Abstract
Den kvinnelige skjede (FRT) mucosal immunsystemet fungerer som første forsvarslinje. Bedre kunnskap om genital slimhinne er derfor viktig for å forstå patogenitet av ulike patogener inkludert HIV. Gamma Delta (GD) T-celler er prototypen på 'ukonvensjonelle' T-celler og representerer en relativt liten del av T-celler som er definert av deres uttrykk for heterodimere T-celle reseptorer (TCR) består av gamma og delta kjeder. Dette skiller dem fra de klassiske og mye bedre kjent CD4 + T-hjelpeceller og CD8 + cytotoksiske T-celler som er definert av alfa-beta TCR. GD-T-celler viser ofte vev-spesifikk lokalisering og anrikes i epitel. GD T-celler orkestrere immunresponser i betennelse, svulst overvåking, smittsomme sykdommer, og autoimmunitet.
Her presenterer vi en metode for å reproduserbart isolere og analysere menneskelige endocervikale intraepitelial GD T-lymfocytter. Vi hahar brukt endocervikale cytobrush prøver fra kvinner som deltar i kvinnenes Interagency HIV infeksjon Study (WIHS). Kunnskap om GD T-celler interaksjoner under forhold der det er en fornærmelse mot vaginal slimhinnene kan brukes til klinisk studie hvor mucosal sårbarhet er adressert, herunder utvikling av vaginal microbicides.In tillegg har kunnskap om slimhinnene GD T-celle responser potensialet for anvendelse av GD T-celle-basert immunterapi ved behandling av infeksjonssykdommer.
Introduction
Vi har utviklet metodikk for å bruke endocervikale penselprøver for å vurdere intraepitelial GD T-celler. Den endocervikale kanalen er omgitt av et enkelt lag av søyle epitel. Intraepitelial lymfocytter representerer front lymfocytter bosatt i epiteliale lag som raskt kan initiere immunresponser ved å støte patogene mikrober 7, 8. Forstå immunologiske hendelsene i endocervikale intraepitelial rommet er viktig for utformingen av effektive strategier for å forebygge infeksjoner, inkludert HIV.
Vår metode kan brukes for fersk innsamlede humane endocervikale prøver samt frosne endocervikale celler for å ytterligere undersøke hvilken rolle intraepitelial GD T-celler hos kvinner med HIV-infeksjon eller med risiko for HIV-smitte. Hovedmålet med denne protokollen er å oppdage nye immunologiske hendelser i endocervikale intraepitelial rommet og til evaluate GD T-celle responser som en markør for slimhinne sårbarhet hos kvinner med HIV-infeksjon.
De betydelige kunnskapshull rundt FGT immunitet er delvis på grunn av vanskeligheter med å lykkes innsamling og behandling av slimhinneprøver. Videre er den komplekse heterogeniteten av mukosale immunceller, og deres sammenhengene med hverandre, er store utfordringer for identifisering av klinisk relevante målinger som reflekterer tilstanden og evnen av immunsystemet. Vi utviklet en metode for å skaffe høy-rene intraepitelial GD T-celler som kan bli ytterligere analysert ved hjelp av svært multipleksede, encellede teknologier som kan være avgjørende for å identifisere de underliggende mekanismene for FRT immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieaktiviteter fant sted ved University of Miami HIV Research Unit i samarbeid med Miami kvinner HIV Interagency Study (WIHS) og Miami Senter for AIDS forskning (CFAR) .Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) godkjenning ble innhentet før til rekruttering og noen vurdering eller studierelaterte prosedyrer.
1. endocervikale Brush Prøvetaking
MERK: Deltakerne gjennomgikk en vaginal undersøkelse utført av utdannet MD eller gynekolog og innsamling av intraepitelial lymfocytter ble utført under spekulum eksamen ved å sette inn cytobrush.
- deltaker karakteristika
- Rekruttere kvinner deltakere som er i alderen 18 til 45 år, seksuelt aktive, ikke gravid og ikke på prevensjon medisiner eller med en intrauterin enhet.
- Før vaginal undersøkelse, har deltakerne gjennomgå en 10 ml blod uavgjort i grønttopp heparin vacutainers for perifert blod mononukleære celle (PBMC) isolasjon. å tjene som en kontroll for endocervikale intraepitelial analyse ni.
- Innsamling av endocervikale prøver
- Sett inn en steril spekulum av passende størrelse inn i skjeden uten smøring. Bruk varmt vann for å lette innsetting av spekulum og sterilt gasbind for å rengjøre slim. Posisjonen til spekulum tillater full visualisering av os og ectocervix.
- Sett endocervikale penselen i endocervikale kanalen til bare busten nærmest hånden er synlige. Roter børsten med urviseren for 360 °. Overfør børsten inn i et 15 ml rør inneholdende 5 ml IMDM-medium.
- Umiddelbart etter samlingen, legg røret som inneholder cytobrush på is. For å oppnå høy levedyktighet av innsamlede intraepitelial celler, levere cytobrush til laboratoriet og prosess innen en time.
- Vortex rør som inneholder endocervikale cytobrush påføre 4 korte (10 sek) slag.
- Sentrifuger røret, som inneholder cytobrush, i 10 minutter ved 250 x g.
- fjerne cytobrush fra røret forsiktig (ikke forstyrrer pellet på bunnen av røret) og tilsett 1 ml IMDM media og plassere røret på is.
- Plasser cytobrush på 100 mm cellefilter på toppen av 50 ml tube.
- Vask cytobrush med 20 ml IMDM.
- Sentrifugerør i 10 min ved 250 x g.
- Dekanter supernatanten og resuspender pelleterte celler i 1 ml IMDM og kombineres med den allerede resuspendert pellet som er beskrevet i 2.3.
- Tell cellene ved hjelp av en automatisk celleteller 10 eller telle celler ved hjelp av hemocytometer ved å kombinere 10 ul av cellesuspensjonen med 10 ul av trypan blått fargestoff. Forsiktig pipettér opp og ned ti ganger for å blande cellene og fargestoff. Load 10 mLav blandingen inn i åpningen av en av de to kamre hemocytometer. Tell alle cellene i de fem nettområder. Hold en egen telling av levedyktige og ikke-levedyktige celler. Bestemme cellenes levedyktighet ved hjelp av følgende formel:% levedyktige celler = Ikke-levedyktige celler x 100 / totalcelletall celler.
Bestem den påfølgende cellekonsentrasjon pr ml (og det totale antall celler) ved hjelp av de følgende beregninger. Totalt celler per ml = totale celler telles x (fortynningsfaktoren / antall telte kvadrat) x 10.000 celler / ml. - Fryse isolerte endocervikale celler ved hjelp av frysemedium inneholdende 10% DMSO og 90% FBS.
3. Flowcytometri
- Re-suspen 1-3 x 10 5 endocervikale celler i 100 ul FACS-buffer (PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin
- Tilsett 1 mL / 10 6 LIVE / DEAD Fixable Yellow død celle Stain kit og antistoffer for overflatemarkører ved konsentrasjoner som er beskrevet i tabell 1.
- Cellene inkuberes i 30 min ved 4 ° C, beskyttet mot lys.
- Tilsett 1 ml FACS-buffer, og cellene og sentrifugerørene i 5 minutter ved 350 xg
- Re-suspendere cellepelleten i 300 mL 1% paraformaldehyde.
- Forbered kompensasjon kontroller ved hjelp av perler og antistoffer som brukes for farging ved tilsetning av 100 ul FACS-buffer og en dråpe av kulene og den samme konsentrasjon av antistoffer som brukes for prøve farging.
- Acquire farget perler og prøver på en flowcytometer, utstyrt med 405 nm, 488 nm og 635 nm lasere.
4. endocervikale Gamma Delta T Cell Isolation
- Magnetiske kuler isolasjon
- Re-suspendere endocervikale celle pellet (eller under 10 7 totalt celler), som er beskrevet i 2.6, i 40 ul buffer inkludert i TCR gamma delta mikro kit referert i tabellform Materialer og reagenser.
- Følg instruksjonene i settet for to-trinns flekker protokoll: først, viddh anti-TCR gamma delta hapten-antistoff og andre, med anti-hapten-FITC mikrokuler
- Etter inkubering i 15 minutter ved 4-8 ° C, vaskes cellene ved å tilsette 1 ml av buffer og sentrifuger ved 300 xg i 10 min. Dekanter supernatanten ved å snu røret, og trykk tørr ved hjelp av et stykke papir.
- Re-suspendere cellepelleten i 500 ul gitt buffer og forberede den magnetiske kolonne ved å plassere den i passende magnetisk separator i henhold til leverandørens protokoll.
- Anvende cellesuspensjon i kolonnen og samler umerkede celler som passerer gjennom og vaske kolonnen med 3 x passende mengde buffer (500 ul). Utføre vasketrinnene ved tilsetning av buffer tre ganger, hver gang en gang kolonnen beholderen er tom. Samle hele strømmen. Dette er den umerkede, negative cellefraksjon
- Fjerne kolonnen danner den magnetiske separator og pipette 1 ml buffer i kolonnen og umiddelbart spyle ut fraksjonen med det magnetisk etiketted celler ved å anvende fast stempelet forsynes med kolonnen.
MERK: Isolert gamma delta T-celle allerede fluorescens-farget for flow-cytometri analyse siden magnetisk merket anti-hapten mikro er konjugert med fluorescerende fargestoff FITC.
- Cell sortering
- For celle sortering, label endocervikale celler med levedyktighet dør og antistoff panel som beskrevet i kapittel 3.
- Sett opp elektroniske porter på live, CD45 + CD3 + og gamma delta positive celler og utføre cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nylig, analyserte vi endocervikale intraepitelial GD T-celler, og vi var de første til å rapportere om tap av endocervikale gamma delta T-celler hos HIV-smittede kvinner 9, 11. Her beskriver vi protokollen for å isolere og analysere undergruppe av endocervikale gamma delta T-celler. Som vist i figur 1, kan GD T-celler lett bli funnet i humane endocervikale celleprøver.
En unik bestand av endocervikale gamma delta V1 (GD1) T-celler ble beskrevet ved hjelp multiparametar flowcytometri-baserte immunfenotyping (figur 1). En representativ gating strategi for HIV-infisert endocervikale prøve er vist i figur 1. Analysen ble utført på de totale endocervikale celler ved å sette den elektroniske gate på forover / Side scatter (figur 1A) etterfulgt av than utelukkelse av celle dubletter (figur 1B). Levedyktige celler ble definert av utelukkelse av døde celler ved hjelp av LIVE / DEAD Fixable Yellow Amine død celle Stain (figur 1C). Analyse av CD45-ekspresjon ble utført på levende gated celler (figur 1D), etterfulgt av analyse av CD3 uttrykket (figur 1E). Gamma Delta 1 (GD1) eller gamma delta 2 (gd2) positive celler ble definert som en undergruppe av CD3 + celler som uttrykker GD TCR (TCR gamma delta V1 eller TCR gamma delta V2). Videre ble det bekreftet at bare CD3 + -T-celler uttrykker TCR gamma delta siden gated CD3 - do T-celler ikke uttrykker TCR gamma delta V1 eller V2 delta. Fenotypisk analyse av gated CD3 + GD1 + celler avslørt (figur 1G), at flertallet av GD1 celler (~ 74%) er CD4 - CD8 -.
I den foreliggende undersøkelse, gjennomførbarheten av å benytte endocervical børste prøvene til rensede intraepitelial GD T-celler ved positiv magnetisk utvalg ble det vist (figur 2).
Figur 1: Gamma Delta (GD) T-celle subpopulasjon i endocervikale slimhinnen analysert av flowcytometri. Etter gating strategien ble brukt til identifiserte endocervikale T-cellepopulasjoner: (A) endocervikale cytobrush celler ble inngjerdet i henhold til størrelse og detaljnivå (FSC, forover side scatter vs SSC, side scatter). (B) Cell dubletter ble ekskludert ved å sette de elektroniske portene i FSC-A (område) vs SSC-W (bredde). (C) Levende celler blir separert på levedyktigheten fargestoff-negativ populasjon. (D) Elektronisk gate ble satt på live, CD45 positive celler. (E) Elektronisk gate for CD45 positive celler ble satt på CD3 positive celler(F) TCRVD1 (GD1) og TCRVD2 (GD2) ekspresjon ble analysert på CD3 + -celler. (G) CD4 og CD8 ekspresjon ble analysert på GD1 + -celler. (H) TCRVD1 og TCRVD2 uttrykk ble analysert på gated CD3 negative celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Isolering av endocervikale gamma-delta-T-celler (GD) ved positiv magnetisk separasjon. Frekvens av endocervikale GD T-celler ble bekreftet før og etter positiv magnetisk separasjon. Endocervikale celler ble først merket med anti-TCR gamma delta-antistoff og deretter med fluorescensmerket farget med anti-hapten-mikroperler FITC. Prosent av TCR GD + T-celler ble rapportert før og etter magnetic separasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vurdering av kvinnelig lavere kjønnsorgan mucosal sårbarhet er en viktig del av kliniske studier som omhandler risiko for HIV oppkjøp og overføring. Vanligvis FGT sårbarhet for HIV-infeksjon blir evaluert ved å måle løselig immunmodulatorer i genital sekreter (cytokiner, kjemokiner og antimikrobielle peptider) 12, 13. Men disse biomarkører er bare en indikasjon på vaginal betennelse, påvirkes av fysiologiske og patologiske hendelser, og ikke alltid representerer direkte slimhinneskader. For å forbedre vår forståelse av hvordan slimhinne faktorer øker risikoen for å anskaffe og overføring av hiv, cellulære markører for slimhinneskader må utvikles. GD intraepitelial T-celler er til stede i FGT, intercalate mellom epitelceller, og er tenkt å bidra til homeostase samt til en første forsvarslinje mot miljøutfordringer. GD T-celler har po Tial å utgjøre en ekstra biomarkør for å vurdere slimhinnene sårbarhet i FGT.
I denne protokollen, er det vist hvordan å forberede intraepitelial lymfocytter fra humant endocervikale cytobrush prøven og lett mestret. Den mest kritiske punkt i denne prosessen er å opprettholde cellenes levedyktighet ved hurtig behandling av prøven, samt ved å holde cellene på is under hele prosedyren. Cellen Utbyttet vil avhenge av cytobrush samling teknikk, håndtering dyktighet samt infeksjonsstatus (HIV eller andre virale infeksjoner, bakterielle eller soppinfeksjoner). Vår gruppe og andre har publisert en rekke studier som beskriver ulike lymfocyttpopulasjoner i menneskets kjønnsorganer 9, 14, 15. I våre hender, kan en endocervikal cytobrush prøve gi 0,5-5 x 10 6 celler med 80-90% levedyktighet. I sammenligning med den vanlige brukte isolasjonsmetodenclass = "xref"> 14, 15, ved vår metode levedyktighet og celle utbyttet økes.
Denne metoden gir en kraftfull og et effektivt verktøy for å studere endocervikale intraepitelial gamma delta T-lymfocyttene, og kan gi innsikt i andre immunceller som migrerer til dette kammer i løpet av infeksjon og / eller betennelse. In vivo cellulære sammensetning av slimhinnevev er ofte vanskelig å undersøke i et omfattende og kvantitativ måte. Teknikker som immunhistokjemi og flowcytometri er begrenset av tilgjengeligheten av antigen spesifikke monoklonale antistoffer og ved det lille antall parallelle målinger som kan utføres på hver enkelt celle. Tradisjonelle high-throughput-analyser, slik som gene expression-matriser, når den utføres på hele vev, gir informasjon om gjennomsnitt genekspresjon nivå, og kan bare indirekte korrelert til kvantitative endringer i cellulære underpopulasjoner.Disse begrensningene blir særlig vanskelig å overvinne når studere minoritetsbefolkninger, eller cellepopulasjon som mangler eksklusive markører. Ved å kombinere "fluorescens-aktivert cellesortering" (FACS) og "single-celle PCR-gen-ekspresjon analyse" man kan utføre en high-throughput transkripsjonell analyse av de intraepitelial GD T-cellene i endocervix. Denne fremgangsmåten utnytter kapasiteten av moderne flowcytometere å sortere individuelle enkeltceller med nøyaktighet og presisjon, sammen med bruk av microfluidic teknologier for å preform høy følsomhet multipleksede PCR fra små mengder av mRNA, for derved å tillate parallell analyse av ekspresjonen av opp til 96 gener for hver enkelt celle 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ikke kommersielt eller annen forening som kan utgjøre en interessekonflikt (f.eks farmasøytiske lager eierskap, rådgivning, advisory board medlemskap, relevante patenter, eller forskningsmidler).
Acknowledgments
Vi takker Miami WIHS deltagerne for deres vilje til å delta i dette arbeidet. Dataene i dette manuskriptet ble samlet av Miami kvinner Interagency HIV Study (WIHS). Innholdet i denne publikasjonen er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke de offisielle visningene av National Institutes of Health (NIH). Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer og kvinner Interagency HIV infeksjon Study (WIHS) [tilskuddet antallet U01 AI103397], National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, National Institutes of Health [bevilgning antall P30AI073961], Nasjonalt Senter for Advancing translasjonsforskning Sciences og National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller, National Institute of Health [bevilgning antall UL1TR000460 og 1KL2TR000461], og National Institute of Child Health and human Development, National Institute of Health [bevilgning antall K23HD074489].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
