Introduction
A imunidade inata fornece uma primeira linha imediato de defesa contra infecções e doenças em uma ampla gama de organismos. Não só inicia a resposta imunitária primária para eliminar a ameaça, mas que também desempenha um papel central na activação e educar a imunidade adaptativa, que leva a cabo as respostas imunitárias secundárias em uma maneira específica para o agente patogénico. A inflamação é orquestrado por uma variedade de citocinas e quimiocinas, que por sua vez tem a capacidade para atrair outras culas imunitias para o local da infecção e para induzir os sinais cardinais da inflamação, tais como vermelhidão, inchaço, dor, perda de função e febre . A duração e a intensidade da inflamação depender de vários factores, mas resolver a inflamação e restaurar a homeostase é um passo crítico para evitar o aparecimento de doenças inflamatórias crónicas. Os avanços recentes no campo da neurociência e imunologia ter desvendado mecanismos neurais específicos com imenso potencial terapêutico para controlar inflamação tanto no sistema nervoso central e na periferia. Um destes mecanismos é a via colinérgica anti-inflamatória (PAC), também conhecido como o reflexo inflamatória, que é conduzido pelo sistema nervoso autónomo 4, 5.
está atualmente acredita-se que mediadores inflamatórios ativar nervos sensoriais e enviar sinais sobre o estado de inflamação no sistema nervoso central. Uma resposta reflexa é então activada através do nervo vago eferente. Um extenso estudo sobre os detalhes anatômicos da PAC revelou um modelo parassimpático-simpático composto por dois nervos, o nervo vago e nervo do baço, respectivamente 6. No PAC, o nervo vago eferente colinérgica activado termina no gânglio celíaco-mesentérica, resultando na activação do nervo esplénica adrenérgicos por um mecanismo ainda a ser exploradas. O nervo esplénica, assim activado, é conhecido por internovate em estreita proximidade com as células imunitárias na polpa branca, da zona marginal, e polpa vermelha do baço, o órgão principal e obrigatório da tampa 7, 8. Norepinefrina (NE) a partir das terminações nervosas esplénicas liga-se aos receptores adrenérgicos β 2 correspondentes expressas em linfócitos T esplénicos. Isto induz a libertação de colina-acetil-transferase (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que por sua vez activa os receptores nicotínicos de acetilcolina (a7 α7nACh) em macrófagos, limitando assim a produção de citoquinas e inflamação 2. Consequentemente, é agora claro que o sistema nervoso é capaz de regular a inflamação em tecidos periféricos e para restaurar a homeostase imune local.
Tal como o nome sugere da via, o sistema de ACh é de importância fundamental para o funcionamento desta via de regulação neuro-imunitário. Curiosamente, os mecanismos envolvidos na activação dePAC parecem ser diferentes na periferia e no sistema nervoso central. Embora a importância dos receptores nicotínicos (α7nAChR) no baço foi demonstrado anteriormente 9, os receptores muscarínicos (mAChR) são obrigatórios para a activação central da via 10, 11. Mais recentemente, a administração periférica de um agonista muscarico M1 de acção central significativamente suprimidos de soro e de tumor baço α factor de necrose (TNF) durante a endotoxemia letal de murino, uma acção que necessário nervo vago intacta e nervo esplénica de sinalização 12. Também demonstramos recentemente que os ratinhos que carecem de prostaglandina E 2 (PGE 2) não foram capazes de responder à estimulação do nervo vago e não regular negativamente a libertação induzida por LPS de citocinas no soro e no baço 3. Portanto, o PAC também pode ser regulada por outros que o principal Camin ACh sistemasay.
O nervo vago foi nomeado como tal por causa de seu curso errante no corpo, que inervam principais órgãos, incluindo o fígado, pulmão, baço, rins, intestino e 13. Considerando esta grande inervação e o efeito imunossupressor muito potente do nervo vago, o potencial terapêutico da PAC podem abranger uma vasta gama de condições inflamatórias. O nervo vago pode ser electricamente (ou mecanicamente) activado, com controlo sobre a tensão e a frequência, e contrariamente ao tratamento convencional, com nenhuma droga adicionada ao corpo. Estão actualmente em curso ensaios em pacientes reumáticos, por exemplo, para testar a importância clínica da VNS no tratamento da inflamação crónica 14. No total, a comunicação e regulação da inflamação neuro-imunitário estão actualmente sob investigação, a qual irá fornecer um tratamento alternativo possível para a terapia convencional. Portanto, a análise do nervo vago estimulaçãoefeito n nos diferentes órgãos inervados, mas também a caracterização do potencial de ação terapêutica em modelos animais de inflamação crônica, com certeza gostaria de dar perspectivas e esperança para novos potenciais alvos terapêuticos.
A metodologia original desenvolvido por Tracey e colegas 4 não poderia ser transposto para o nosso campo de pesquisa devido a superestimulação da resposta inflamatória (por uma dose letal de LPS) e um intervalo de tempo muito curto entre a activação PAC ea-out ler. No presente estudo, iremos apresentar as alterações feitas no protocolo original, comparar as duas metodologias diferentes sobre os níveis de citocinas, e realçar uma nova observação e oposta sobre o órgão alvo (do baço).
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes para o cuidado e uso de animais aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Karolinska, de Estocolmo. O comitê de ética local segue as directivas da União Europeia sobre cuidados com animais.
NOTA: As principais alterações do protocolo original são o tempo de recuperação após a cirurgia (6 h versus 1 hr) e o nível de LPS injectada (2 mg / kg versus 15 mg / kg). Caso contrário, as diferentes definições relacionadas com a cirurgia em si não foram alteradas.
1. Preparar material para a estimulação
- Ligue o computador e o sistema de aquisição de dados ligado ao eléctrodo de estimulação (figura 1A).
- Entre no programa de reconhecer.
- Prepara-se uma solução de reserva de LPS numa concentração de 5 mg / ml em 1x PBS, aliquota-lo, e armazená-lo a -20 ° C. No dia do experimento, descongelar uma alíquota e preparar um adequada amostra de LPS (0,5 mg / ml), a fim de injectar cerca de 100 ul no animal, de acordo com o peso.
2. Preparar o animal para a anestesia
- Use ratinhos C57BL / 6. Mantê-los sob condições de temperatura controlada com uma luz de 12 h ciclo / escuro, alimentá-los comida normal para roedores, e dar-lhes água ad libitum.
- Realizar a cirurgia em ratos que pesam cerca de 25 g no dia da experiência.
Nota: Quando são induzidas reacções inflamatórias, que é particularmente importante para realizar exames regulares e observações das reacções clínicas nos animais. Eutanásia prematura por inalação de CO2 é necessário se a condição animal não preenche os critérios éticos. - Configurar o aparelho anestésico.
- Certifique-se de que a tubulação está devidamente conectado e não está danificado de alguma forma. Certifique-se de que a área ventilada está funcionando corretamente. Conecte o filtro chave para a garrafa isoflurano e preencher a vaporizer com uma quantidade suficiente de isoflurano.
- Abra o suprimento de gás (ar e oxigênio) e certifique-se que as garrafas contêm gás suficiente para o experimento. Uma ligação de três vias é então capaz de enviar o fluxo de isoflurano para a câmara de indução ou a máscara.
- Ligue o conector de tr vias para a câmara de indução. Escolher um rato a partir da gaiola de alojamento e inserir o animal para dentro da câmara. Ajustar o regulador de fluxo de 1,0 L / min de oxigénio e 1,0 L / min de ar. Ajustar a concentração de isoflurano a 4 - 5%.
- Quando o nível desejado de anestesia é atingido, quando o nível desejado de anestesia é atingido, raspar a área cirúrgica e mover o animal a partir da câmara para a máscara. Ligue o conector de tr vias para o fluxo de máscara. Ajustar o regulador de fluxo de 0,25 L / min de oxigénio e de 0,25 L / min de ar.
- Ajustar a concentração de isoflurano para 1,5-2,5%. Verifique o nível de anestesia por controle reflexo e freqüência respiratória antes de iniciar o procedur cirúrgicae.
- Fixar as pernas do mouse para a bancada de trabalho com fita adesiva. Certifique-se de que o nariz do animal ainda é cuidadosamente posicionada na máscara.
3. Cirurgia e estimulação do nervo vago
- Desinfectar a área cirúrgica com 70% de etanol.
- Utilizando um bisturi, com cuidado incisão na pele ao nível do gargalo (incisão de cerca de 1 a 1,5 cm).
Nota: No protocolo, o procedimento de cirurgia termina aqui para animais operados ficticiamente. De fato, tem sido demonstrado que apenas tocando o nervo com uma ferramenta de metal já estimula-lo até certo ponto. Portanto, para obter um animal de controle cirurgia mais precisa quando se utiliza uma pequena quantidade de LPS, pare a cirurgia nesta etapa. - Com a ajuda de um microscópio (objectivo 12,5X), isolar o nervo vago esquerda a partir da artéria carótida utilizando um fórceps de dissecação. Primeiro localizar o esternocleidomastoideu através da remoção da pele e de gordura camadas, e, em seguida, retrai-la emfim de colocar a pinça para trás tanto o nervo ea artéria.
Nota: O passo seguinte é muito complicado, como o nervo e artéria estão intimamente a aderir uns aos outros. Portanto, é muito fácil de cortar o navio e matar o animal. No entanto, colocando a pinça muito cuidadosamente entre o nervo e artéria, que, eventualmente, separar, e é possível isolar o nervo. - Colocar o eléctrodo (Figura 1B), sob o nervo vago. O elctrodo de agulha é bastante longo, por isso, mesmo se o nervo move-se ligeiramente durante a estimulação, que estará sempre em contacto com o eléctrodo.
- Realizar uma injecção intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) com a ajuda de uma seringa (para a leitura e para fora sobre os níveis de citocinas, ou seja, para medir o efeito de regulação para baixo).
- Esperar 5 min antes do início da estimulação.
- Estimular o nervo vago durante 5 min a 5 V e 1 Hz, empurrando o botão de arranque no programa Reconhecer.
- Rémova o eletrodo e suturar o ferimento do animal com fio de sutura cirúrgica.
- Spray de um Sem Sting Barreira Film (NSBF) sobre a ferida, a fim de melhorar a cicatrização e para proteger contra infecções.
4. Recuperação do animal
- Após a cirurgia, mover o animal de volta para sua gaiola para despertar e de recuperação. Sob a luz infra-vermelha, a fim de manter a temperatura corporal, certifique-se de monitorar o animal até a plena consciência foi recuperada.
- Deixe o animal recuperar em sua gaiola, durante 6 h antes de serem sacrificados para análise.
Nota: O efeito da estimulação do nervo vago é muito rápida e tem também sido mostrado para ser de longa duração (até 48 horas), de modo que o tempo de recuperação pode ser definido pelo experimentador de acordo com as necessidades do estudo.
5. Sacrifício, para posterior análise
- Colocar o animal numa gaiola ligada a um dispositivo de administração de CO 2.
- Defina o dispositivo em um 5ciclo-min de inalao de CO 2.
- Quando a eutanásia é feito, recolher os órgãos de interesse e congelá-los directamente em gelo seco para posterior análise (por exemplo, a medição dos níveis de citocinas em extractos de baço usando um rato de TH1 / TH2 9-Plex ensaio) 3.
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Representative Results
Nível de TNFa e Interleucina-1β (IL-1β) depois de aumentar o espaço de tempo após a cirurgia e a diminuição da dose de LPS
Como mostrado previamente, utilizando o protocolo original, VNS diminuiu os níveis de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg em SHAM contra 39,7 ± 10,8 pg / mg em VNS, p <0,001) e IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg em SHAM contra 191,7 ± 27,2 pg / mg em VNS, p <0,01) no baço após injecção intraperitoneal de LPS (15 mg / kg) (Figura 2A). Depois de mudar o tempo de análise de 1 a 6 horas e a diminuição da dose de LPS 15-2 mg / kg, observou-se apenas um efeito de VNS em TNFa (13,67 ± 1,81 pg / mg em SHAM contra 8,82 ± 1,20 pg / mg em VNS, p <0,05), enquanto a IL-1β não foi afectada (368,62 ± 35,65 pg / mg em SHAM contra 304,99 ± 43,54 pg / mg) (Figura 2B). Sem qualquer inj LPSexão (isto é, solução salina), não houve diferença podia ser detectado depois de VNS (Figura 2C).
Níveis de queratinócitos Quimioatraente humano / Crescimento-regulada Oncogen (KC / GRO) no baço após VNS Usando as diferentes condições
Com o protocolo original, que mostrou que a KC / GRO foi fortemente regulada negativamente por VNS (597,4 ± 17,8 pg / mg em SHAM contra 416,4 ± 29,7 pg / mg em VNS, p <0,001) (Figura 3A). Utilizando um ponto de tempo de 6 horas e 2 mg / kg de LPS, não foi observada nenhuma alteração entre SHAM e animais VNS (Figura 3B), enquanto VNS é ainda potente sobre TNFa, por exemplo. No entanto, quando nenhum LPS foi injectada para o ponto de tempo de 6 horas, observou-se um forte aumento da regulação de KC / GRO seguinte VNS (59,37 ± 4,29 pg / mg em SHAM contra 141,22 ± 10,56 pg / mg em VNS, p <0,001 ) (Figura 3C). Como esperado, a maior parte dooutras citocinas (TNF, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, e IFN?) estavam em níveis muito baixos (se detectáveis), e não houve diferença pode ser observada entre SHAM e animais VNS estimulada.
Figura 1: Fotos do material necessário para realizar a estimulação do nervo vago. A) i) do computador, ii) sistema de aquisição de dados, e iii) dispositivo eléctrodo estimulante. B) Primeiro plano do eléctrodo que está colocado sob o nervo vago. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os níveis de TNFa e IL-1β em Baço Extracts de SHAM e animais tratados com ENV. Os animais são submetidos a SHAM ou cirurgia VNS, de acordo com as seguintes condições: a) recuperação de 1 h após a injecção ip de 15 mg / kg LPS, B) de recuperação de 6 horas após a injecção ip de 2 mg / kg de LPS, e C) recuperação 6-h sem injecção de LPS. Os níveis são medidos em uma placa pró-inflamatória revestidos por citocina e expressos como pg / mg de tecido. Os dados são expressos como a média ± SEM. Um asterisco indica diferenças estatisticamente significativas entre VNS e ratos sham (n = 8 em cada grupo). Teste t * p aluno <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os níveis de KC / GRO em SPLeen Extractos de SHAM e VNS-tratados ratinhos ncios. Os animais são submetidos a SHAM ou cirurgia VNS, de acordo com as seguintes condições: a) recuperação de 1 h após a injecção ip de 15 mg / kg LPS, B) de recuperação de 6 horas após a injecção ip de 2 mg / kg de LPS, e C) recuperação 6-h sem injecção de LPS. Os níveis são medidos em uma placa pró-inflamatória revestidos por citocina e expressos como pg / mg de tecido. Os dados são expressos como a média ± SEM. Um asterisco indica diferenças estatisticamente significativas entre VNS e ratos sham (n = 8 em cada grupo). T de Student -teste *** p <0,001.
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Discussion
Desde a sua descoberta no início de 2000, os mecanismos da PAC, foram exaustivamente estudados. Temos agora uma boa imagem da via, e em particular, o órgão-alvo, o baço, onde NE, as células T de memória, Ach, e macrófagos trabalho em equipa muito eficiente para regular negativamente a mediadores inflamatórios 2. Temos também recentemente publicada dados sobre a importância de um sistema funcional de prostaglandinas em ratinhos, em particular, de PGE 2, que é, obviamente, um componente obrigatório para a libertação de ACh no baço após a activação da PAC 3.
A técnica experimental, conhecido como estimulação do nervo vago, pode facilmente ser realizado num laboratório, mas alguns protocolos importantes devem ser observadas em relação aos animais e o procedimento de cirurgia. Nós usamos um sinal de estimulação de onda senoidal, que é suposto ser um estímulo "cobrar equilibrada", a fim de evitar a acumulação de cargas elétricas nado nervo que pode destruí-lo (como oposição a estimulação monofásico). Durante a estimulação do nervo, não é possível separar a aferente do sinal eferentes, que só pode ser feito para outros fins com experiências vagotomia. A duração e a frequência utilizada para a experiência são conhecidos por terem um efeito sobre a libertação de citoquina após o desafio inflamatório, por exemplo, mas não afecta a frequência cardíaca ou dar efeitos colaterais evidentes em controlos saudáveis.
Primeiro de tudo, o experimentador deve sempre ter em mente que o tratamento, cirurgia e recuperação dos animais deve ser feito de acordo com as regras éticas para cuidados com os animais. O outro ponto é que a prática da cirurgia é de grande importância. Isolando o nervo vago é um passo difícil, o que pode ser letal para o animal se dano vascular ocorre. Com a experiência, a cirurgia pode ser feito dentro de 15 - 20 min, o que significa que o animal não tem que ser anestesiado por um longo período de tempo, o queajuda na recuperação.
A discussão também pode ser levantada em relação à escolha de um bom sham-operado animal. No nosso protocolo, foram utilizados animais que apenas foram submetidos a cirurgia ao nível do gargalo, sem colocar o eléctrodo sob o nervo vago. A razão para a escolha desta opção era que apenas o eléctrodo colocando sob o nervo seria mecanicamente estimular o nervo em certa medida (como tem sido observado anteriormente) 19, criando o risco de mascarar potenciais mecanismos que ocorrem em níveis muito baixos de inflamação. Se usando doses muito elevadas de LPS, o melhor controlo sujeitos a operação simulada seria provavelmente para colocar o eléctrodo sob o nervo, como o efeito da cirurgia simulada não iria interferir ou mascarar o efeito de estimulação eléctrica óbvio sobre a libertação de citoquinas.
Nós desenvolvemos o protocolo atual para atender os diferentes problemas encontrados dentro do nosso campo de pesquisa. Como discutido em nosso artigo anterior,olhamos para o possível envolvimento do sistema prostaglandina na PAC. Devido ao metabolismo enzimático, pensamos que o tempo de recuperação 1-hr do protocolo original não iria servir nosso experimento. Portanto, nós estendemos o lapso de tempo após a cirurgia para 6 horas. Ao fazê-lo, também tivemos para titular para baixo da dose de LPS, a fim de satisfazer os critérios éticos. Nós escolhemos um tempo de recuperação de 6 horas, um atraso que nós pensamos o tempo suficiente para esta finalidade. Nós também titulada os LPS de 15 mg / kg (o protocolo original) para baixo para 0 mg / kg. A 2 mg / kg, se viu o último efeito da VNS em citocinas (Figura 2), um efeito que desapareceu a doses mais baixas.
Enquanto o efeito principal da VNS no baço é conhecido e caracterizado pela activação de células T de memória e depois disso, os macrófagos-células que permitem a diminuição das citoquinas-se também mostrou aqui que VNS parece induzir directamente a libertação de mediadores ( ainda não está claro a partir do qual as células, necessitating estudo adicional), a fim de recrutar outros tipos de células da resposta primária à inflamação. Com efeito, enquanto VNS diminuiu fortemente KC / GRO após uma forte indução inflamatória (15 mg / kg de LPS; isto é, o protocolo original), que activa uma libertação muito rápida de KC / GRO na ausência de inflamação. A quimiocina KC / GRO, uma proteína relacionada com a IL-8 com fortes propriedades quimiotáticas, é conhecida por ter um papel importante no desenvolvimento de leucócitos (por exemplo, dirigindo a maturação e activação de), o tráfico (por exemplo, atracção e recrutamento de neutrófilos), e funcionar 15 . Por exemplo, os neutrófilos são membros importantes do sistema fagocíticas do sistema imune inato. Eles agem como a primeira linha de defesa do hospedeiro contra patogénios invasores, mas também são importantes mediadores de lesão induzida por inflamação 16. Curiosamente, em nossa tentativa de melhorar o protocolo, em seguida, me deparei com esta observação que destaca a direct envolvimento de outros tipos de células do baço em funcionamento do nervo vago.
Todo o trabalho pioneiro no campo centrou-se no baço, o órgão alvo da PAC, e sobre o efeito imunorregulador da via em resposta a sépsia ou inflamação sistémica periférica. Importante, este trabalho foi feito utilizando estimulação aguda do nervo vago, tal como a apresentada no presente documento. Isto pode ser utilizado para a análise molecular de órgãos específicos ou dos efeitos de curto prazo observados em estudos funcionais envolvendo modelos animais de inflamação crónica (máximo de 24 a 48 horas após a cirurgia).
No entanto, o curso errante do nervo vago também implica que a PAC poderia ser de utilidade significativa no tratamento de doenças inflamatórias crônicas que envolvem os diferentes órgãos inervados 13. Um dos órgãos mais estudados neste contexto é o intestino, com um foco na doença inflamatória do intestino (DII), que inclui Crohn & # 39; s doença e colite ulcerosa, mas também o íleo pós-operatório induzido-17. Além disso, a importância da regulação PAC em muitas outras doenças inflamatórias envolvendo o fígado, rim, pulmão e também está sob investigação 18. No entanto, o protocolo actual não poderia ser utilizado neste contexto, como o efeito a longo prazo da activação do nervo vago exigiria estímulos repetitivos que pode, naturalmente, só pode ser feito com um eléctrodo implantado in vivo. Para esta finalidade, o animal deve submeter a uma cirurgia, onde os eléctrodos de estimulação de punho são colocadas em torno do nervo vago 20. Também é importante notar que a última técnica é muito mais freqüentemente descrito em seres humanos ou em animais de um tamanho maior. Outra maneira de estimular o nervo vago é mecânica, como estimulação não-invasivo e percutânea do nervo vago mostrou um efeito imunossupressor em um modelo murino de endotoxemiaref "> 21. No entanto, as principais preocupações desta técnica seria a reprodutibilidade dos resultados e como garantir que o nervo vago é estimulado da mesma maneira em uma avaliação a longo prazo dos modelos animais. Devices foram desenvolvidos para os seres humanos , tal como trans-auricular estimulação VNS ou estimulação VNS trans-cervical, que fornecem impulsos eléctricos, os quais são bem toleradas pelos pacientes 21. Eles têm sido utilizados principalmente para tratar a epilepsia e enxaquecas e têm mostrado resultados promissores que poderiam levar a ambulante futuro e terapia exógena.
Para resumir, especialmente por causa da extensa inervação do nervo vago no corpo, o regulamento PAC é estudado em uma ampla gama de doenças inflamatórias, na esperança de encontrar propriedades mecânicas moleculares interessantes que poderiam levar a potenciais futuros alvos terapêuticos. Aqui, apresentamos um método aguda para estimular o nervo vago. Ele permite que o estudo da PAC em limitado emrespostas inflamatórias, graças a um estímulo inflamatório moderada combinado com um intervalo de tempo mais longo entre a VNS e a análise (permitindo metabolismo enzimático ter lugar, por exemplo).
A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao efeito de estimulação do nervo vago, bem como a sua utilização eficiente no tratamento de doenças inflamatórias, é de grande importância, particularmente a partir de um ponto de vista clínico. De fato, as vantagens da metodologia são amplas. Devido à natureza da sinalização nervo extremamente rápido, é rápido e eficaz; um efeito observável sobre os níveis de citocinas, por exemplo, ocorre em menos de 1 h. 4 Além disso, a estimulação mecânica, não-invasiva, e percutânea do nervo pode ser utilizado, dando esperança para futuras terapias ambulantes e facilmente administrados. Finalmente, ao contrário do tratamento regular, estimulação do nervo vago utiliza uma via endógena. Portanto, ao contrário de todas as terapias de droga, há novos agentes são introduzidos empara o corpo, evitando assim quaisquer efeitos secundários potenciais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Toshiba | - | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1,000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23 G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Stimulating electrode device | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis shaver | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Rodent diet from Lantmannen, Stockholm, Sweden |
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