऊर्ध्वाधर स्थिति में लीवर के साथ धारक आधार स्थिति तो यह है कि लीवर उपयोगकर्ता की ओर झुका सकते हैं। 41 मिमी कांच की सतह के लिए 70% इथेनॉल समाधान को लागू करें। ध्यान से, एक पोंछ के साथ सतहों पोंछ ख्याल रखने के लिए उन्हें खरोंच तक नहीं।
    2. धारक आधार में 41 मिमी कांच डालें। धारक के आधार में 41 मिमी कांच के शीर्ष पर बीएसए लेपित 22 मिमी वर्ग coverslip रखो।
      नोट: लेपित वर्ग ग41 मिमी ग्लास और चिप के बीच overslip chemotaxis कोटिंग की सतह की बुनियाद पर घटित करने के लिए अनुमति देता है।
    3. हे अंगूठी (छोटे) वेफर आवास के तल में डालें, और रियर में अण्डाकार छेद के साथ धारक आधार में वेफर आवास माउंट। धारक आधार के भीतरी स्तर की स्थिति में वेफर आवास बंद करने के लिए क्षैतिज स्थिति के लिए तत्पर खींचो।
    4. एक हवाई डस्टर के साथ वेफर आवास के इंटीरियर से किसी भी धूल उड़ा। वेफर आवास में 0.1% बीएसए / 1640 RPMI मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. नीचे की तरफ कांच के साथ संपर्क में संरचनात्मक चेहरे के साथ वेफर आवास के केंद्र में बीएसए लेपित सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप माउंट।
      ध्यान दें: चिप रियर में स्थिति चिह्न (चिप के शीर्ष में छेद) के साथ सम्मिलित किए जाने की जरूरत है।
    6. छेद में रबर गैसकेट पर दो उभार फिटिंग द्वारा वेफर क्लैंप के नीचे करने के लिए रबर गैसकेट प्रत्यय।
    7. पर हे अंगूठी (बड़े) माउंटवेफर आवास के ऊपर। रियर में सेंसर छेद के साथ वेफर दबाना माउंट। आवास आधार के बाहरी लीवर जगह में वेफर दबाना बंद करने के लिए क्षैतिज स्थिति के लिए तत्पर खींचो।
    8. धारक कोडांतरण के बाद, पुष्टि करने के लिए कुओं में कोई हवाई बुलबुले देखते हैं कि प्रकाश बॉक्स पर धारक के नीचे जगह है। हवा के बुलबुले का पता चला रहे हैं, तो उन्हें उपलब्ध कराई प्लास्टिक सिरिंज एक नमूना लोड हो रहा है टिप के साथ फिट का उपयोग कर हटा दें।
    9. कवर निकालें और सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस यूनिट के शीर्ष पर थाली पर विधानसभा डाल दिया। धारक को सेंसर ब्लॉक संलग्न।
  6. Chemotaxis परख के लिए HL60 कोशिकाओं को तैयार:
    1. एक hemocytometer के साथ भेदभाव HL60 कोशिकाओं की सेल घनत्व की गणना। भेदभाव के 5 दिनों के बाद, सेल घनत्व के आसपास 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल है।
    2. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व में HL60 कोशिकाओं के अंतिम मात्रा की गणना। उदाहरण के लिए, यदि का सेल घनत्वविभेदित HL60 कोशिकाओं 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल, तो भेदभाव HL60 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल तक पहुँचने के लिए 5 0.1 मिलीलीटर% बीएसए / 1640 RPMI माध्यम के साथ resuspended हो जाएगा।
    3. अपकेंद्रित्र 200 पर HL60 कोशिकाओं भेदभाव आरटी पर 5 मिनट के लिए XG। 0.1% बीएसए की गणना की मात्रा के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और कोशिकाओं resuspend / RPMI कदम 3.6.2 में 1640 मध्यम) 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व के लिए।
  7. सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस इकाई और छवि अधिग्रहण के लिए पीसी को शुरू करें। पीसी के लिए इकाई कनेक्ट करें। सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण चालू करें। पीसी पर बारी।
  8. शुरू ऊपर सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस सॉफ्टवेयर।
    1. कैमरा, हीटर, शूटिंग, ज्ञापन, और कैमरे के चित्र: 5 नियंत्रण पैनल का निरीक्षण करें।
    2. कैमरा छवि नियंत्रण कक्ष पर, कैमरा छवि पैनल में कैमरे के केंद्र के लिए वास्तविक समय में धारक / देखने स्थिति को समायोजित करने के लिए "क्षैतिज रेखा" या "कार्यक्षेत्र लाइन" का उपयोग करें।
    3. कैमरा नियंत्रण कक्ष पर, परिभाषित चैनल के कैमरे को स्थानांतरित करने के लिए CH6 CH1 का चयन करें। एक चैनल को देखते क्षेत्रों केंद्र के लिए, क्लिक करें "हटो एल" या समायोजित करने के लिए कैमरे के एक्स-समन्वय और क्षैतिज कैमरे की स्थिति केन्द्र "आर ले जाएँ"।
    4. सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस यूनिट के सामने पैनल पर स्थिति घुंडी बदल खड़ी स्क्रीन केंद्र के लिए छवि को समायोजित करने के लिए कैमरे के समायोजित वाई-समन्वय।
    5. हीटर नियंत्रण कक्ष पर, 37.0 डिग्री सेल्सियस के लिए "धारक को अस्थायी" और 39 डिग्री सेल्सियस के लिए "थाली अस्थायी" की स्थापना की। हीटिंग शुरू करने के लिए 'गर्मी' पर क्लिक करें। इसके अलावा "धारक" पर क्लिक करें तापमान थर्मल सेंसर धारक से जुड़े का उपयोग को नियंत्रित करने के लिए।
    6. शूटिंग के पैनल पर, "अंतराल" पर "15 सेकंड" और "समय" पर "30 मिनट" अंतराल के लिए और chemotaxis परख की अवधि दर्ज करें। चेक सुरक्षा कारणों के लिए "की शूटिंग के अंत में बंद हीटर"। एक डे नामितसंग्रहीत छवियों के लिए stination।
    7. ज्ञापन पैनल पर, इस तरह के सेल लाइन के रूप में प्रयोगों के इनपुट बारीकियों का इस्तेमाल किया जाए या नहीं, उपचार लागू किया गया था, और केमो-attractants की एकाग्रता लागू होता है।
    8. चैनल है कि प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाएगा के सभी के केंद्र की स्थिति की पुष्टि करें, और यदि आवश्यक हो तो सभी चैनलों के लिए समायोजन दोहराएँ।
  9. इंजेक्षन और प्रकोष्ठों संरेखित इस प्रकार है:
    1. धारक से बफर निकालें, और अच्छी तरह से प्रत्येक चैनल के लिए ऊपर से तीसरे से बफर के 8 μl बाहर ले।
    2. वास्तविक समय सेल नंबर को नियंत्रित करने और इंजेक्शन के दौरान प्रवाह करने के लिए स्क्रीन की निगरानी करते हुए एक ही चैनल में दूसरा अच्छी तरह से कोशिकाओं के 2 μl इंजेक्षन करने के लिए एक सिरिंज का प्रयोग करें। बाद कोशिकाओं को अच्छी तरह से गठबंधन कर रहे हैं, तुरंत बफर के 8 μl वापस जोड़ने। अन्य चैनलों (चित्रा 1 बी) के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
  10. 2 जोड़े मिलीलीटर वापस धारक के लिए बफर और 1 μl 100 एनएम एफएम जोड़नेएल.पी. ऊपर से तीसरे अच्छी तरह से करने के लिए। छवि अधिग्रहण शुरू करें और डेटा को बचाने के। डेटा छवि सॉफ्टवेयर 9 ट्रेसिंग (चित्रा 2) का उपयोग कर प्राप्त विश्लेषण।

4. Electroporation साथ अभिकर्मक

  1. धारा में वर्णित 1. कोट 4 अच्छी तरह से या 1-अच्छी तरह कक्षों के रूप में के रूप में धारा 2 में निर्देश दिए HL60 कोशिकाओं प्रयोग से पहले 5 दिन का अंतर।
  2. तैयार है और गर्म RPMI 1640 electroporation वसूली माध्यम है, जो 1640 RPMI मध्यम, 20% (v / v) FBS, 0.1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 25 मिमी HEPES शामिल 37 डिग्री सेल्सियस के लिए।
  3. सही अभिकर्मक प्रयोग शुरू करने से पहले, क्रमशः, पूर्व लेपित 4 अच्छी तरह से या 1-अच्छी तरह कक्षों के कुओं में या तो 300 μl या 3 मिलीलीटर RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
  4. 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कक्षों को सेते हैं। भविष्य में उपयोग (दो सप्ताह) के लिए इनक्यूबेटर में तुरंत या दुकान इन कक्षों का प्रयोग करें।
  5. विभेदित HL6 की सेल घनत्व गणनाएक hemocytometer के साथ 0 कोशिकाओं।
    नोट: सेल घनत्व अक्सर के बारे में 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल तक पहुँचता है। सेल घनत्व 3.0 x 10 6 कोशिकाओं की तुलना में अधिक से अधिक / मिलीलीटर आमतौर पर अवांछनीय अभिकर्मक दक्षता देता है। HL60 कोशिकाओं निलंबन कोशिकाओं रहे हैं, कोई मेजबान की आवश्यकता है।
  6. 200 में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र आरटी पर 5 मिनट के लिए XG। तैरनेवाला निकालें और अभिकर्मक अभिकर्मक के 100 μl में 2 एक्स 10 6 HL60 कोशिकाओं resuspend।
  7. GFP-PKD1 प्लाज्मिड 9 में से 4 माइक्रोग्राम कोशिकाओं और अभिकर्मक अभिकर्मकों के 100 μl मिश्रण में जोड़ें और धीरे और अच्छी तरह मिला लें। प्रदान की क्युवेट में मिश्रण जोड़ें।
  8. मानव ल्युकोसैट सेल लाइन के लिए निर्माता के पूर्व निर्धारित कार्यक्रम का चयन करें और electroporation प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: अधिक जानकारी के निर्माता की वेबसाइट से उपलब्ध है।
  9. electroporation के बाद, तुरंत और धीरे से जोड़ने के पूर्व गर्म 500 μl RPMI 6140 कोशिकाओं को electroporation वसूली मध्यम, औरधीरे प्रदान की प्लास्टिक pipettes के साथ एक 1.6ml ट्यूब के लिए क्युवेट से कोशिकाओं को हस्तांतरण।
  10. 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। बीज 100 μl या 4 अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से या एक 1-अच्छी तरह से चैम्बर, क्रमशः में कोशिकाओं के 500 μl।
  11. क्रमश: 1 मिलीलीटर या 4 अच्छी तरह से है कि एक ही अच्छी तरह से करने के लिए 4 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा या एक 1-अच्छी तरह से चैम्बर के लिए RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम जोड़ें। 3 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। पूर्व गर्म RPMI 1640 को भूख से मर मध्यम करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
  12. एक 1ml पिपेट का प्रयोग, धीरे RPMI 1640 संस्कृति के माध्यम से 0.8 मिलीलीटर या 3 मिलीग्राम 4 अच्छी तरह चैम्बर की अच्छी तरह से या एक 1-अच्छी तरह से कक्ष से क्रमश: हटा दें। कोमल और पालन HL60 कोशिकाओं दूर चूसने से बचें।
    नोट: HL60 कोशिकाओं के विकास और निलंबन मीडिया में भेदभाव कर रहे हैं। या कुछ उपचार के साथ भेदभाव किया जा रहा है, HL60 कोशिकाओं बुनियाद polylysine, मज्जा, जिलेटिन, या फाई के साथ लेपित का पालनbronectin।
  13. क्रमश: एक 4 अच्छी तरह से या 1-अच्छी तरह से चैम्बर के कुएं में 0.8 मिलीलीटर या RPMI 1640 के 3 मिलीलीटर भूख से मर मध्यम जोड़ें। 1 घंटा तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोगों 9 के लिए तैयार हैं।

5. निगरानी GPCR मध्यस्थता मल्टी चैनल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा PKD1 की झिल्ली translocation

  1. एक ताजा उत्तेजनाओं के रूप में भूख से मर मध्यम RPMI 1640 में 100 एनएम FMLP और 1 माइक्रोग्राम / एमएल एलेक्सा 594 का मिश्रण तैयार करें।
    नोट: FMLP और एलेक्सा 594 जरूरतों का मिश्रण हौसले अधिकतम प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए किया जाएगा।
  2. माउंट एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर एक 40X तेल लेंस पर कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त।
  3. मल्टीचैनल विन्यास में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप सेट इस प्रकार है:
    1. chemoattractant FMLP के लिए GFP टैग PKD1, लाल उत्सर्जन चैनल (580-620 एनएम) (एलेक्सा 594) के लिए हरी उत्सर्जन चैनल (500-530 एनएम), और प्रेषित प्रकाश चैनल पालन HL60 कोशिकाओं की पहचान के लिए निर्धारित किया है।
    2. "जी" अधिग्रहण शुरू औरअनुकूलन तीन चैनलों के अधिग्रहण की स्थिति:
    3. सभी तीन चैनलों के लिए तीव्रता और लेजर शक्ति के बीच ठीक धुन इमेजिंग की एक लंबी अवधि के लिए photobleach कम से कम।
    4. यदि आवश्यक हो, औसत हर 2 से 4 फ्रेम छवियों की बेहतर गुणवत्ता के लिए पृष्ठभूमि शोर अनुपात कम करने के लिए। एक 1 सेकंड के अंतराल का प्रयोग करें।
  4. कोशिकाओं है कि GFP और डीआईसी (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) चैनल की दृष्टि से मजबूत PKD1-GFP व्यक्त पालन करने के लिए खोजें। पालन ​​कोशिकाओं आकृति विज्ञान के फ्लैट हैं और तेजी से कदम नहीं है।
  5. पालन ​​HL60 कोशिकाओं है कि अत्यधिक एक्सप्रेस GFP-PKD1, लेजर शक्ति को कम करके अधिग्रहण हालत अनुकूलन प्रत्येक चैनल के लिए डिटेक्टर लाभ में वृद्धि करते हुए लंबी अवधि इमेजिंग (चित्रा 3) के लिए photobleach कम करने के लिए पहचान करने के बाद।
  6. एक 200 μl pipetter साथ FMLP / एलेक्सा 594 समाधान के 100 μl ले लो और अलग निर्धारित करें। "समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण" का चयन करें और करने के लिए अंतराल सेट2 सेकंड और फ्रेम की संख्या 100 करने के लिए प्राप्त करने के लिए।
    नोट: अंतराल और प्राप्त करने के लिए फ्रेम की संख्या प्रयोगों के उद्देश्य पर निर्भर करते हैं। 1-2 सेकंड के अंतराल और 100 फ्रेम अक्सर चित्रा 3 में के रूप में, इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। धीरे-धीरे कोशिकाओं पलायन के लिए, अब अंतराल लंबी अवधि इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं। इसके विपरीत, तेजी से कोशिकाओं को पलायन के लिए, कम अंतराल सेल प्रवास के निरंतर जानकारी के अवलोकन के लिए आवश्यक हैं।
  7. इतना है कि चैम्बर की स्थिति को नहीं बदला गया है ध्यान से एक 4 अच्छी तरह से चैम्बर के ढक्कन बंद कर ले। अधिग्रहण के तुरंत शुरू करें और unstimulated कोशिकाओं के 3-5 छवियों को प्राप्त 200 μl pipetter स्थिति जबकि सीधे एक गाइड के रूप में लेजर प्रकाश की मौके का उपयोग कोशिकाओं पर।
  8. पिपेट कोशिकाओं पर FMLP / एलेक्सा 594 मिश्रण एक त्वरित साथ imaged और यहां तक ​​कि प्रवाह और समय चूक अधिग्रहण का पूरा सेट खत्म किया जा रहा। नाम और डेटा है कि आगे डेटा विश्लेषण के अधीन हो जाएगा बचाने के लिए।
    9. 6. दृष्टिगोचर और चलाया केमो-attractant उत्तेजनाओं में इमेजिंग chemotaxing प्रकोष्ठों

    1. एक 10 μl micropipetter और इंजेक्शन सुझावों का प्रयोग, हौसले से तैयार FMLP और Alexa594 का मिश्रण 30 μl के साथ एक micropipette backfill।
    2. एक उपकरण है कि micropipette से FMLP / Alexa594 समाधान जारी करने के लिए एक स्थिर ढाल उत्पन्न करने के लिए एक निरंतर दबाव प्रदान करता है एक खुर्दबीन मंच के शीर्ष पर रखा एक micropipette धारक को micropipette देते हैं और दबाव की आपूर्ति इकाई के लिए ट्यूबिंग कनेक्ट।
    3. दबाव की आपूर्ति चालू करें और 70 एचपीए को मुआवजा दबाव (पीसी) की स्थापना की।
    4. एक 1-अच्छी तरह से संभाग coverslip HL60 कोशिकाओं को एक confocal खुर्दबीन या इसके समकक्ष फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर एक 40x तेल लेंस पर PKD1-व्यक्त GFP के साथ वरीयता प्राप्त माउंट।
    5. चैनल मोड में अधिग्रहण सेट निम्नलिखित विन्यास में: GFP टैग PKD1 के लिए ग्रीन चैनल (500-530 एनएम); लाल चैनल (580-620 एनएम) chemoattractant FMLP (Alexa594) के लिए; और ट्रांसपालन ​​HL60 कोशिकाओं की पहचान के लिए प्रकाश चैनल वचनबद्ध।
    6. शुरू "जी" के अधिग्रहण और तीन चैनलों के लिए अधिग्रहण की शर्तों का अनुकूलन: इमेजिंग डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रत्येक चैनल की तीव्रता को समायोजित; सभी तीन चैनलों के लिए तीव्रता और लेजर शक्ति के बीच ठीक धुन अच्छी गुणवत्ता के साथ छवियों को प्राप्त और फोटो ब्लीच कम से कम। यदि आवश्यक हो, औसत बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए हर 2 से 4 फ्रेम। हम आम तौर पर एक 1 सेकंड के अंतराल का उपयोग करें।
    7. शुरू "जी" के अधिग्रहण और कोशिकाओं है कि GFP के दृश्य और प्रेषित प्रकाश चैनलों में मजबूत PKD1-GFP व्यक्त पालन करने के लिए खोज। और व्यवस्था FMLP ढाल कल्पना करने में उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाशिकी, केंद्र दृश्य (चित्रा -4 ए) के केंद्र क्षेत्र में micropipette का प्रयोग पालन HL60 कोशिकाओं PKD1-GFP व्यक्त।
    8. समय चूक अधिग्रहण का चयन करें और 100 को प्राप्त करने के लिए 2 सेकंड के अंतराल और फ्रेम की संख्या के अंतराल निर्धारित किया है।
      नोट: प्रत्येक टी इकट्ठा करने के बादIME चूक श्रृंखला, नाम और डेटा है कि आगे डेटा विश्लेषण के अधीन हो जाएगा बचाने के लिए।

Representative Results

कई HL60 कोशिकाओं की chemotaxis का एक साथ इमेजिंग सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस का उपयोग

Microfluidics 16 के सिद्धांत पर आधारित है, निर्माता ढ़ाल के नकली प्रोफाइल प्रदान की गई है: एक ढाल 1 मिनट के भीतर उत्पन्न होता है, 5 मिनट के भीतर स्थिर है, और 2 घंटा से अधिक बनाए रखा। microfluidics द्वारा उत्पन्न स्थिर ढ़ाल के अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक प्रोफाइल कई chemotaxis assays एक साथ बाहर ले जाने की अनुमति देते हैं। वर्तमान अध्ययन में, हम तीन एक साथ chemotaxis assays (2A चित्रा और मूवी 1) मनाया। हमने पाया है कि HL60 कोशिकाओं तुरंत chemotaxing शुरू कर दिया है के बाद chemoattractant chemoattractant के कुएं में इंजेक्ट किया गया था, और अगले 60 मिनट, ढाल स्थिरता के लिए सिमुलेशन परिणामों के साथ संगत के लिए एक सीधा रास्ता में chemotaxing रखा। पर्यटन पथ और आकृति विज्ञान अनुरेखणकोशिकाओं के मात्रात्मक मापन और एक chemotaxis सूचकांक कि कुल पथ लंबाई, गति, दिशात्मकता, और गोलाई कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) का उपयोग करते हुए शामिल chemotaxis व्यवहार के बाद तुलना की अनुमति देता है। कुल पथ लंबाई पथ की centroids जोड़ने वाली रेखा खंडों की लंबाई का योग है। गति समय तक कुल पथ की लंबाई को विभाजित करके प्राप्त की है। दिशात्मकता ऊपर की ओर मापा जाता है और के रूप में परिभाषित किया गया है: (वाई पथ के अंत का समन्वय शून्य Y शुरुआत की समन्वय) कुल पथ की लंबाई से विभाजित। यह एक वस्तु सीधे ऊपर की ओर बढ़ने के लिए 1.0 देता है। सेल की गोलाई कैसे कुशलतापूर्वक परिधि की दी गई राशि encloses क्षेत्र का एक उपाय (प्रतिशत में) है। एक चक्र किसी भी परिधि के लिए सबसे बड़ा क्षेत्र है और 100% की गोलाई पैरामीटर है। एक सीधी रेखा में कोई क्षेत्र encloses और 0% की गोलाई पैरामीटर है। हम मात्रात्मक मापा chemotaxis व्यवहार के रूप में चयनित chemotaxis मापदंडों द्वारा वर्णित दिखाने(चित्रा -2)।

निगरानी HL60 कोशिकाओं में PKD subcellular स्थानीयकरण एक spatiotemporally दिखाई और चलाया FMLP प्रोत्साहन के तहत

यह एक महान तकनीकी अग्रिम fluorescently लेबल लागू करते हैं और एक प्रायोगिक प्रणाली के लिए चलाया chemoattractant उत्तेजना है। ऐतिहासिक, तो या तो हम सजातीय (भी बुलाया वर्दी) उत्तेजना या ढाल उत्तेजना सेल प्रतिक्रिया और व्यवहार का पालन करने के लिए आवेदन किया है। हालांकि, "अंधा" उत्तेजना न केवल कैसे प्रोत्साहन कोशिकाओं तक पहुंचता है पर कोई spatiotemporal जानकारी प्रदान करता है, लेकिन यह भी उत्तेजना के लिए सेल प्रतिक्रिया के किसी भी "असामान्य" टिप्पणियों पर शक न डाले, सिर्फ इसलिए कि हम प्रोत्साहन नहीं दिख रहा है। हम पहले कि फ्लोरोसेंट डाई (Alexa594) से पता चला है chemoattractant एकाग्रता और मीटर के बीच एक रैखिक संबंध स्थापित करने के लिए chemoattractant के साथ लागू किया जा सकताonitored फ्लोरोसेंट रंजक तीव्रता 15। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), फ्लोरोसेंट डाई (Alexa594), और प्रेषित प्रकाश की एक लाल उत्सर्जन के एक अधिग्रहण विन्यास के साथ, हम पालन कोशिकाओं, प्रोत्साहन के आवेदन, और प्रोत्साहन के लिए सेल प्रतिक्रिया की निगरानी करने में सक्षम हैं (चित्रा 3 ए)। प्रोटीन काइनेज डी सेरीन / threonine kinases कि निर्देशित सेल प्रवास 9,17 में आवश्यक भूमिका निभाते के एक परिवार है। जवाब में समान रूप से लागू FMLP (लाल) उत्तेजना, HL60 कोशिकाओं GFP टैग प्रोटीन काइनेज डी 1 (हरा) के एक मजबूत झिल्ली translocation (चित्रा 3 बी और मूवी 2) मध्यस्थता करने के लिए। एक FMLP ढाल (लाल) (चित्रा 4 ए) में, HL60 कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अग्रणी धार (चित्रा 4 बी और मूवी 3) को PKD1 भर्ती। अग्रणी धार के फलाव में GFP के subcellular स्थानीयकरण के एक करीबी तुलना इंगित करता है कि PKD1 अग्रणी धार के पीछे में localizes (चित्रा 4C)।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस 6 एक साथ chemotaxis assays अप करने के लिए अनुमति देता है। (ए) योजना के 6 स्वतंत्र chemotaxis assays के एक साथ निगरानी के लिए एक सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप के डिजाइन से पता चलता है। लाल शो कुओं को जोड़ा गया chemoattractant। (बी) कोशिकाओं के कुओं के लिए HL60 कोशिकाओं की शुरूआत करते हुए chemoattractant एक स्थिर FMLP ढाल की स्थापना के लिए diffuses। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. HL60 कोशिकाओं के साथ कई chemotaxis assays के साथ निगरानी। (ए (बी) योजना के पर्यटन पथ लंबाई और पता लगाया HL60 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान से पता चलता है। (सी) की कुल लंबाई पथ, गति, दिशात्मकता, और गोलाई के रूप में chemotaxis की मात्रा। ± एसडी दिखाया गया है मतलब है, एन = 10, 12, या कोई ढाल, FMLP ढाल CID755673 उपचार के बिना, और FMLP उपचार CID755673 उपचार के साथ के लिए 11, क्रमशः। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।


चित्रा 3. समान रूप से लागू FMLP उत्तेजनाओं के जवाब में GPCR मध्यस्थता PKD1 के मजबूत झिल्ली translocation। (ए) PKD1-GFP (हरा) के मल्टीचैनल निगरानी, ​​chemoattractant (1 माइक्रोन FMLP 0.1 माइक्रोग्राम के साथ मिश्रित / एमएल फ्लोरोसेंट रंजक एलेक्सा 594, लाल) और डीआईसी (अंतर हस्तक्षेप विपरीत) एक 4well चैम्बर 1640 RPMI माध्यम में 0.2% जिलेटिन के साथ लेपित के एक कुएं में पालन HL60 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (बी) असेंबल पता चलता है कि समान रूप से लागू FMLP (लाल) लाती PKD1-GFP (हरा) के मजबूत झिल्ली translocation। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
FigurHL60 कोशिकाओं chemotaxing में PKD1 की ई 4. अग्रणी बढ़त स्थानीयकरण। (ए) चैनल मोड अधिग्रहण विन्यास FMLP ढाल के दृश्य और PKD1 के spatiotemporal गतिशीलता की सुविधा। एक में - सी, HL60 कोशिकाओं क्षणिक GFP टैग PKD1 व्यक्त; एक micropipette (डीआईसी), 100 एनएम FMLP (लाल) से उत्पन्न FMLP ढाल कल्पना करने के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल फ्लोरोसेंट रंजक एलेक्सा 594 (बी) chemotaxing सेल के अग्रणी धार पर PKD1 की समृद्ध स्थानीयकरण के साथ मिलाया गया था। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (सी) मर्ज किए गए चित्र कि PKD1 HL60 कोशिकाओं में अग्रणी धार के पीछे में localizes दिखा। ग्रीन PKD1 सेलुलर स्थानीयकरण पता चलता है, और डीआईसी छवि अग्रणी धार के फैलने वाला क्षेत्र से पता चलता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम chemotaxis assays के दो उदाहरणों से पता चलता है: पहला, सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण के द्वारा कई chemotaxis assays के एक साथ निगरानी; और दूसरा, chemoattractant ढाल के दृश्य और वास्तविक समय में एक ही कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं का संकेत के spatiotemporal गतिशीलता।

एक साथ कई chemotaxis assays के लिए सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस

वर्तमान अध्ययन में, हम एक सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण का उपयोग कर एक साथ कई chemotaxis assays प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की शुरुआत की। इस उपकरण के उपयोगकर्ता पारंपरिक उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन में एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ सेलुलर chemotaxis व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है। क्योंकि द्रव का प्रवाह का प्रसार प्रमुख विशेषताओं में से, सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस अत्यधिक उम्मीद के मुताबिक, स्थिर ढ़ाल उत्पन्न करता है और एक साथ बाहर ले जाने के लिए छह chemotaxis assays अप करने के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंविश्वसनीय ढ़ाल प्राप्त करने के लिए और छत लाइन पर कोशिकाओं के लिए पंक्ति में। उपयोगकर्ता सख्ती धारक विधानसभा और chemoattractants और कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करना चाहिए। विस्तृत निर्देश भी ऑनलाइन उपलब्ध हैं। वैकल्पिक तरीकों chemotaxis 11-13,15 की तुलना में, इस डिवाइस काफी विश्वसनीयता और chemotaxis assays की दक्षता में सुधार। के आकार में सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप के चार आकार 4, 5, 6, और 8 माइक्रोन विभिन्न प्रकार और कोशिकाओं के आकार को समायोजित करने के लिए उपलब्ध हैं। हमने पाया है कि एक 4 या 5 माइक्रोन सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस चिप HL60 और डी के लिए उपयुक्त है discoideum कोशिकाओं है, जो के बारे में 10-15 मीटर व्यास में हैं। हालांकि, एक सीमा है कि इस डिवाइस कोशिकाओं के सभी प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं है। हम छोटी सफलता Raw267.4 कोशिकाओं के साथ सेल गतिशीलता विश्लेषण डिवाइस chemotaxis परख का उपयोग किया था। कारण यह हो सकता है कि Raw267.4 कोशिकाओं को भी धीरे-धीरे पलायन। समय कुशल चे के लिए आवश्यकRaw267.4 कोशिकाओं के motaxis समय एक ढाल डिवाइस द्वारा बनाए रखा है की तुलना में बहुत लंबे समय तक हो सकता है। इसके बजाय, एक transwell प्रवास परख Raw267.4 कोशिकाओं 9 के लिए अच्छी तरह से काम किया। एक और सीमा फ्लोरोसेंट अवलोकन वर्तमान डिवाइस के साथ संभव नहीं है। एक भविष्य की दिशा उच्च बढ़ाई साथ फ्लोरोसेंट इमेजिंग की निगरानी है। इस सुधार सेल गतिशीलता विश्लेषण उपकरण है, जो फ्लोरोसेंट का पता लगाने और एक 100X उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित है के साथ संभव है। इसके अलावा, एक साथ assays की संख्या भी 12 की वृद्धि हुई है इन सभी में सुधार chemotaxis assays का बढ़ाया throughput और कोशिकाओं पलायन में subcellular गतिशीलता के अवलोकन की सुविधा।

HL60 कोशिकाओं की उच्च अभिकर्मक दक्षता फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए

HL60 कोशिकाओं एक सक्रिय रूप से विभाजित ल्यूकेमिया सेल लाइन कर रहे हैं और निलंबन में हो जाना। जैसा कि पहले 18-20 सूचना दी, HL60 कोशिकाओं जी के लिए प्रतिरोधी रहे हैंएकदा हस्तांतरण। दोनों लिपिड और electroporation जीन स्थानांतरण परीक्षण किया गया है, और विस्तार के रूप में वर्णित धारा 4 में उच्च व्यवहार्यता electroporation के बाद गंभीर क्षति है कि electroporation से परिणाम की वजह से उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है प्राप्त उच्च अभिकर्मक दक्षता, electroporation के साथ प्राप्त किया गया था। बाद में, पूरी तरह से और कोमल सेल से निपटने के लिए आवश्यक हैं, विशेष रूप से electroporation के बाद। सभी मीडिया पूर्व गर्म और धीरे electroporation के बाद किसी भी कदम में कोशिकाओं को जोड़ा रहना होगा। यह भी electroporation अभिकर्मक के लिए कोशिकाओं के जोखिम के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिका मृत्यु से बचने के लिए, electroporation के बाद, 1640 RPMI electroporation वसूली मध्यम कोशिकाओं को तुरंत जोड़ा जाना चाहिए। हमने पाया वसूली माध्यम में 20% FBS 10% FBS तुलना में बहुत अधिक सेल वसूली दर देता है। electroporation के बाद, 30 मिनट के लिए 1640 RPMI electroporation वसूली माध्यम में ऊष्मायन अधिक से अधिक व्यवहार्यता और अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण हैदक्षता। आगे अभिकर्मक दक्षता बढ़ाने के लिए, हम भी अभिकर्मक प्रति 4 माइक्रोग्राम प्लास्मिड डीएनए है, जो लगभग प्लाज्मिड की दो बार राशि निर्माता से सिफारिश की है इस्तेमाल किया।

प्रोटीन अभिव्यक्ति की भंगुरता और सेल नंबर सीमा (अभिकर्मक प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं): वहाँ electroporation अभिकर्मक पर दो प्रमुख सीमाएं हैं। अविभाजित कोशिकाओं में, अभिव्यक्ति detectable केवल कोशिका विभाजन की पहली जोड़ी के दौरान, जब से वेक्टर प्लाज्मिड प्रत्येक कोशिका विभाजन के बाद आधे से पतला होता है। भेदभाव HL60 के लिए कोशिकाओं को कोई अधिक से अधिक 48 घंटे के जीवित रहते हैं। नतीजतन, किसी भी प्रयोग ताजा transfections 6 घंटा प्रयोग करने से पहले की आवश्यकता है। एक electroporation के लिए सेल नंबर महज किसी भी जैव रासायनिक assays के लिए न्यूनतम आवश्यकता को पूरा करती है। दोहराव का उपयोग करें या बड़ी मात्रा के प्रयोजन के लिए, यह पुरजोर सिफारिश की है एक undifferentiated HL60 सेल लाइन स्थापित किया है कि कि स्थिरतापूर्वक ब्याज whi के प्रोटीन को व्यक्त करता हैसीएच, एक वायरल वेक्टर द्वारा एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग कर दिया गया है, तो एक वायरल वेक्टर उपलब्ध है या निर्माण किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium GlutaMAX Life technologies 61870-036
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scietific 11360-070
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
1 M HEPES sterile solution, pH 7.3 Quality Biological Inc. A611-J848-06
Penicillin streptomycin solution Fisher Scientific 15140122
NucleofectorTM 2b Lonza AAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes Lonza VCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass Nalge Nunc International Inc 155383
2% Gelatin solution Sigma-Aldrich G1393
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) Life technologies 14025-076
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3803
Single well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155361
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155383
Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-10438
fMLP Sigma -Aldrich F3506-5MG
Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mm Corning 2855-22
EZ-TAXIScan Effector Cell Institute, Inc. MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm) Effector Cell Institute, Inc. EZT-F01-5
1701RN 10 μl syringe Hamilton 80030
Femtotips II Injection tips Eppendorf 5242956003
Femtotips II Eppendorf 930000043
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.  Eppendorf 5188900056
DIAS software Solltech Inc.
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens Carl Zeiss

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 115 न्युट्रोफिल chemotaxis जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) जी-प्रोटीन संकेत पारगमन सेल प्रवास
इमेजिंग जी प्रोटीन युग्मित न्युट्रोफिल की तरह HL60 कोशिकाओं में रिसेप्टर की मध्यस्थता chemotaxis और इसके संकेत घटनाओं
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Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G… More

Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54511, doi:10.3791/54511 (2016).

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