Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d'un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Abstract

Les biofilms sont constitués de groupes de bactéries enrobées dans une matrice auto-sécrété. Ils jouent un rôle important dans la contamination industrielle, ainsi que dans le développement et la persistance de nombreuses infections liées à la santé. Un des biofilms plus bien décrits et étudiés dans les maladies humaines se produit dans l'infection pulmonaire chronique des patients atteints de fibrose kystique. Lors de l'étude des biofilms dans le contexte de l'hôte, de nombreux facteurs peuvent influer sur la formation et le développement de biofilm. Afin d'identifier comment les facteurs de l'hôte peuvent affecter la formation de biofilm et de développement, nous avons utilisé une méthode coverglass chambré statique de croître biofilms en présence de facteurs de l'hôte dérivé sous forme de surnageants d'expectorations. Les bactéries sont ensemencées dans des chambres et exposées à filtrats expectorations. À la suite de 48 h de croissance, les biofilms sont colorées avec un kit de viabilité commerciale du biofilm avant la microscopie et l'analyse confocale. Suite à l'acquisition de l'image, les propriétés biofilm peuvent être évaluées en utilisant différentes plates-formes logicielles.Cette méthode nous permet de visualiser les propriétés clés de la croissance du biofilm en présence de différentes substances, notamment des antibiotiques.

Introduction

biofilms bactériens sont des groupes de micro-organismes qui sont reliés les uns aux autres et enfermés dans une matrice auto-sécrété. ^1,2 Classiquement, ils représentent les bactéries physiquement attachés à une surface abiotique ou biotique formé dans des conditions d'écoulement. Biofilms ont également été montré à croître dans des conditions statiques (absence d'écoulement) et distal par rapport à des surfaces, par exemple à l'interface air-liquide des piscines thermales ou aux pellicules formées dans des tubes à essai. Ces biofilms sont reconnus depuis longtemps dans l'environnement et sont un préjudice important aux procédés industriels, car ils peuvent se former dans les réservoirs d'eau ou dans les tuyaux, ce qui entraîne l'encrassement biologique, la corrosion et les blocages. ^3,4

Les biofilms sont également critiques dans les milieux de soins de santé, comme il a été démontré être impliqués dans les infections liées au cathéter, les infections pulmonaires chez les patients atteints de fibrose kystique, ainsi que dans de nombreuses autres infections. ^5,6 L' une des caractéristiques des infections biofilm est le deaugmenté la sensibilité des bactéries aux antibiotiques et une altération de la clairance par le système immunitaire inné. ^7-9 Le plus bien étudiés, des scénarios cliniquement pertinentes impliquant une infection à base biofilm se produit chez les patients atteints de fibrose kystique (FK), qui sont chroniquement infectés par Pseudomonas biofilms aeruginosa. P. aeruginosa peut subir un certain nombre de changements lors de l' établissement d' une infection chronique qui le rendent très difficile à traiter. ^10,11 biofilms peuvent différentiellement activer l' immunité innée et conduire l' inflammation. ^12-14 Comme ces infections conduisent à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose, il est essentiel de comprendre les facteurs qui peuvent influer sur le développement du biofilm dans ce contexte.

Une étude récente suggère que l' hôte facteurs sont essentiels à la formation de P. aeruginosa agrégats de biofilm. ¹⁵ Ces biofilms contribuent à une sensibilité réduite aux antibiotiques et les mécanismes de défense de l' hôte. Le presence de facteurs dérivées de l'hôte, telles que l'élastase neutrophile, ainsi que les produits sécrétés à partir de micro-organismes présents dans le poumon CF, ont la capacité de moduler considérablement la formation de biofilm et de développement. ¹⁶ En outre, les biofilms interagir avec l'hôte pour moduler l' expression de nombreuses voies et initier l' inflammation. Bien que les méthodes à haut débit, tels que le test de cristal violet standard, peuvent fournir des informations en ce qui concerne le processus de biofilm, la visualisation du biofilm en réponse à ces facteurs fournissent plus d'informations en profondeur.

Dans ce manuscrit , nous décrivons une méthode d'utilisation des facteurs de l'expectoration des patients atteints de mucoviscidose pour étudier le développement de biofilms in vitro. Cette méthode permet une visualisation rapide des biofilms exposés à des crachats contenant des facteurs de l'hôte en utilisant un kit biofilm viabilité commerciale. Cette technique peut être utilisée pour identifier visuellement des changements qui se produisent lors de la croissance du biofilm en présence d'exógenonous produits, et représente une méthode améliorée pour analyser les changements dans le développement du biofilm dans diverses conditions.

Protocol

Notez que Comité d'éthique de la recherche (CER) est nécessaire pour recueillir et stocker des échantillons de crachats de sujets humains. Ces études ont été approuvées par le Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Préparation des échantillons d'expectoration CF

1. Prélever un échantillon de crachat de patients au cours des visites de routine à la clinique de fibrose kystique et de garder sur la glace.
2. Transports échantillon de crachat sur la glace dans la première heure de la collecte, au laboratoire de recherche, de se soumettre à un traitement.

2. expectorations Processing

1. Enregistrer le volume de l'échantillon de crachat obtenu. Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 2 fois le volume de l'échantillon ( par exemple, 2 parties du PBS, 1 partie de l' échantillon).
2. Mélanger le puits d'échantillon avec une pipette de transfert. Vortex l'échantillon sur le réglage le plus élevé pour 1 min pour mélanger complètement.
3. Aliquote de 1 ml de mélange ci-dessus dans le numéro 1,5 ml microtubes appropriés et centrifuger à 5000 xg pour20 min à 4 ° C.
4. Après centrifugation, éliminer le surnageant et jeter le culot.
5. Filtre stériliser le surnageant à travers un filtre de 0,22 um et de recueillir dans un tube propre.
   NOTE: Stérilité du filtrat est testé par étalement sur gélose LB et inoculer des milieux liquides.
6. Rangez surnageant expectoration à -80 ° C pour une utilisation future.
   NOTE: Les expectorations provenant de plusieurs patients peuvent également être mises en commun après filtration.
7. Avant utilisation, diluer expectoration filtrat 1/10 v / v (100 pi d'expectoration, 900 pi de médias) dans le support souhaité.
   NOTE: Ici, le bouillon de lysogeny standard (LB) Les médias ont été utilisés.

3. Chambered lamelle couvre-objet Méthode de formation de biofilms

1. Cultivez isolat bactérien d'intérêt durant la nuit dans le support souhaité à 37 ° C sous agitation (200 rpm).
   Note: Un certain nombre de bactéries différentes ont été utilisées, y compris des isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia et xylosoxidans Achromobacter. Choix des médias dépend des souches et des conditions d'intérêt, mais les médias LB peuvent être utilisés pour des expériences initiales.
2. A partir de la culture pendant une nuit, placer 40 ul de la culture dans 4 ml de milieu frais et faire croître pendant 3-4 heures à 37 ° C sous agitation (200 tours par minute) pour obtenir une culture avec une densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ d'environ 0,5 -0.6.
3. Diluer la culture de l'étape 3.2 à 1/5 dans le support désiré avec 10% de crachats filtrat ou sans filtrat expectorations (comme témoin). D' autre concentration des crachats filtrat peut être testée ( par exemple, 50% ou 100%).
4. Utiliser 200 ul de la dilution pour ensemencer des puits de chambres à glissière.
5. Permettre aux bactéries de se fixer pendant 4 heures à 37 ° C sans agitation.
6. Après 4 heures, retirer les médias et laver délicatement le biofilm avec un milieu frais 1x. Remplacez-le par 200 ul de milieu frais.
   REMARQUE: Pour étudier les effets de crachats sur le biofilm, les fresh médias devraient contenir des crachats surnageant.
7. Laisser biofilms de croître pour la quantité désirée de temps à 37 ° C sans agitation, en remplaçant tous les médias 12 h, sans lavage jusqu'à ce que le temps pour la microscopie.
   NOTE: Pour étudier l'effet des surnageants de crachats sur la sensibilité aux antibiotiques biofilm, les antibiotiques sont ajoutés aux médias suivants 24 h de croissance du biofilm et sont maintenues dans les médias jusqu'à ce que la coloration et l'imagerie des biofilms.

4. Coloration biofilms et Microscopie confocale

1. Après le temps de croissance désiré (24-48 h fonctionne le mieux), retirer le support des puits de chambre et laver délicatement chaque chambre deux fois avec 300 pi de PBS stérile.
2. Préparer le mélange coloration pour biofilm en mélangeant 1 pi de chaque colorant (fourni dans le kit de viabilité) pour chaque ml de solution nécessaires. Faire un colorant dans une solution d'eau ou de milieux.
   NOTE: L'eau est recommandé par le fabricant.
3. Ajouter 200 pi de mélange de colorants dans chaque puits de covergla chambréss et incuber à température ambiante, dans l'obscurité pendant 45 min.
4. Retirer le mélange de coloration des chambres et laver chaque puits avec 300 pi de PBS stérile. Retirer PBS et le remplacer par l'eau douce ou les médias.
5. Procéder à la visualisation de biofilms par microscopie confocale.

5. Visualizing biofilms avec Microscopie confocale

1. Lire biofilms tachées dans les chambres immédiatement après coloration (à moins de 1 h). Minimiser retard dans la visualisation des diapositives par coloration 1 à 2 chambres 8 puits à la fois.
2. Effectuer l'imagerie utilisant microscope confocal avec des lasers pour l'excitation et de filtrage des ensembles pour l'acquisition.
   NOTE: Ici, le système de disque confocale de filage avec des lasers borealis spectrales (vert: 491nm, Rouge: 561 nm) ont été utilisés pour l'excitation. Émission des jeux de filtres de 515/40 et 624/40 ont été utilisés pour visualiser les taches du kit biofilm de viabilité.
3. Prendre des images en utilisant un objectif d'eau 25X sur microscope confocal avec la caméra.
4. Prendre 3-5 images de chaque puits.
   NOTE: Ainsi, pour un 8 coverglass bien chambré, 24-40 images seront générées.
5. Enregistrer des images pour l'analyse.
   REMARQUE: Les images doivent être enregistrées en tant que fichiers OME-TIFF à être analysés en utilisant COMSTAT ^18,19. Instructions pour l'analyse d'images de biofilm peuvent être trouvés à http://www.comstat.dk/. Une fois que les images sont importées, des paramètres tels que l'épaisseur moyenne, la biomasse et la couverture de surface pour chaque canal (rouge et vert) peuvent être analysés.

Representative Results

La conception d' ensemble de l'expérience est représenté sur la figure 1. L'utilisation de ce protocole fournit une méthode pratique pour visualiser les changements dans les biofilms cultivés pour différentes périodes de temps (par exemple, 24, 48 ou 72 h). Surtout, des signaux exogènes tels que des crachats filtrats peuvent être ajoutés pour visualiser les changements dans le développement du biofilm. Comme on le voit sur la figure 2, la présence de 10% filtrats de crachat peut modifier l'architecture du biofilm (figure 2A, les panneaux inférieurs). ¹⁶ Ces images peuvent être analysées en utilisant un logiciel COMSTAT pour obtenir des matrices de biofilm clés, dont l' épaisseur moyenne du film biologique, la biomasse totale et la couverture de surface. Cela se traduit par une augmentation globale de l'épaisseur du biofilm (figures 2B et 3). ¹⁶ Les effets des antibiotiques sur les biofilms dans les expectorations de présence est représenté sur la figure 3. Par visuali zing les changements dans le développement du biofilm, on peut mieux apprécier comment différents facteurs peuvent affecter la croissance biofilm, à une bien meilleure mesure que les tests de biofilm traditionnels, tels que coloration au cristal violet.

Figure 1: La conception générale de l' expérience. Schéma du protocole de base. Un (O / N) culture d'une nuit est diluée à 1/1000 et a permis de se développer à une DO finale ₆₀₀ de 0,5. On dilue encore 1 / 1.000 et 200 pi est ensemencées dans bien des coverglass chambré et a permis de fixer pendant 3-4 heures. Par la suite, milieu est retiré et remplacé par du milieu frais. Les biofilms sont autorisés à croître pendant le temps désiré. Médias, les produits exogènes ou des antibiotiques peuvent être ajoutés dans les biofilms. Après la croissance, les médias est enlevé, les biofilms sont colorées et l'imagerie confocale est effectuée.ge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Des images représentatives du développement de biofilm après exposition à filtrats d'expectorations. (A) Des images représentatives du complexe Burkholderia cepacia (BCC) Les isolats cliniques suivants 48 h de croissance coverglass chambré avec seul (panneaux supérieurs) les médias ou en présence de 10 filtrats% d'expectorations (panneaux inférieurs) , suivie par une coloration avec le kit biofilm de viabilité. 1 unité d'échelle représentent 19,68 um. (B - C) d'épaisseur moyenne des isolats (B) et morts: rapport direct (C) des images multiples de BCC isolats cultivés pendant 48 heures dans des chambres de diapositives en l'absence (barres blanches) ou en présence (barres noires) de l' expectoration filtrats. Chaque barre représente la moyenne de 45 images tracéesavec l'erreur standard de la moyenne. ** P <0,001 par rapport au contrôle (médias seulement) en utilisant le test de Kruskal-Wallis. La figure adaptée de Kennedy et al. ¹⁶ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Des images représentatives de traitement antibiotique sur les biofilms exposés au filtrat expectorations. (A) Images d'isolats cliniques de Burkholderia suivants 48 h de croissance coverglass chambré avec le milieu seul ( à gauche) ou en présence de 10% filtrats d'expectoration ( à droite) avec ou sans 1,000 pg / m de tobramycine. Biofilms ont été cultivées pendant 24 heures dans du milieu seul ou du support additionné de 10% (v / v) de crachat filtrats. Après 24 heures, le milieu a été retiré et remplacé par médiun (+/- crachats) contenant des antibiotiques. 1 unité d'échelle représentent 19,68 um. (B - C) d'épaisseur moyenne des isolats (B) et morts: rapport direct (C) d'images multiples (n = 9) de B. vietnamiensis isolats cultivés pendant 48 heures dans des chambres de diapositives en l'absence ou en présence d'expectoration filtrats. Chaque barre représente la moyenne de 45 images tracées avec l'erreur standard de la moyenne. ** P <0,001 par rapport au témoin (0 pg / ml) en utilisant le test de Kruskal-Wallis. La figure adaptée de Kennedy et al. ¹⁶ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les procédés décrits ici permettent une visualisation des biofilms bactériens cultivés en présence de produits exogènes. Sans surprise, la production des exoproducts est d'une importance lors de l'utilisation de ce type de système. Par exemple, dithiothréitol (DTT), est souvent utilisé sur des échantillons de crachats humains pour aider à liquéfier les échantillons. Cependant, l'effet de DTT seul peut réduire le développement de biofilm et la viabilité (données non présentées). Ainsi, des contrôles appropriés pour toutes les conditions sont nécessaires. En outre, l'addition de produits de crachats humains crée la variabilité inhérente de l'essai en raison du fait que le crachat de chaque patient a un microbiome unique. Pour régler pour cela, nous avons utilisé des échantillons de crachats communs pour éviter des résultats spécifiques des patients. En outre, le choix du support approprié est important lorsque vous utilisez un système modèle. médias standard pour la croissance du biofilm de l'organisme visé sont recommandés pour la configuration initiale du système. Si le but de l'expérience est d'identifier comment les produits exogènes affectent la formation de biofilm, un milieu riche en nutriments qui fournit la formation de biofilm adéquat est suggéré. Cela permettra une alimentation suffisante pour la croissance tout en déterminant comment les facteurs exogènes peuvent affecter le biofilm. D'autres médias, tels que des milieux minimaux ou définis, peuvent être utilisés pour mieux imiter certaines conditions. D'autres supports ont été utilisés avec de bons résultats dans ce système (données non présentées). L'attachement des biofilms à la lamelle chambré est robuste, mais le plus grand soin doit être pris lors de la suppression / ajout de médias ou pendant des étapes de lavage des biofilms pour éviter de perturber les biofilms.

L'utilisation de la tache en direct mort selon le protocole du fabricant a donné de bons résultats pour le système décrit. Un certain nombre de facteurs peuvent influer sur le rapport de fluorescence des images (y compris l'absorption de colorant de bactéries, de la densité relative des paramètres de biofilm et de gain du détecteur), cependant, cette méthode devrait se rapporter à ce qui est observé dans l'images. D'autres mesures peuvent être utilisées pour représenter la quantité relative de morts biofilm / live, tels que la biomasse des cellules mortes en tant que rapport de la biomasse totale présente dans le biofilm (comme dérivé de COMSTAT). Utilisation de comptes bactériens pour confirmer la viabilité biofilm dans des expériences répétées est recommandé de confirmer les observations visuelles de ce modèle. En raison de l'hétérogénéité inhérente des biofilms, des images multiples à partir de chaque chambre, et plusieurs chambres doivent être utilisées pour chaque condition d'une expérience. Cela ajoute au coût et la durée de ces expériences.

L'acquisition des images est important avant l'analyse des données de ces expériences. Il faut prendre soin de ne pas saturer les images et pour déterminer la configuration du microscope. Selon le niveau de détail requis et le microscope disponibles, un certain nombre d'objectifs différents (10X, 25X, 40X et 63X) peut être utilisé pour acquérir des images, mais nous constatons que l'objectif 25X donne de meilleures images. L'épaisseur de til Z-stack peut également affecter la qualité globale de l'image et le niveau de détail. Avoir des images prises tous les 0,5-1 um semble fournir des images claires à 25X objectif, tout en gardant les images Z-stack à une taille qui peut être analysé par COMSTAT sur les systèmes informatiques standard.

Ces expériences sont plus coûteux et plus long que d'autres essais de fixation, et ne peuvent être effectuées de manière à haut débit. Dans cette procédure, les bactéries se fixent à une surface de borosilicate, qui ne reflète pas une condition in vivo et peuvent affecter la formation et le développement du biofilm. Cependant, ils fournissent des informations supplémentaires et peuvent générer des hypothèses pour mécanisme lié à la résistance aux antibiotiques biofilm et la réponse physiologique à un signal exogène. Si le but de l'expérience est de comprendre comment les biofilms changent en réponse à différents facteurs, plutôt que d'identifier des composés anti-biofilm en utilisant des méthodes à haut débit, par exemple, les informations supplémentaires acquises en utilisant tsa technique rend la méthode valable. Ainsi, la méthode actuelle est une avancée significative sur les précédents essais de fixation limités tels que l'essai de cristal violet, qui est le plus couramment utilisé pour étudier les biofilms.

Les étapes critiques à cette procédure: 1) Assurer un traitement rapide des échantillons de crachats pour éviter la dégradation; 2) Être doux avec des changements dans les médias sur les biofilms d'éviter toute perturbation du biofilm et 3) Faire des mesures répétées de l'imagerie biofilm pour assurer une représentation précise de l'épaisseur de biofilm en raison de l'hétérogénéité de la formation de biofilm.

Une fois que le système est mis en place pour une espèce bactérienne donnée, on peut tester un certain nombre de conditions différentes, y compris les effets des facteurs exogènes sur plusieurs isolats cliniques. Ce système a été utilisé pour étudier l'effet des antibiotiques sur les biofilms exposés à l' expectoration humaine ¹⁶ et de comparer des isolats cliniques hautement résistants et résistantes intermédiairement. ¹⁷ Les modifications apportées à la lamelle chambré, tels que le revêtement du fond avec la mucine ou de collagène micro-échafaudage (par exemple, Puracol), peuvent en outre étendre la gamme d'expériences possibles. Il peut être possible d'adapter ce système pour étudier les interactions directes, telles que celles entre les cellules epitheliales et les bactéries, ou entre différentes espèces bactériennes. Ceci est une extension du modèle décrit par Jurcisek et al. ²⁰ Le procédé utilise une croissance de glissement de la chambre semblable à celle décrite ici et utilise la formaline pour fixer les biofilms avant la visualisation. En variante, dans cette méthode, nous visualisons biofilms immédiatement après la coloration et ne pas utiliser un fixateur. De plus, on ajoute des facteurs exogènes afin de tester l'effet des antibiotiques sur les biofilms. Ce modèle a donc le potentiel pour faire avancer considérablement notre compréhension des biofilms bactériens dans les maladies humaines.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf