Abstract
Den kvindelige reproduktive tarmkanalen (FRT) slimhinde immunsystem fungerer som den første linje i forsvaret. Bedre kendskab til genital mucosa er derfor afgørende for forståelsen patogenicitet af forskellige patogener, herunder HIV. Gamma delta (GD) T-celler er prototypen af 'ukonventionelle' T-celler og udgør en relativt lille delmængde af T-celler, der er defineret ved deres ekspression af heterodimere T-cellereceptorer (TCR'er), sammensat af gamma- og delta-kæder. Dette adskiller dem fra de klassiske og meget bedre kendte CD4 + hjælper T-celler og CD8 + cytotoksiske T-celler, der er defineret af alfa-beta TCR'er. GD T-celler viser ofte vævsspecifik lokalisering og er beriget i epitel. GD T-celler dirigerer immunresponser i inflammation, tumor overvågning, infektionssygdomme, og autoimmunitet.
Her præsenteres en metode til reproducerbar isolere og analysere menneskelige endocervikale intraepithelial GD T-lymfocytter. Vi have anvendt endocervikale cytobrush prøver fra kvinder, der deltager i Kvindernes Interagency HIV Infection Study (WIHS). Viden om GD T-celler interaktioner under forhold, hvor der er en fornærmelse mod den vaginale slimhinde kunne anvendes på enhver klinisk undersøgelse, hvor slimhinder sårbarhed er rettet, herunder udvikling af vaginal microbicides.In desuden med viden om slimhinde GD T-celle responser har potentiale for anvendelse af GD T-celle-baseret immunterapi i behandling af infektionssygdomme.
Introduction
Vi udviklede metode under anvendelse endocervikale børste prøver til evaluering intraepiteliale GD T-celler. Den endocervikalkanalen er foret med et enkelt lag af søjleformet epitel. Intraepithelial lymfocytter repræsenterer frontline lymfocytter bosiddende i epitel lag, der hurtigt kan initiere immunreaktioner på at støde patogene mikrober 7, 8. Forståelse af de immunologiske begivenheder endocervikale intraepithelial rum er vigtig for udformningen af effektive strategier til forebyggelse af infektioner, herunder hiv.
Vores metode kan anvendes til frisk indsamlede humane endocervikale prøver samt frosne endocervikale celler til yderligere at udforske den rolle, intraepithelial GD T-celler hos kvinder med HIV-infektion eller med risiko for hiv-smitte. Hovedformålet med denne protokol er at opdage nye immunologiske hændelser i endocervikale intraepithelial rum og at evaluate GD T-celle responser som en markør for slimhinde sårbarhed hos kvinder med HIV-infektion.
De betydelige huller i viden omkring FGT immunitet er delvis på grund af vanskeligheden ved succes indsamling og bearbejdning af slimhinder prøver. Desuden det komplekse heterogenitet slimhinde immunceller, og deres indbyrdes med hinanden, er store udfordringer for at identificere klinisk relevante målinger, der afspejler staten og evne til immunsystemet. Vi udviklede en metode til at opnå højt oprensede intraepithelial GD T-celler, der kan være yderligere analyseret ved hjælp af meget multiplex, encellede teknologier, der kan være afgørende for at identificere de underliggende mekanismer i FRT immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieaktiviteter fandt sted på University of Miami HIV Research Unit i samarbejde med Miami Kvinders HIV Interagency Study (WIHS) og Miami Center for AIDS Research (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) godkendelse blev opnået før til rekruttering og de vurderinger eller studere relaterede procedurer.
1. endocervikale Brush Sample Collection
BEMÆRK: Deltagerne gennemgik en vaginal undersøgelse udført af uddannet MD eller gynækolog og indsamling af intraepithelial lymfocytter blev udført under speculum undersøgelse ved at indsætte cytobrush.
- Deltager karakteristika
- Rekruttere kvinder deltagere, der er i alderen 18 til 45 år, seksuelt aktive, ikke er gravid og ikke på svangerskabsforebyggende medicin eller med en spiral.
- Før vaginal undersøgelse, har deltagerne gennemgå en 10 ml blod uafgjort i grøntop heparin vacutainere for perifert mononukleære blodceller (PBMC) isolation. at tjene som en kontrol for endocervikale intraepithelial analyse 9.
- Indsamling af de endocervikale prøver
- Indsæt en steril speculum af passende størrelse i vagina uden smøring. Brug en varm vand for at lette indføringen af spekulum og steril gaze til at rense slim. Positionen af spekulum muliggør fuldstændig visualisering af OS og ectocervix.
- Indsæt endocervikale børsten i endocervikalkanalen indtil der kun børstehårene tættest på hånden er synlige. Drej børsten med uret for 360 °. Overfør børsten i en 15 ml-rør indeholdende 5 ml IMDM-medium.
- Umiddelbart efter indsamling, placere rør indeholdende cytobrush på is. At opnå en høj levedygtighed af indsamlede intraepitel celler, levere cytobrush til laboratoriet og processen inden for 1 time.
- Vortex rør indeholdende endocervikale cytobrush anvende 4 korte (10 sek) slag.
- Centrifugeres røret indeholdende cytobrush, i 10 minutter ved 250 x g.
- Fjern forsigtigt cytobrush fra røret (ikke forstyrrer pillen i bunden af røret), og der tilsættes 1 ml IMDM medier og placer røret på is.
- Placer cytobrush på 100 mm cellefilter oven på 50 ml rør.
- Vask cytobrush med 20 ml IMDM.
- Centrifugerør i 10 minutter ved 250 x g.
- Dekanteres og pelleteret celler resuspenderes i 1 ml IMDM og kombinere med den allerede resuspenderes pellet beskrevet i 2.3.
- Tæl cellerne under anvendelse af en automatiseret celletæller 10 eller tælle cellerne under anvendelse hæmocytometer ved at kombinere 10 pi af cellesuspensionen med 10 pi trypanblåt. Forsigtigt pipetteres op og ned ti gange for at blande cellerne og farvestof. Load 10 uLaf blandingen i åbningen af en af de to hæmocytometer kamre. Tæl alle cellerne i de fem netområder. Hold en separat optælling af de levedygtige og ikke-levedygtige celler. Bestem cellelevedygtigheden efter følgende formel:% levedygtige celler = ikke-levedygtige celler x 100 / samlede celle nummer celler.
Bestem efterfølgende koncentration celle pr ml (og det totale antal celler) ved følgende beregninger. Totale celler per ml = totale celler tælles x (fortyndingsfaktor / antal tælles firkant) x 10.000 celler / ml. - Frys isolerede endocervikale celler under anvendelse frysemedium indeholdende 10% DMSO og 90% FBS.
3. flowcytometri
- Resuspender 1-3 x 10 5 endocervikale celler i 100 pi FACS buffer (PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin
- Tilføj en uL / 10 6 LIVE / DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit og antistoffer til overflademarkører ved de koncentrationer, der er beskrevet i tabel 1.
- Inkubér cellerne i 30 minutter ved + 4 ° C, beskyttet mod lys.
- Tilsæt 1 ml FACS buffer, og cellerne og centrifugeglas i 5 minutter ved 350 xg
- Re-suspendere cellepelleten i 300 uL 1% paraformaldehyd.
- Forbered kompensation kontrol ved hjælp perler og antistoffer, der anvendes til farvning ved tilsætning af 100 pi af FACS buffer og en dråbe af perlerne og den samme koncentration af antistofferne anvendes til prøve farvning.
- Erhverve farvede perler og prøver på et flowcytometer, der er udstyret med 405 nm, 488 nm og 635 nm lasere.
4. endocervikale Gamma delta T Cell Isolation
- Magnetisk perle isolation
- Re-suspendere endocervikale cellepellet (≤ 10 7 totale celler), der er beskrevet i 2.6, i 40 pi buffer inkluderet i TCR gamma delta microbead kit refereres i tabellen i Materialer og reagenser.
- Følg instruktionerne for totrins farvningsprotokollen kit: første, with anti-TCR gamma delta hapten-antistof og det andet med anti-hapten-mikroperler-FITC
- Efter inkubation på 15 minutter ved 4-8 ° C, vaskes cellerne ved tilsætning af 1 ml puffer og centrifugeres ved 300 xg i 10 min. Dekanteres supernatanten ved at vende røret, og tryk tør ved hjælp af et stykke papir.
- Resuspender cellepelleten i 500 pi billede buffer og forberede den magnetiske kolonne ved at placere det i en passende magnetisk separator ifølge leverandørens protokol.
- Påfør cellesuspensionen på søjlen og indsamle umærkede celler, som passerer gennem og vask kolonne 3x med passende mængde puffer (500 pi). Udfør vasketrin ved tilsætning buffer tre gange, hver gang når kolonnen reservoir er tom. Saml totale udløb. Dette er den umærkede, negative cellefraktion
- Fjern kolonnen danner magnetiske separator og pipette 1 ml buffer på søjlen og straks skylle ud fraktion med den magnetisk etiketed celler ved kraftigt at anvende stemplet følger med kolonnen.
BEMÆRK: Isoleret gamma delta T-celle er allerede fluorescens farvet for flow-cytometrisk analyse, da magnetisk mærket anti-hapten mikrokugler konjugeres med fluorescerende farvestof FITC.
- cellesortering
- For celle sortering, label endocervikale celler med levedygtighed dø og antistof panel som beskrevet i afsnit 3.
- Opsæt elektroniske porte på live, CD45 + CD3 + og gamma delta positive celler og udfører celle sortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For nylig har vi analyseret endocervikale intraepithelial GD T-celler, og vi var de første til at rapportere om tab af endocervikale gamma delta T-celler i HIV-smittede kvinder 9, 11. Her beskriver vi protokollen til at isolere og analysere delmængde af endocervikale gamma delta T-celler. Som vist i figur 1, kan GD T-celler let detekteres i de humane endocervikale celleprøver.
En unik population af endocervikale gamma delta V1 (GD1) T-celler blev beskrevet under anvendelse multiparametar flowcytometri-baserede immunfænotypebestemmelse (figur 1). En repræsentativ gating strategi for HIV-inficeret endocervikale prøve er vist i figur 1. Analyse blev udført på de totale endocervikale celler ved at indstille elektronisk port på Forward / Side scatter (figur 1A) efterfulgt af than udelukkelse af celle dubletter (figur 1b). Levedygtige celler blev defineret af udelukkelse af døde celler ved hjælp LIVE / DEAD Fixable Gul Amine Dead Cell Stain (figur 1C). Analyse af CD45-ekspression blev udført på levende gated celler (figur 1D), efterfulgt af analyse af CD3 ekspression (figur 1E). Gamma delta 1 (GD1) eller gamma-delta 2 (GD2) positive celler blev defineret som en subpopulation af CD3 + celler, som udtrykker GD TCR (TCR gamma delta V1 eller TCR gamma delta V2). Endvidere blev det bekræftet, at kun CD3 + T-celler udtrykker TCR gamma delta siden gated CD3 - gør T-celler ikke udtrykker TCR gamma delta V1 eller delta V2. Fænotypisk analyse af gated CD3 + GD1 + celler afsløret (figur 1G), at størstedelen af GD1 celler ~ (74%) er CD4 - CD8 -.
I den foreliggende undersøgelse, muligheden for at udnytte endocervical børste prøver til oprensede intraepithelial GD T-celler ved positiv magnetisk selektion blev påvist (figur 2).
Figur 1: Gamma delta (GD) T-celle subpopulation i endocervikale mucosa analyseret ved flowcytometri. Efter gating strategi blev anvendt til identificerede endocervikale T-cellepopulationer: (A) endocervikale cytobrush celler blev gated ifølge størrelse og granularitet (FSC, fremad sidespredning vs SSC, sidespredning). (B) Cell dubletter blev udelukket ved at sætte de elektroniske porte i FSC-A (område) vs SSC-W (bredde). (C) Levende celler gated på levedygtigheden dye-negative population. (D) Elektronisk gate blev sat på levende, CD45 positive celler. (E) Elektronisk gate for CD45 positive celler blev indstillet på CD3 positive celler(F) TCRVD1 (GD1) og TCRVD2 (GD2) udtryk blev analyseret på CD3 + celler. (G) CD4 og CD8-ekspression blev analyseret på GD1 + -celler. (H) TCRVD1 og TCRVD2 udtryk blev analyseret på gated CD3 negative celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Isolering af endocervikale gamma delta T-celler (GD) ved positiv magnetisk separation. Hyppigheden af endocervikale GD T-celler blev bekræftet før og efter positiv magnetisk separation. Endocervikale celler blev først mærket med anti-TCR gamma delta-antistof og derefter med fluorescens farvet med anti-hapten mikroperler-FITC. Procent af TCR GD + T-celler blev rapporteret før og efter magnetisk separation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurdering af kvindelig nedre kønsorganer slimhinde sårbarhed er en vigtig del af kliniske undersøgelser vedrørende risikoen for hiv erhvervelse og transmission. Typisk FGT sårbarhed over for hiv-smitte vurderes ved at måle opløselige immunmodulatorer i genitale sekreter (cytokiner, kemokiner og antimikrobielle peptider) 12, 13. Men disse biomarkører er kun vejledende for vaginal betændelse, påvirkes af fysiologiske og patologiske begivenheder, og ikke altid repræsenterer direkte slimhinde skader. For at forbedre vores forståelse af, hvordan slimhinde faktorer øger risikoen for at erhverve og overføre HIV, cellulære markører for slimhinde skader skal udvikles. GD intraepithelial T-celler er til stede i FGT, indskyde mellem epitelceller, og menes at bidrage til homeostase samt til en første linje i forsvaret mod miljømæssige udfordringer. GD-T-celler har poten tentielle at udgøre en yderligere biomarkør at vurdere slimhinde sårbarhed i FGT.
I denne protokol, er det vist, hvordan man forbereder intraepithelial lymfocytter fra humant endocervikale cytobrush prøve og er let mestrer. Det mest kritiske punkt i denne proces er at opretholde cellelevedygtighed ved hurtig behandling af prøven, samt ved at holde cellerne på is under hele proceduren. Celleindholdet afhænge cytobrush indsamling teknik, håndtering færdighed samt det infektiøse status (HIV-infektion eller andre virale infektioner, bakterielle eller svampeinfektioner). Vores gruppe og andre har publiceret forskellige undersøgelser, der beskriver forskellige lymfocytpopulationer i human kønsorganer 9, 14, 15. I vores hænder, kan man endocervikale cytobrush prøve giver 0,5-5 x 10 6 celler med 80-90% levedygtighed. I sammenligning med den almindeligt anvendte isolation metodeclass = "xref"> 14, 15, af vores fremgangsmåde levedygtighed og celleudbytte forøges.
Denne metode giver en kraftfuld og et effektivt værktøj til at studere endocervikale intraepithelial gamma delta T-lymfocytter og kunne give indsigt i andre immunceller, der migrerer til dette rum under infektion og / eller inflammation. In vivo cellulære sammensætning slimhindevæv er ofte vanskeligt at undersøge i en omfattende og kvantitativ måde. Teknikker, såsom immunhistokemi og flowcytometri er begrænset af tilgængeligheden af antigenspecifikke monoklonale antistoffer og af det lille antal af parallelle målinger, der kan udføres på hver individuel celle. Traditionelle high-throughput analyser, såsom gen-ekspression arrays, når den udføres på hele væv, give oplysninger om gennemsnitligt genekspression niveau, og kan kun indirekte korreleret kvantitative ændringer i cellulære subpopulationer.Disse begrænsninger bliver særdeles vanskeligt at overvinde, når man studerer minoritetsgrupper, eller cellen befolkningen, der mangler eksklusive markører. Ved at kombinere "fluorescensaktiveret cellesortering" (FACS) og "single-celle PCR-gen-ekspression analyse" kan man udføre en high-throughput transkriptionel analyse af de intraepiteliale GD T-celler i endocervix. Denne metode udnytter kapaciteten af moderne flowcytometre at sortere individuelle enkeltceller med nøjagtighed og præcision, samt anvendelse af mikrofluide teknologier til at præforme høj følsomhed multiplex PCR fra små mængder af mRNA, hvilket tillader parallel analyse af ekspressionen af op til 96 gener for hver enkelt celle 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere ikke har kommerciel eller anden forening, der kan udgøre en interessekonflikt (f.eks farmaceutiske kapitalandele, rådgivning, advisory board medlemskab, relevante patenter, eller forskningsmidler).
Acknowledgments
Vi takker undersøgelsens deltagere Miami WIHS for deres vilje til at deltage i dette arbejde. Data i dette manuskript blev indsamlet af Miami Kvinders Interagency HIV Study (WIHS). Indholdet af denne publikation er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health (NIH). Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme og kvinders Interagency HIV Infection Study (WIHS) [tilskud nummer U01 AI103397], Statens Institut for Allergi og Smitsomme Sygdomme, National Institutes of Health [tilskud nummer P30AI073961], National Center for Fremme translationelle Sciences og National Institute on Minority Health og sundhed uligheder, National Institute of Health [tilskud nummer UL1TR000460 og 1KL2TR000461], og National Institute of Child Health and human Development, National Institute of Health [tilskud nummer K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
