Introduction
חסינות מולדת מספקת שורה ראשונה מיידית של הגנה מפני זיהומים ומחלות במגוון רחב של אורגניזמים. זה לא רק משיג את התגובה החיסונית הראשונית כדי לחסל את האיום, אבל זה גם משחק תפקיד מרכזי בהפעלה והדרכת החסינות אדפטיבית כי מבצעת תגובות משתי חיסוניות בצורה פתוגן ספציפית. דלקת היא מתוזמרת על ידי שפע של ציטוקינים chemokines, שבתורה יש את היכולת למשוך תאים חיסוניים אחרים לאתר של זיהום וכדי לגרום סימני הקרדינל של דלקת, כגון אדמומיות, נפיחות, כאב, אובדן התפקוד, וחום . משך ועוצמת הדלקת תלוי במספר גורמים, אך בפתרון דלקת ושחזור הומאוסטזיס הוא שלב קריטי, כדי למנוע התפרצות של מחלות דלקתיות כרוניות. התפתחויות אחרונות בתחום הנוירולוגיה אימונולוגיה יש נפרם מנגנונים עצביים ספציפיים עם פוטנציאל טיפולי עצום לשלוט inflammation היא במערכת העצבים המרכזית ובפריפריה. אחד המנגנונים האלה הוא המסלול אנטי דלקתי כולינרגית (CAP), הידוע גם בשם רפלקס הדלקתי, אשר מונע על ידי מערכת העצבים האוטונומית 4, 5.
הוא חשב כרגע כי מתווכים דלקתיים להפעיל עצבים תחושתיים ושולחים אותות על מצב הדלקת במערכת העצבים המרכזית. תגובה רפלקס אז מופעל באמצעות העצב התועה efferent. מחקר מקיף על הפרטים האנטומיים של CAP חשף דגם הפאראסימפתטית-אוהד מורכב משני עצבים, העצב התועה ואת עצב טחול, בהתאמה 6. בשנות ה CAP, העצב התועה כולינרגית efferent מופעל מסתיים גנגליון צליאק-mesenteric, וכתוצאה מכך ההפעלה של עצב הטחול אדרנרגיים על ידי מנגנון טרם נחקרו. עצב הטחול, ולכן הופעל, ידוע פנימיvate בסמיכות לתאים חיסוניים עיסת לבן, אזור שולי, ואת עיסת אדום של הטחול, קרן איבר חובה של CAP 7, 8. ונוראפינפרין (NE) מן קצות עצבי טחול נקשר לרצפטורים אדרנרגיים β 2 המתאימים הביעו על לימפוציטים מסוג T טחול. זה גורם transferase אצטיל כולין (צ'אט) אצטילכולין בתיווך (ACH) שחרור, אשר בתורו מפעיל קולטני אצטילכולין ניקוטינית α7 (α7nACh) על מקרופאגים, וכך להגביל ייצור ציטוקינים ודלקות 2. כתוצאה מכך, עכשיו זה ברור כי מערכת העצבים היא מסוגלת לווסת דלקת ברקמות היקפיות וכדי לשחזר הומאוסטזיס מקומית חיסונית.
כפי שהשם של המסלול מרמז, מערכת האח היא בעל חשיבות מרכזית לתפקוד מסלול המסדיר נוירו-החיסון הזה. מעניין, המנגנונים מעורבים בהפעלהה- CAP נראה שונה בפריפריה ובמערכת העצבים המרכזית. למרות החשיבות של קולטנים ניקוטינית (α7nAChR) בטחול הודגמה מוקדם 9, קולטנים מוסקריניים (mAChR) הם חובה עבור ההפעלה המרכזית של המסלול 10, 11. לאחרונה, ממשל היקפי של אגוניסט M1 מוסקריניים מרכזי הפועל α גורם נימק בסרום מודחק משמעותי וטחול גידול (TNFα) במהלך endotoxemia בעכברים הקטלני, פעולה שחייב שלם עצב תועה ואת עצב טחול איתות 12. גם הראינו לאחרונה כי עכברים שחסרו פרוסטגלנדין E 2 (PGE 2) לא היו מסוגלים להגיב לגירוי העצב התועה ולא למטה להסדיר את שחרורו המושרה LPS של ציטוקינים בסרום והטחול 3. לכן, CAP יכול גם להיות מוסדר על ידי מערכות אחרות מאשר pathw האח הראשיAY.
העצב התועה כבר בשם כזה בגלל כמובן לנדוד בגוף, innervating אברים עיקריים כולל הכבד, ריאות, טחול, כליות, ואת הבטן 13. בהתחשב עצבוב גדול זו והשפעת אימונוסופרסיבי מאוד חזקה של העצב התועה, את הפוטנציאל הטיפולי של CAP יכול לכסות מגוון רחב של מצבים דלקתיים. עצב התועה יכול להיות חשמלי (או מכאני) מופעל, עם שליטה על המתח ותדירות, ובניגוד לטיפול קונבנציונלי, ללא תרופות הוסיפו לגוף. ניסויים נערכים כיום בחולי ראומטיים, למשל, כדי לבדוק את המשמעות הקלינית של VNS בטיפול בדלקת כרונית 14. בסך הכל, התקשורת חיסונית-נוירו והרגולציה של דלקת כרגע תחת חקירה, אשר תספק טיפול חלופי אפשרי לטיפול קונבנציונלי. לכן, ניתוח של העצב התועה stimulatioאפקט n באיברים מעוצבבים השונים, אלא גם אפיון של הפעולה הטיפולית הפוטנציאלית מודלים בבעלי חיים למחלות דלקתיות כרוני, בהחלט ייתן תובנה ולקוות מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות.
המתודולוגיה המקורית שפותחה על ידי טרייסי ועמיתיו 4 לא יכולה להיות משורבבת לתחום שלנו של מחקר עקב גירוי יתר של התגובה הדלקתית (על ידי מנה קטלנית של LPS) ומגוון מדי-זמן קצר בין הפעלת CAP ואת ההקראה. בעבודה הנוכחית, נציג את השינויים שבוצעו בפרוטוקול המקורי, להשוות בין שתי מתודולוגיות שונות על רמות ציטוקינים, ולהאיר של התבוננות חדשה ההפוכה על איבר המטרה (הטחול).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ולשימוש בחיות אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית בבית קרולינסקה בסטוקהולם. ועדת האתיקה המקומית בעקבות הנחיות האיחוד האירופי על טיפול בבעלי חיים.
הערה: השינויים העיקריים מן הפרוטוקול המקורי הם זמן החלמה לאחר ניתוח (6 שעות לעומת 1 hr) ורמת LPS מוזרק (2 מ"ג / ק"ג לעומת 15 מ"ג / ק"ג). אחרת, הגדרות שונות הקשורות לניתוח עצמו לא שונו.
1. הכנת חומר עבור גירוי
- הפעילו את המחשב ואת מערכת הרכשת נתונים צמוד (איור 1 א) מגרה אלקטרודה.
- הזן את תכנית מכירים.
- הכן פתרון המניות של LPS בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל ב PBS 1x, aliquot אותו, ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. ביום הניסוי, להפשיר aliquot ולהכין ADEמדגם של LPS קווייט (0.5 מ"ג / מ"ל) כדי להזריק סביב 100 μl לתוך החיה, לפי משקל.
2. הכנת בעלי החיים עבור הרדמה
- השתמשו C57Bl / 6 עכברים. לשמור אותם בתנאי אקלים מבוקר עם מחזור אור 12-hr / כהה, להאכיל אותם צ'או מכרסמים רגילים, ולתת להם כרצונך מים.
- בצע ניתוח על עכברים כי שוקל בסביבות 25 גרם ביום של הניסוי.
הערה: כאשר תגובות דלקתיות מושרות, חשוב במיוחד לבצע בדיקות ותצפיות קבועות של התגובות הקליניות בחיות. המתת חסד מוקדם על ידי שאיפת 2 CO נדרשת אם תנאי החיה אינו עומד בקריטריונים האתיים. - הגדר את מכונת ההרדמה.
- ודא כי הצינורות מחוברים כראוי והוא לא ניזוק בצורה כלשהי. ודא כי במקום מאוורר פועל כהלכה. חבר את מסנן מפתח בקבוק isoflurane ולמלא את vaporizer עם כמות isoflurane מספיק.
- פתח את אספקת הגז (אוויר וחמצן) ולוודא כי הבקבוקים המכילים גז מספיק לצורך הניסוי. מחבר שלושה כיוונים ואז תוכל לשלוח את זרימת isoflurane לתא האינדוקציה או המסכה.
- הפעל את המחבר המשולש לתא האינדוקציה. פיק עכבר אחד מהכלוב הביתה ולהכניס את החיה לתוך התא. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 1.0 L / min ואוויר 1.0 L / min. התאם את ריכוז isoflurane ל 4 - 5%.
- כאשר רמת ההרדמה הרצויה, כאשר רמת ההרדמה הרצויה, לגלח את אזור הניתוח ולעבור את החיה מבית הבליעה אל המסכה. הפעל את מחבר שלושה כיווני זרימת מסכה. התאם את הרגולטור זרימת חמצן 0.25 L / min ואוויר 0.25 L / min.
- התאם את ריכוז isoflurane ל -1.5 - 2.5%. בדוק את רמת הרדמה בשלט רפלקס וקצב הנשימה לפני תחילת procedur כירורגידואר.
- תקן את הרגליים של העכבר על ספסל העבודה באמצעות דבק. ודא כי האף של החיה עדיין בדקדקנות את המסכה.
3. כירורגיה ועידוד של העצב התועה
- לחטא את אזור הניתוח עם 70% אתנול.
- באמצעות אזמל, לחתוך את העור בזהירות ברמה של הצוואר (חתך של בסביבות 1 עד 1.5 ס"מ).
הערה: הפרוטוקול, הליך הניתוח מסתיים כאן עבור חיות-דמה פעל. ואכן, הוכח כי רק נגיעה בעצב עם כלי מתכת כבר מגרה אותו במידה מסוימת. לכן, כדי לקבל חיה מלאה ניתוח מדויק יותר כאשר משתמשים בכמות קטנה של LPS, להפסיק את הניתוח בשלב זה. - בעזרת מיקרוסקופ (אובייקטיבי 12.5X), לבודד את העצב התועה השמאלי מן העורק הראשי באמצעות מלקחיים לנתח. ראשית לאתר את שריר sternocleidomastoid ידי הסרת שכבות עור ושומן, ולאחר מכן לחזור בוכדי לשים את המלקחיים מאחורי שניהם עצב ואת העורק.
הערה: השלב הבא הוא מאוד מסובך, כמו העצב העורק הם דבקו באופן הדוק זה לזה. לכן, קל מאוד לחתוך את הספינה ולהרוג את החיה. עם זאת, על ידי הצבת מלקחיים בזהירות רבה בין העצב והעורק, הם בסופו של דבר להפריד, וזה אפשרי לבודד את העצב. - מניחים את האלקטרודה (1B איור) תחת העצב התועה. אלקטרודה המחט ארוכה למדי, כך שגם אם העצב מעביר מעט במהלך הגירוי, זה תמיד יהיה במגע עם האלקטרודה.
- לביצוע הזרקה הזרקה (IP) של LPS (2 מ"ג / ק"ג) בעזרת מזרק (עבור לקריאה על רמות הציטוקינים; כלומר, כדי למדוד את השפעת ויסות למטה).
- מתן 5 דקות לפני תחילת הגירוי.
- לעורר את העצב התועה עבור 5 דקות ב 5 V ו- 1 הרץ על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנית הכר.
- מִחָדָשׁלהזיז את אלקטרודה ו תפר את הפצע של החיה עם חוט תפירה כירורגית.
- רסס סרט מכשול אין סטינג (NSBF) על הפצע כדי לשפר ריפוי להגן מפני זיהומים.
שחזור 4. של בעלי החיים
- לאחר הניתוח, להזיז את החיה חזרה לכלוב בבית שלו עבור התעוררות והתאוששות. תחת אור אינפרא-אדום על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף, לוודא לפקח על בעלי חיים עד להכרה מלאה כבר חזר.
- בואו החיה להתאושש בכלוב שלה עבור 6 שעות לפני ההקרבה לניתוח.
הערה: ההשפעה של גירוי עצב הואגוס היא מאוד מהירה וגם הוכחה להיות ארוך שנמשך (עד 48 שעות), כך שזמן ההתאוששות יכול להיות מוגדר על ידי הנסיין בהתאם לצרכי המחקר.
5. קורבן לניתוח נוסף
- מניח את החיה בכלוב הקשור מכשיר ממשל 2 CO.
- הגדר את המכשיר על 5מחזור -min משאיפת 2 CO.
- כאשר המתת חסד נעשה, לאסוף את האיברים של עניין ולהקפיא אותם ישירות על קרח יבש לניתוח נוסף (למשל, למדידת רמות הציטוקינים בתמציות הטחול באמצעות TH1 העכבר / TH2 9-Plex assay) 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רמה של TNFα ו- interleukin-1β (IL-1β) לאחר הגדלת ועבר זמן רב לאחר הניתוח הקטנת המינון של LPS
כפי שהוצג קודם, באמצעות פרוטוקול מקורי, VNS ירד לרמות של TNFα (169.3 ± 24.9 pg / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 39.7 ± 10.8 pg / מ"ג ב VNS, p <0.001) ו- IL-1β (360.0 ± 40.21 pg / מ"ג ב SHAM לעומת 191.7 ± 27.2 pg / מ"ג ב VNS, p <0.01) הטחול לאחר הזרקת LPS הזרקה (15 מ"ג / ק"ג) (איור 2 א). לאחר שינוי הזמן לניתוח מ -1 עד 6 שעות, ולהקטין את המינון LPS מן 15 ל 2 גרם / ק"ג, צפינו רק אפקט של VNS על TNFα (13.67 ± 1.81 פיקוגרם / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 8.82 ± 1.20 פיקוגרם / מ"ג ב VNS, p <0.05), בעוד IL-1β לא נפגע (368.62 ± 35.65 pg / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 304.99 ± 43.54 pg / מ"ג) (איור 2B). בלי שום inj LPSשיקוף (כלומר, מלוח), אין הבדל יכול להתגלות לאחר VNS (איור 2C).
רמות של keratinocyte chemoattractant / האדם צמיחה-מוסדר Oncogen (KC / GRO) הטחול לאחר VNS באמצעות תנאים שונים
עם הפרוטוקול המקורי, הראינו כי KC / GRO היה חזק למטה מוסדר על ידי VNS (597.4 ± 17.8 pg / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 416.4 ± 29.7 pg / מ"ג ב VNS, p <0.001) (איור 3 א). באמצעות נקודת 6-hr זמן 2 מ"ג / ק"ג של LPS, לא חל שינוי משמעותי בין זיוף וחיות VNS (איור 3B), בעוד VNS הוא עדיין חזק על TNFα, למשל. עם זאת, כאשר אין LPS הוזרק עבור נקודת זמן 6-hr, צפינו עד-רגולציה חזקה של KC / GRO הבאים VNS (59.37 ± 4.29 פיקוגרם / מ"ג בהעמדת הפנים לעומת 141.22 ± 10.56 pg / מ"ג ב VNS, p <0.001 ) (איור 3 ג). כצפוי, רובציטוקינים אחרים (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, ו IFNγ) היו ברמות נמוכות מאוד (אם ניתן לגילוי), ואין הבדל ניתן לראות בין זיוף ו-מגורה VNS חיות.
איור 1: תמונות של החומר הדרוש על מנת לבצע את גירוי עצב הואגוס. א) i) מחשב, ii) מערכת הרכשת נתונים, ו- III) מכשיר אלקטרודה מגרה. B) תקריב של האלקטרודה כי מושם תחת העצב התועה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: רמות של TNFα ו- IL-1β הטחול Extracts של זיוף ו בעלי חיים שטופלו VNS. בעלי חיים חשופים דמה או ניתוח VNS, על פי התנאים הבאים: א) התאוששות 1-HR לאחר הזרקת ip של 15 מ"ג / LPS ק"ג, B) התאוששות 6-hr לאחר הזרקת ip של 2 מ"ג / LPS ק"ג, ו- C) התאוששות 6-hr ללא הזרקת LPS. רמות נמדדות על צלחת פרו-דלקתית מצופה-ציטוקינים כפי שבאו לידי ביטוי pg / מ"ג של רקמות. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. כוכבית מצביעה על הבדלים סטטיסטיים בין VNS ועכברי דמה (n = 8 בכל קבוצה). T -test * התלמיד p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: רמות של KC / GRO ב Spתמציות לין של זיוף ו VNS שטופלו עכברים נאיביים. בעלי חיים חשופים דמה או ניתוח VNS, על פי התנאים הבאים: א) התאוששות 1-HR לאחר הזרקת ip של 15 מ"ג / LPS ק"ג, B) התאוששות 6-hr לאחר הזרקת ip של 2 מ"ג / LPS ק"ג, ו- C) התאוששות 6-hr ללא הזרקת LPS. רמות נמדדות על צלחת פרו-דלקתית מצופה-ציטוקינים כפי שבאו לידי ביטוי pg / מ"ג של רקמות. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM. כוכבית מצביעה על הבדלים סטטיסטיים בין VNS ועכברי דמה (n = 8 בכל קבוצה). T של סטודנט -test *** p <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז גילויו בתחילת שנות ה -2000, המנגנונים של CAP נחקרו ביסודיות. עכשיו יש לנו תמונה טובה של המסלול, ובפרט, איבר היעד, הטחול, שבו NE, תאי T הזיכרון, אח, ו מקרופאגים העבודה כצוות יעיל מאוד למטה לווסת מתווכים דלקתיים 2. גם פרסמנו נתונים לאחרונה על החשיבות של מערכת פרוסטגלנדין תפקודית בעכברים, בפרט, 2 PGE, אשר ללא ספק מרכיב חובה עבור שחרור אח הטחול לאחר ההפעלה של CAP 3.
הטכניקה הניסיונית, המכונית גירוי עצב הואגוס, יכולה להתבצע בקלות במעבדה, אבל כמה פרוטוקולים חשובים יש להקפיד לגבי החיות ואת הליך הניתוח. אנו משתמשים אות גירוי גל סינוס, שאמורה להיות גירוי "לחייב מאוזן", על מנת למנוע בניית מטענים חשמליים בתוךעצב שיכול להרוס אותו (להבדיל גירוי monophasic). בעוד מגרה את העצב, לא ניתן להפריד בין הביא מן אות efferent, אשר יכול להיעשות רק למטרות אחרות עם ניסויי vagotomy. המשך והתדירות המשמש לצורך הניסוי ידוע כבעלי השפעה על שחרור ציטוקינים הבאים אתגר דלקתי, למשל, אבל לא ישפיעו על קצב לב או לתת תופעות לוואי ברורות בקרב קבוצת ביקורת.
קודם כל, הנסיין חייב תמיד לזכור כי הטיפול, הניתוח, וההחלמה של החיות חייבים להיעשות על פי הכללים האתיים לטיפול בבעלי חיים. נקודה נוספת היא כי תרגול הניתוח היא בעלת חשיבות רבה. בידוד העצב התועה הוא צעד קשה, אשר יכול להיות קטלני עבור החיה אם נזק בכלי הדם מתרחשת. עם ניסיון, הניתוח יכול להתבצע תוך 15 - 20 דקות, כלומר החיה לא צריכה להיות מורדמת במשך תקופה ארוכה של זמן, אשרעוזר להתאוששות.
דיון יכול להעלות גם לגבי הבחירה חי-דמה פעל טוב. בפרוטוקול שלנו, השתמשנו חיות שעברו ניתוח רק ברמה של הצוואר, ללא הצבת אלקטרודה תחת העצב התועה. הסיבה לבחירת אפשרות זו הייתה רק הצבת אלקטרודה תחת העצב היה מכאנית לגרות את העצב במידה מסוימת (כמו נצפתה בעבר) 19, יוצרת את הסיכון של מיסוך מנגנונים אפשריים המתרחשים ברמות נמוכות מאוד של דלקת. אם באמצעות מינונים גבוהים מאוד של LPS, השליטה-דמה מופעלים הטובה כנראה תהיה למקם את האלקטרודה תחת העצב, כמו ההשפעה של ניתוח הדמה לא תתערב או להסוות את אפקט גירוי חשמלי הברור על ההתפרצות של ציטוקינים.
פתחנו פרוטוקול על מנת להתאימו הסוגיות השונות נתקלו בתוך השדה של מחקר שלנו. כפי שנאמר במאמר הקודם שלנו,הסתכלנו על המעורבות האפשרית של מערכת פרוסטגלנדין ב CAP. בשל חילוף חומרים אנזימטי, חשבנו כי זמן התאוששות 1-HR של הפרוטוקול המקורי לא יתאים הניסוי שלנו. לכן, אנו הארכנו את הזמן לשגות לאחר ניתוח כדי 6 שעות. בעשותה כך, גם היינו צריך לכייל את המינון של LPS על מנת לעמוד בקריטריונים האתיים. בחרנו זמן התאוששות של 6 שעות, עיכוב כי חשבנו מספיק זמן למטרה זו. גם אנחנו טיטרציה LPS מ 15 מ"ג / ק"ג (הפרוטוקול המקורי) עד 0 מ"ג / ק"ג. בשעה 2 מ"ג / ק"ג, ראינו את האפקט האחרון של VNS על ציטוקינים (איור 2), אפקט זה נעלם במינונים נמוכים.
בעוד שההשפעה העיקרית של VNS הטחול ידוע ואופיינה על ידי הפעלת תאי T הזיכרון ואילך, מקרופאגים-התאים המאפשרים הירידה של ציטוקינים-גם אנחנו הראינו כאן כי VNS נראה לגרום לשחרור של מתווכים ישירות ( זה עדיין לא ברור שממנו התאים, necessitating מחקר נוסף) על מנת לגייס סוגי תאים אחרים מן התגובה העיקרית לדלקת. ואכן, בעוד VNS חזק ירד KC / GRO לאחר אינדוקציה דלקתית חזקה (15 מ"ג / ק"ג LPS; כלומר, בפרוטוקול המקורי), הוא מפעיל שחרור מהיר מאוד של KC / GRO בהעדר דלקת. Chemokine KC / GRO, חלבון הקשור IL-8 עם תכונות chemotactic חזקות, הוא ידוע כבעל תפקיד חשוב בהתפתחות לֵיִקוֹצִיט (למשל, נהיגת התבגרות והפעלה), סחר (למשל, משיכה וגיוס של נויטרופילים), וכן לתפקד 15 . למשל, נויטרופילים הם חברים חשובים של מערכת phagocytic של מערכת החיסון המולדת. הם לפעול כקו ההגנה הראשון המארח נגד פתוגנים הפולשים, אבל הם גם מתווכים חשובים של פגיעה הנגרמת דלקת 16. מעניין, בניסיון שלנו כדי לשפר את הפרוטוקול, ואז נתקלנו תצפית זו שמדגישה את direcמעורבות t של סוגי תאים אחרים הטחול בתפקוד העצב התועה.
כל העבודה חלוצית בתחום התמקדה הטחול, איבר היעד של CAP, ובאפקט immunoregulatory של המסלול בתגובת אלח דם או דלקת מערכתית פריפריה. חשוב לציין, עבודה זו נעשתה באמצעות גירוי חריף של העצב התועה, כמו זה המוצג במאמר זה. זה יכול לשמש עבור ניתוח מולקולרי של איברים ספציפיים או של ההשפעות לטווח הקצרות שראו במחקרים פונקציונליים המעורבים במודלים של בעלי חיים כרוניים של דלקת (24 עד 48 מקסימום שעה לאחר הניתוח).
עם זאת, במהלך הנדודים של העצב התועה גם מרמז כי CAP יכול להיות שימוש משמעותי לטיפול במחלות דלקתיות כרוניות הכרוכות האיברים מעוצבבים השונים 13. אחד האיברים-הנחקרים ביותר בהקשר זה הוא הבטן, עם דגש על מחלות מעי דלקתיות (IBD), הכולל קרוהן & # 39; s מחלת קוליטיס כיבית, אלא גם את ileus הנגרמת לאחר הניתוח 17. יתר על כן, את החשיבות של רגולצית CAP בהרבה מחלות דלקתיות אחרות הקשורות בכבד, בכליות, וסרטן הריאות היא גם תחת חקירת 18. אף על פי כן, הפרוטוקול הנוכחי לא יכול לשמש בהקשר זה, כמו האפקט ארוך הטווח של הפעלת עצב תועה ידרוש גירויים חוזרים שיכול כמובן רק להיעשות באמצעות אלקטרודה in vivo מושתלת. לשם כך, החיה צריכה לעבור ניתוח שבו אלקטרודות שרוול ממגרים ממוקמים סביב העצב התועה 20. כמו כן, חשוב לציין כי הטכניקה זו האחרונה היא הרבה יותר קרובות מתוארת בבני אדם או בבעלי חיים בגודל גדול יותר. דרך נוספת של גירוי עצב הואגוס היא מכאנית, כמו פולשני גירוי מלעורית של עצב התועה הראה השפעה אימונוסופרסיבי במודל בעכברים של endotoxemiaנ"צ "> 21. עם זאת, החששות העיקריים של הטכניקה הזו תהיה השחזור של התוצאות וכיצד להבטיח כי עצב התועה מגורה באותו אופן הערכה ארוך טווח של מודלים בבעלי החיים. ההתקנים פותחו עבור בני אדם , כגון גירוי VNS טרנס-אזני או גירוי VNS טרנס-צוואר הרחם, המספקים פולסים חשמליים, אשר נסבל היטב על ידי הנבדקים 21. הם שימשו בעיקר לטיפול באפילפסיה ומיגרנות ו הראו תוצאות מבטיחות שיכול להוביל מתנועעים בעתיד טיפול אקסוגניים.
לסיכום, במיוחד בגלל עצבוב נרחב של העצב התועה בגוף, לוויסות CAP נלמד מגוון רחב של מחלות דלקתיות בתקווה למצוא מאפיינים מכניסטית מולקולריים מעניין שיכול להוביל מטרות טיפוליות עתידיות אפשריות. כאן, הצגנו שיטה אקוטית כדי לגרות את העצב התועה. זה מאפשר לימוד של CAP ב מוגבלתגובות flammatory בזכות גירוי דלקתי מתון בשילוב עם טווח זמן ארוך יותר בין VNS ואת הניתוח (המאפשר חילוף חומרים אנזימטי להתקיים, למשל).
הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס אפקט גירוי עצב הואגוס, כמו גם הניצול היעיל שלה לטיפול במחלות דלקתיות, הוא בעלת חשיבות רבה, במיוחד מנקודת מבט קליני. ואכן, היתרונות של המתודולוגיה הם רחבים. בשל אופייה של איתות עצבים מהר מאוד, הוא מהיר ויעיל; השפעה משמעותית על רמות ציטוקינים, למשל, מתרחשת תוך פחות מ 1 hr. 4 כן, מכני, לא פולשנית, ועל מלעורית גירוי של עצב יכול לשמש, נותן תקווה טיפולים מתנועעים בעתיד מנוהל בקלות. לבסוף, בניגוד לטיפול רגיל, גירוי עצב הואגוס משתמש מסלול אנדוגניים. לכן, בניגוד לכל הטיפול התרופתי, ללא סוכנים חדשים מוצגים בלגוף, לצד תופעות הימנעות מכל פוטנציאל ובכך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Toshiba | - | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1,000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23 G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Stimulating electrode device | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis shaver | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden |
References
- Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
- Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
- Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
- Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
- Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
- Pavlov, V. A., Tracey, K. J.
- Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
- Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
- Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
- Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
- Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
- Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
- Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. Psychoneuroimmunology. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).
- Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
- Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
- Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
- Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
- Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
- Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
- Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).
