Abstract
I dette manuskript, vi først beskrive fremstillingen protokollen for en mikrofluid chip, med guld prikker og fibronectincoatede regioner på samme glassubstrat, at netop styrer genereringen af tandem bobler og individuelle celler mønstrede nærheden med veldefinerede steder og former. Vi viser derefter frembringelsen af tandem bobler ved anvendelse af to pulserende lasere lysende et par guld prikker med et par-mikrosekund tidsforsinkelse. Vi visualisere boble-boble interaktion og jet dannelse ved høj hastighed billedbehandling og karakterisere det resulterende flow felt ved hjælp partikel billede Velocimetri (PIV). Endelig præsenterer vi nogle anvendelser af denne teknik til enkelt-celle analyse, herunder cellemembranen porering med makromolekyle optagelse, lokaliseret membran deformation bestemmes af forskydningerne af vedlagte integrin-bindende perler, og intracellulært calcium respons fra ratiometrisk billeddannelse. Vores resultater viser, at en hurtig og retningsbestemt jetting flow er proindført ved tandem boble interaktion, der kan pålægge en meget lokal forskydningsspænding på overfladen af en celle dyrkes i umiddelbar nærhed. Endvidere kan forskellige biologiske virkninger fremkaldes ved at ændre styrken af jetting flow ved at justere standoff afstand fra cellen til tandem bobler.
Introduction
Der er en voksende erkendelse af, at cellulær heterogenitet, som følge af stokastiske ekspression af gener, proteiner og metabolitter, der findes i en stor celle population og fungerer som et grundlæggende princip i biologi at give mulighed for celle tilpasning og evolution 1. Derfor er det ofte unøjagtige og upålidelige til at bruge befolkningsbaserede bulk-målinger til at forstå funktionen af de enkelte celler og deres samspil. Udvikling af nye teknologier til enkelt-celle analyse er derfor af stor interesse i biologisk og farmakologisk forskning, og kan bruges, for eksempel, for bedre at forstå de centrale signalveje og processer i stamcellebiologi og kræft terapi 2-4. I de senere år har fremkomsten af mikrofluide platforme lettet betydeligt encellede analyse, hvor positionering, behandling og observation af svaret fra individuelle celler er blevet udført med hidtil ukendte analytiske strategier 5.
Kavitation spiller en vigtig rolle i en bred vifte af biomedicinske anvendelser, herunder behandling af kræft med høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) 6, den ikke-invasiv fragmentering af nyresten ved trykbølge lithotripsi (SWL) 7, lægemiddel eller genafgivelse ved sonoporation 8, og den nyligt rapporterede destruktion af celler eller væv ved hydrodynamisk boble kavitation 9,10. På trods af dette, de dynamiske processer i kavitation boble (r) interaktioner med biologisk væv og celler er ikke blevet forstået. Dette skyldes tilfældighed i kavitation initierings- og boble dynamik fremstillet ved ultralyd, chokbølger, og lokalt hydraulisk tryk; desuden er der en mangel på muliggøre teknikker til at løse de iboende komplekse og hurtige reaktioner af biologiske celler, især på enkeltcelle-niveau.
På grund af disse udfordringer, er det ikke overraskende, at meget få undersøgelser har bin rapporteret at undersøge boble-celle-interaktioner under velkontrollerede eksperimentelle betingelser. F.eks membran porering af individuelle celler fanget i suspension 11 og den impulsive store deformation af humane røde blodceller 12 er blevet påvist under anvendelse af laser-genereret enkelt bobler i mikrofluidkanaler. Sidstnævnte teknik kan imidlertid kun producere meget lille deformation i eukaryote celler på grund af tilstedeværelsen af kernen 13. Desuden er det vanskeligt at overvåge downstream biologiske virkninger ved behandling celler i suspension. I andre undersøgelser har ultralyd excitation af en cellebundet mikroboble (eller ultralydkontrastmidlet) til fremstilling af membran porering og / eller intracellulære calcium reaktioner i enkelte adhærente celler blevet rapporteret 8. Membran porering af enkelte adhærente celler kan også fremstilles ved hjælp af laser-genereret tandem bobler i et tyndt væskelag, som indeholder lys-absorberende Trypan blå opløsning 14, ellermed et oscillerende gasboble genereret af mikrosekund laserimpulser bestråler gennem en optisk absorberende substrat i microchambers 15. Sammenlignet, den optisk absorberende substrat har en fordel i forhold laser-absorberende Trypan blå opløsning, fordi sidstnævnte er toksiske for celler. Endnu vigtigere er, laser-genererede bobler er mere kontrollerbar i form af boble størrelse og placering end akustisk ophidset bobler. Ikke desto mindre, i alle disse tidligere undersøgelser, de celle form, orientering og vedhæftning betingelser blev ikke kontrolleret, der kan have væsentlige påvirke celle respons og biologiske virkninger produceret af mekaniske påvirkninger 16.
For at overvinde disse ulemper i tidligere undersøgelser, har vi for nylig udviklet en eksperimentel system til boble generation, celle mønsterdannelse, boble-boble-celle-interaktioner og real-time bioassays af celle respons i et mikrofluid chip konstrueret ved hjælp af en unik kombination af mikrofabrikation techniques. Tre vigtigste funktioner, der adskiller vores eksperimentelle system fra andre på området, er: 1) mønsterdannelse af mikrometerstore guld prikker på glassubstratet at muliggøre lokaliseret laser absorption for boble generation 17; 2) mønsterdannelse af mikrometerstørrelse øer af ekstracellulær matrix (ECM) for celleadhæsion på det samme substrat at kontrollere både placeringen og geometrien af individuelle celler; og 3) komprimering af dimensionen af boblen-boble-celle interaktion domæne fra 3D til en kvasi-2D plads til at lette i planet visualisering af boble-boble-interaktioner, jetting strømningsfelter, cell deformation og biologiske virkninger, alle fanget i en strømlinet billeddannelse sekvens (figur 1d).
Figur 1: Den mikrofluid chip og Skema af forskellige analyser. a) Et samlet mikrofluid chip med kanaler fyldt med blåt blæk til visualisering. b) En region inde i mikrofluid chip med mønstrede celler og guld prikker (afstanden mellem de to guld prikker i nærhed er 40 um). Mange par af arbejdsenheder kan arrangeres i en kanal. c) Close-up billede af en enkelt arbejdsgruppe bestående af et par guld prikker og en HeLa celle klæbet til den celle-mønster region. d) Skematisk af enhedens funktion. En enkelt celle klæber til og spredes i den "H" -formede ø overtrukket med fibronectin. Et par kavitationsbobler (tandem boble) med anti-fase svingning frembringes ved belysning pulseret laserstråler på guld prikker (se figur 4a), hvilket fører til dannelsen af en hurtig og lokaliseret jet hen imod målcellen nærheden. Cellen kan deformeres, porerede for makromolekylær optagelse, og / eller stimuleret med en calcium respons, afhængigt af standoff afstand (S d), i cellen til tandem boble.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Denne platform kan yderligere kombineres med fluorescens assays og funktionaliserede perler knyttet til celleoverfladen for kavitation-induceret bioeffekter. Især denne platform baner vejen for pålidelige og kvantificerbare analyser på enkelt-celle niveau. Indtil nu har vi anvendt indretningen til analyse af tandem boble-induceret cellemembranen deformation, celle porering og intracellulære optagelse, levedygtighed, apoptose, og intracellulært calcium respons. I den følgende protokol beskriver vi processen med chip fabrikation og proceduren for at analysere de forskellige biologiske virkninger nævnt ovenfor. Desuden er driften af chippen også beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrofabrikation
BEMÆRK: Alle microfabrication procedurer udføres i et renrum. En krom maske er udformet før microfabrication, se figur 2.
Figur 2: Skematisk af kanalen design i mikrofluid chip og dimensionerne af arbejdsenheder. a) Maske udformning af de på linje PDMS mikrokanaler (grøn) og de mønstre på glassubstratet (blå og rød). b) Forstørret billede af masken design i et repræsentativt udsnit af de arrays arbejder enhed. c) Skematisk af en arbejdsenhed, der viser en celle mønster (blå) og et par guld prikker (rød). Alle skalaer de længde vises nederst til højre. Klik her for at se et larger version af dette tal.
- Guld dot mønster
BEMÆRK: Arealet af hver guld prik er designet til at være inden for 25-30 um 2, således at den er stor nok til at absorbere laserenergi til boble generation, men lille nok til at undgå individuelle celler adhærerer til det. Et skematisk diagram til guld prik fabrikation er vist i figur 3a.- Objektglas rengøring (i en kemisk hætte)
- Skyl objektglasset med acetone efterfulgt af isopropylalkohol (IPA), og derefter tørre den med N2 flow.
- Soak slide i Piranha løsning (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1) i 10 min.
- Tag det dias, skyl den med DI vand, og tør den med N2 flow.
- Bage objektglasset på en varmeplade ved 120 ° C i 10 minutter.
- Behandl dias i et plasma asher ved 100 W i 90 s.
- Spin-coating (spin-coating hætte)
- Tænd en kogeplade og vente, indtil temperaturen er stabil ved 95 ° C.
- Følg coating-proceduren:
1000 rpm i 5 s med en 500-rpm / s rampe;
derefter 3.000 rpm i 30 s med en 1.000-rpm / s rampe. - Fastgør den rensede objektglasset på spin coater ved påføring af et vakuum.
- Dæk glideflade med P-20 og starte overtrækket opskrift.
- Gentag belægningsprocessen til NFR-negative fotoresist.
- Bag det dias ved 95 ° C i 60 s og vente, indtil den er afkølet til stuetemperatur.
- fotolitografi
- Monter krom maske på maske aligner og sørg for, at mønsteret vender ned mod dias.
- Indstil fotolitografi opskriften til eksponering hårdt med 9 s af UV eksponering og hurtigt justere glasset substrat med masken.
- Efter at have udført UV eksponering, bage det dias ved 956 C i 1 min, og lad den køle ned til stuetemperatur.
- Udvikling
- Udvikle mønstret på dias i udvikleren løsning til 60 s.
- Fjern dias fra udvikleren, skylle det med DI vand, og tør den med N2 flow.
- Kontroller mønster geometri under et mikroskop, og måle og registrere funktionen størrelse.
- Guld deposition (E-beam fordampning) og lift-off
- Bag objektglasset ved 120 ° C i 5 min, og lad den køle ned til stuetemperatur.
- Rengør dias med plasma i den reaktive ion ætsning (RIE) maskine i 90 s ved 500 Torr og 100 W.
- Depositum 5 nm af Ti og 15 nm Au på objektglasset ved hjælp af en E-beam fordamper 17.
- Soak slæden natten over i et bægerglas indeholdende fotoresist remover opløsningsmiddel for at fjerne guldet hviler på toppen af NFR modstå.
- Hent det dias, flush it med acetone efterfulgt af IPA, og tør den med N2 flow.
- Tør dias på en varmeplade ved 115 ° C, før den rengøres i ilt plasma asher ved 100 W i 90 s.
- Objektglas rengøring (i en kemisk hætte)
- Molekylær-montage mønster med lift-off (MAPL)
Bemærk: Arealet af hver fibronectin-coatede ø er indstillet til at være inden 700-900 um 2 til at fremme passende HeLa celle spredning i et kvadratisk område og samtidig minimere chancerne for flere celler sammenhobning på øen. Et skematisk diagram til fremstillingen af celle-mønsterdannende øer er vist i figur 3b.- spincoating
- Gentag trin 1.1.2, men brug S1813-positive photoresist og en temperatur på 115 ° C.
- aligned fotolitografi
- Monter krom maske på maske aligner og sørg for, at den side med det mønster, vender ned mod dias medguld prikker.
- Indstil fotolitografi opskriften til eksponering hårdt med 9 s af UV eksponering.
- Juster den øverste maske med bunden slide hjælp tilpasning mærker, placeret rundt i kanten af masken, som en rumlig reference.
- Tjek den centrale del af masken og kontrollere, at mønster funktioner er justeret korrekt.
- Gennemfør UV eksponering uden en post-bage.
- Udvikling
- Gentag trin 1.1.3, men med 45 s udvikling før tørring på en kogeplade og konservering i N2 opbevaring.
- spincoating
- kemisk behandling
- Forbered passiverende opløsning: 0,5 mg / mL PLL-g-PEG i 10 mM HEPES-buffer.
- Hent dias fra N2 opbevaring og rens det med RIE med indstillingen parameter: 500-Torr pres, 100-W magt, og 90-s varighed.
- Pipette én dråbe passiverende opløsning på et stykke paraffin film. </ Li>
- Sandwich løsningen med filmen og dias, og sørg for, at siden med mønstret funktioner vender ned mod film; undgå dannelse af bobler.
- Vent 45 minutter, før du fjerner dias fra filmen.
- Soak slide hinanden i fotoresist remover, fotoresist remover og DI vand (1: 1), og DI vand, og agitere det i et ultralydsbad i 90 s for hver blød.
- Tør dias på en kogeplade for at fjerne fugten før forsegling det i en ekssikkator og lagring i køleskab.
- Chip samling
- Gentag trin 1.1.1-1.1.4, men med SU8-2025-negative photoresist og indstillingen parameter nævnt kaldt MICROCHEM protokol 18, at udarbejde en silicium form med en fotomaske.
- Fabrikere en PDMS mikrokanal (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x B x H) og en lille PDMS plade (800 um-dækkende rille struktur) under anvendelse blød litografi.
- Punch microchannel for flydende adgang porte og renses med tape og derefter med IPA.
- Shield den mønstrede område af glassubstratet med PDMS slab, og anvende RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) for at fjerne PLL-g-PEG fra det perifere område.
- Behandl mikrokanalplade med en reduceret dosis af RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), og ret det til det mønstrede glas substrat (med den lille PDMS plade fjernet); bringe mikrokanal og mønstrede glassubstrat i overensstemmende kontakt under en stereoskop.
Figur 3: Skematisk tegning til mikrofabrikation og chip forsamling. a) Mønster af guld prikker på glassubstratet. b) Fremstilling af glassubstratet for celle mønsterdannelse via MAPL. c) Montering af mikrofluid kanal med plasma bonding. Se Materialer List for definitionerne of forkortelserne. Klik her for at se en større version af dette tal.
- cellevedhæftning
BEMÆRK: HeLa-celler rutinemæssigt opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS og 1% antibiotisk / antimitotiske opløsning i en cellekultur inkubator. Et skematisk diagram for chippen samling og cellebinding er vist i figur 3c.- Prime chippen med PBS i 30 minutter ved 1 pl / min, og derefter gennemtrænge fibronectin-opløsning (50 ug / ml i PBS, 1 pi / min) i 45 min.
- Mens venter, Trypsinisér cellekultur med 0,25% trypsin-EDTA, vaske dem i dyrkningsmedium, centrifuge individuelle celler, og rekonstituere cellesuspensionen i forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium med 5x10 6 celler / ml.
- Erstatte fibronectin opløsning med PBS og skyl chippen ved 10 uL / minut i 5 minutter.
- Indsprøjteden fremstillede cellesuspension i chippen, standse strømmen, klemme udløbet, og opretholde chippen i en cellekultur inkubator i 30 min.
- Slip udløbet og skylle chip med celledyrkningsmediet ved 10 uL / minut i 5 minutter. Reducer perfusion strømningshastigheden af dyrkningsmediet til 0,75 pl / min og vedligeholde cellekulturen i 2 timer i inkubatoren.
2. Bubble Generation og Flow Visualization
BEMÆRK: En skematisk af forsøgsopstillingen er vist i figur 4a for tandem boble generation og den resulterende strøm interaktion med en enkelt celle dyrkes i nærheden i en mikrofluid kanal.
- Generation af tandem bobler med to lasere og timing kontrol
- Placer mikrofluid chip på scenen af et omvendt mikroskop og tilpasse foci af to pulserede Nd: YAG lasere (λ = 532 nm, 5-ns puls varighed) på et par mønstrede guld prikker adskilt by 40 um.
- Brug en digital forsinkelse generator til at udløse de to lasere med en tidsforsinkelse omkring 2,5 mikrosekunder til at producere to bobler indledt på guld prikker.
- Juster laseren udgangsenergi (~ 10 μJ) for at fremstille en maksimal diameter på boblerne inden for 50 ± 2 um.
- Synkronisere en højhastigheds-kamera (200-ns eksponering og 2 millioner frames per sekund (fps)) til lasere og fange dynamikken i boble ekspansion, kollaps, boble-boble interaktion, og jet formation.
- Kvantificering af strålehastighed
- Registrere positionen af jet spids (J1) ved den proksimale ende af den første boble (B 1) og den distale ende af B 1, begyndende ved genereringen af den anden boble (B2) og slutter med touchdown af J 1 mod den distale ende af B 1; se den skematiske i figur 5a.
- Lineært passe tidsforløbet af position for both den proksimale (jet spids) og de distale ender. Beregn hældningen af spidsen position versus tidskurve for den proximale ende for at bestemme strålehastighed. Skæringspunktet mellem de to linjer angiver jet touchdown tid. Flere detaljer kan findes i reference 19.
- Visualisering af tandem boble-inducerede felt flow
- Forberede 1 um af polystyren (PS) bead suspension i DI vand (2,6% vægt / volumen) og injicere perlerne ind i mikrofluid chip.
- Generer tandem bobler som beskrevet i trin 2.1.1-2.1.3.
- Optag tandem boble dynamik ved hjælp af en high-speed videokamera med en billedhastighed på 5 M fps med en 100-ns eksponeringstid.
- Upload den erhvervede billedsekvens til en kommerciel PIV software.
- Opdel hvert billede i mindre forhør vinduer i 16 x 16 pixel (px) med et overlap på 75%.
- Påfør multi-pass iteration og regionale filtre for at reducere fejlene i hastighedsfelt beregning, ogoutput resultaterne i en hastighedsvektor kort.
Figur 4: Skematisk af forsøgsopstillingen og billedoptagelse. a) Eksperimentel opsætning for tandem boble generation. b) Tid sekvens anvendes til forskellige typer af overtagelser billeddannelse. FL: fluorescensmikroskopi, BF: lyse felt, IFT: interframe tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Single-celle Analyse og bioeffekter
BEMÆRK: tandem boble er produceret siden målcellerne, og de resulterende biologiske virkninger studeres i et dødvande distance-afhængig måde. Tidsforløb forskellige typer erhvervelser billede er vist i figur 4b.
- Membrane porering og makromolekylære optagelse
BEMÆRK: Optagelsen af ekstracellulære makromolekyler i målcellen er karakteriseret ved gradvis diffusion af membranen impermeabel propidiumiodid (PI) gennem poreringsstedet på cellemembranen.- Efter trin 1.5, erstatte regulært dyrkningsmedium (dvs. DMEM) med PI-opløsning (100 pg / ml i DMEM) kører med en perfusion gennemstrømningshastighed på 0,5 pl / min gennem hele forsøget.
- Program mikroskop kontrol software til automatisk at vælge PI fluorescerende kube på den roterende tårn og synkronisere timingen af CCD kamera med PI fluorescens excitation at fange fluorescens billeder med en eksponeringstid på 200 ms.
- Efter de to laser foci er afstemt til et par guld prikker ved siden af en målcelle, optage både lyse felt (BF) og fluorescens (FL) billeder, før tandem boble behandling.
- Brug mikroskop styresoftware til straksstarte en tidsforskudt fluorescens billedoptagelse af målcellen kort efter trin 2.1 til fange historie PI-optagelse.
- Membrane deformation
- Forberede 1 um perler (1% vægt / volumen, aktiverede med vandopløseligt carbodiimid) og funktionalisere dem med peptid-2000 (100 ug / ml i PBS).
- Efter trin 1.5, inkuberes de vedhæftede celler med de funktionaliserede perler ved en densitet på 1x10 9 perler / ml ved 37 ° C i 30 minutter.
- Gentag trin 2.1 for at producere tandem bobler ved siden af målcellen og registrere celle deformation med en ultra-high-speed kamera kører på en billedhastighed på 5 mio fps.
- Identificer en triade af 3 perler, der forbliver på billedplanet hele eksperimentet og kompilere deres positioner som (x 1, y 1) (x 2, y 2), og (x 3, y 3) i eksperimentet koordinater.
- Beregne arealet af triaden før og AFTer tandem boble behandling under anvendelse af formlen:
- Beregn stammen område som:
- Baseret på koordinaterne for de tre knudepunkter før og efter tandem boble behandling, beregne den lokale primære stamme og område stamme ifølge etablerede protokoller 20,21.
- Levedygtighed og apoptose
BEMÆRK: FITC Annexin V etiketter celler, herunder apoptotiske dem, via en udlægning af phosphatidylserin (grøn fluorescens). PI etiketter kerner af nekrotiske celler (rød fluorescens). Bright field imaging bruges til at dokumentere cellemorfologi og bistå med identifikationen af cellernes levedygtighed og apoptose.- Notér positionen af hver behandlet celle i mikrofluid kanal (lettes af adresseetiketter i kanalen, se fig 2b
- Inkuber de behandlede celler i cellekulturmediet i yderligere 2 timer før perfusion af chip med FITC Annexin V opløsningen i 15 minutter. Positive celler udviser grøn fluorescens.
- Gentag trin 3.3.2 24 timer efter tandem boble behandling for at studere de langsigtede biologiske virkninger i de målrettede celler.
- calciumrespons
- Bland 3 pi fura-2:00 stamopløsning (1 mg / ml i DMSO) med 3 pi 10% vægt / volumen Pluronic F-127 i 500 pi reduceret serummedium at forberede den endelige mærkning opløsning (6 uM).
- Efter trin 1.5, udskifte cellekulturmedium med mærkningen opløsning og inkuber ved stuetemperatur i mørke i 40 min (1 pi / min perfusion rate).
- Fyld kanal med den reducerede serum medium (0,75 uL / min perfusion sats), før du starter celle eksperimentet.
- Start ratiometriske imaging (bølgelængde: 340/380 nm, 50-ms eksponering)af målcellen ved hjælp af kommercielle PTI-systemet.
- Efter 10 s ratiometrisk billeddannelse af cellen på hvile-niveau, producere tandem bobler som i trin 2.1; første plade med en interframe tid (IFT) på 0,1 s for 1 min, og derefter hæve den IFT til 1 s for en anden min, og yderligere stigning til 5 s efter 2 min.
- Brug PTI software til at beregne forholdet R = F340 / F380 i regionen af interesse (ROI), som er proportional med den intracellulære calciumkoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofluid platform beskrevet i dette arbejde kan anvendes til at undersøge boble-boble-interaktioner og til at analysere en række kavitation-inducerede biologiske virkninger på enkeltcelle-niveau. Her præsenteres flere eksempler for at påvise en række eksperimentelle undersøgelser og bioassays, der kan udføres i vores eksperimentelle system. Vi vil først illustrere de forbigående interaktioner af tandem bobler med jet dannelse, visualiseringen af den resulterende flow felt, og beregningen af strålehastighed (figur 5a). Vi vil derefter præsentere eksempler på tandem boble-induceret lokaliseret cellemembranen deformation (figur 5b), sat fingeren membran porering med PI-optagelse (fig 5c), og intracellulært calcium respons (figur 5d). Andre eksempler, såsom cellelevedygtighed og apoptose-assays, kan findes i reference 22.
Figur 5a viser et eksempel på tandem boble interaktion med jet formation, fanget af højhastigheds-billeddannelse, og den resulterende flow felt afsløret af PIV. Specifikt efter dens maksimale ekspansion, er sammenbruddet af den første boble B 1 (fremstillet ved 0 mikrosekunder) forvrænget asymmetrisk ved den hurtige ekspansion af den anden boble B 2 (produceret ved 2,5 mikrosekunder), hvilket fører til dannelsen af en "opadgående" jet (J1) på 3,4 mikrosekunder og den efterfølgende jetting flow, vist ved 5,4 mikrosekunder. Den gennemsnitlige strålehastighed er bestemt af hældningen af en monteret linje til positionen af den proximale ende (eller pol) over B 1 før touchdown (dvs. kontakt med den distale ende af B 1) mod tiden. Den gennemsnitlige strålehastighed er fundet at stige fra 20 til 58 m / s, når den maksimale diameter af B 2 stiger fra 40 til 60 um. Baseret på resultaterne af PIV-analyse, den retningsbestemte jetting strømningen omkring tandem boble er af størrelsesordenen 10 m / s og er indesluttet i en bredde af størrelsesordenen 10 um. Det er således i stand til at producere en impulsiv og lokaliseret forskydningsspænding og stress gradient på en målcelle dyrkes i nærheden.
En anden er vist i figur 5b eksempel illustrerer cellemembranen deformation fremkaldt af den retningsbestemte og lokaliseret jetting flow frembringes af tandem bobler på standoff afstand S d = 40 um. Membranen deformation og gendannelse er fremhævet med forskydningen af en funktionaliseret vulst (angivet af den gule stiplede linje) fastgjort til den forreste kant af cellemembranen. Det lokale område stamme kan beregnes ud fra koordinaterne for en triade af tilstødende perler. En skematisk af det beregnede ændring maksimale areal på forskellige steder på celleoverfladen vises i midten. Forkanten er primært strakt (se de grønne cirkler), mens bagkanten eller latrelle sider af cellen komprimeres (som angivet ved de røde cirkler), hvilket indikerer heterogenitet i celle deformation frembragt af tandem boble induceret jetting flow. Den tidsmæssige variation af stammen området ved cellepositionen forkant er vist til højre. Det består af et par hurtige svingninger i starten, efterfulgt af et stort og vedvarende stretch for omkring 100 mikrosekunder (FWHM) og en efterfølgende gradvis genopretning på en tidsskala af flere ms.
Endvidere det store område stamme og stamme integreret i cellen forkant kan være ansvarlige for cellemembranen porering observeret ved lille S d, som vist i Figur 5c. Ved lille S d (dvs. 10 um, eller i nogle tilfælde, 20 um) og mellemprodukt S D (dvs. størstedelen af 20 og 30 um), en lokaliseret membransprængning induceres, hvilket fører til en lokalisere optagelse af ekstracellulær PI indcytosolen. Hvis PI intensitet inde i cellen vokser stadigt uden mætning, nekrose sker. I sammenligning, hvis PI intensitet er en størrelsesorden lavere og når et plateau inden for 10 s efter tandem boble behandling, vil repareres porering med sandsynlige celleoverlevelse forekomme, hvilket er yderligere understøttet af den minimale ændringer i cellemorfologi. Ved store S d (dvs. 40 pm), ubetydelig PI optagelse er fundet efter tandem boble behandling, hvilket indikerer ubetydelig eller ikke-perforering. Cellen kan overleve med regelmæssig vækst og spredning 22. Samlet set viser resultaterne en tydelig overgang i celle respons fra nekrose, gennem repareres membran porering, ikke-porering i området S d ≈ 20-40 um.
Endelig viser vi resultaterne af ratiometrisk billeddannelse af intracellulært calcium fremkaldt af tandem bobler i individuelle celler på forskellige Sd, især i subletale intervallet S d = 30-50 um (figur 5d). Intensiteten forholdet er proportional med mængden af intracellulært calcium. Ved lille S d (dvs. 30 um eller, i nogle tilfælde, 40 um), en calcium bølge rejser fra forkanten til bagkanten er klart observeres inden for få sekunder efter tandem boble behandling. Efter den intracellulære calcium når et højdepunkt koncentration, det henfalder langsomt tilbage til hvilende niveau i løbet af få minutter. I modsætning hertil ved store S d (dvs. et flertal af 50 um, eller i nogle tilfælde, 40 um), stigningen i intracellulært calcium er meget mildere, og noget klart synligt rejser calcium bølge kan identificeres. Disse to forskellige calcium responser kan også skelnes fra deres intensitetsforhold versus tidsprofiler, med betydelige forskelle i spidsamplituden af intensitetsforholdet indsvingningstid fra hvilende niveau topperværdi. På et endnu større S d (dvs. over 60 um), kan ingen calcium respons observeres. Procentdelen af HeLa-celler udviser calcium reaktioner ved forskellige S d er opsummeret i figur 5d (til højre).
Alt i alt har vores resultater vist, at ved at ændre styrken af jetting flow (eller skiftende S d), kan en række forskellige biologiske virkninger fremstilles i individuelle HeLa-celler under lignende dyrkningsbetingelser, hvilket sandsynligvis korrelerede med amplitude og varighed af den mekaniske deformation pålagt cellemembranen 22.
Figur 5: Resultater fra tandem boble interaktion, cellemembran deformation, membran porering, og calcium respons assays. a) Flydende bevægelse og jetinduceret af tandem boble interaktion. Venstre: Udvalgte billeder viser tandem boble interaktioner med jet dannelse og flow felt afsløret af PIV. De maksimale diametre af to boblerne er omkring 50 ± 2 um. I midten: Skematisk af jetting tandem bobler, illustrerer midteraksen, oprindelse af koordinaterne (o), og proksimale og distale ender (eller pæle) af den første boble B 1. Højre: Målt pole positioner (med fejl = ± 1 um) på den proksimale og distale ende af B 1. b) Cellemembran deformation. Venstre: Den gule stiplede linje etiketter forskydningen af en PS vulst fastgjort til den forreste kant af cellemembranen, hvilket indikerer den lokale membran deformation og gendannelse. I midten: en skematisk viser toparealet stammer på forskellige steder på celleoverfladen vises til venstre. Til højre: De tidsforløb for området stammer i midten af cellen forkant. Δ ε er de område stammen beregnede based på vigtigste stammer og Δ Δ er stammen område beregnes på basis af triaden geometri forandring. Flere detaljer om beregning området stamme og fejlanalyse er dokumenteret i reference 22. c) Cell membran perforering. Venstre: lyse felt billeder før og efter tandem boble behandling og time-lapse fluorescens billeder af PI-optagelse (0 og 120 s). De hvide pile angiver jetting strømningsretningen. Midten: den typiske ændring af gennemsnitlig PI intensitet som funktion af tid inde i cellerne. Højre: Statistiske resultater af procentdelen af celler, som undergår nekrose (rød), repareres porering (blå), og ikke-porering (grøn) ved forskellige S d. Antal celler behandlet: N = 9, 14, 14, og 8 for S d = 10, 20, 30, og 40, henholdsvis. Den statistik fejl er ± 1 / √ N. d) Intracellulær calcium respons. Til venstre: sekvenser af ratiometriske billeder, der viser den intracellulære calcium-responser af individuel celles ved S d på 30 um og 50 um. De røde pile angiver jet retning. I midten: typiske respons profiler (forholdet tid kurver) ved forskellige S d. Til højre: sandsynligheden for en calcium respons på forskellige S d. Klik her for at se en større version af dette tal.
| standoff afstand (S d) (um) | Reynolds tal (Re) | gennemsnit forskydningsspændingen (Pa) i yz planet |
| 20 | 206,96 | 618,64 |
| 30 | 354,8 | 709,69 |
| 40 | 378,78 | 657,22 |
| 50 | 163,85 | 323,61 |
| 60 | 105,08 | 42.21 |
Tabel 1: En liste over parametre for flow fysik fra PIV resultater. Anslået Reynolds tal og gennemsnit forskydningsspænding i forhold til forskellige standoff afstande (S d). YZ-planet refererer til kanalen bredde x højde fly. Den midlede forskydningsspænding estimeres fra en højde fra 0 til 7,7 um fra kanalen bunden fordi cellens højde i kanalen er omkring 6-7 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Single-celle analyse, i kombination med live-cell imaging, har i høj grad forbedret vores forståelse af de dynamiske og ofte variable processer i de enkelte celler, såsom fænotype udvikling og immunrespons 23. I modsætning til den konventionelle cellekultur i skåle eller kolber, mikrofluide systemer gør det muligt præcis styring af mikromiljøet, ned til den encellede niveau, i realtid. Derfor fremskridt i mikrofluid teknologi og teknikker har i høj grad forbedret gennemløb og reproducerbarhed af enkelt-celle analyse. Ved at integrere blød litografi og overflade mønster, kan mikrofluide systemer yderligere designet til at lette den grundige analyse af en enkelt celle respons på komplekse mønstre af spatiotemporally variable stimuli. For eksempel har forbigående kemiske eller mekaniske signaler blevet leveret til enkelte celler, mens deres biologiske eller mekaniske responser automatisk blev registreret og analyseret 2Fire. På trods af denne generelle tendens, har anvendelsen af mikrofluidik til at analysere kavitation-inducerede biologiske virkninger på celleniveau været meget begrænset. Mest bemærkelsesværdigt er det kun blevet anvendt til boble-induceret membran porering af individuelle celler i suspension fanget af micropillars 11. I de fleste undersøgelser af adhærente celler, fordelen ved at kontrollere cellens morfologi at bevare sammenhængen i dynamiske boble-celle-interaktioner er enten utilgængelig eller stort set forsømt.
Vi har udviklet et mikrofluidsystem til præcist at kontrollere indledningen, efterfølgende ekspansion, og kollaps dynamik kavitation bobler; boble-boble interaktioner med jet dannelse; og celleform, orientering, adhæsion mønster, og standoff afstand fra boblerne, således give mulighed for reproducerbar jetting flow, der skal anvendes på individuelle celler under velkontrollerede forsøgsbetingelser. Denne hidtil ukendte mikrofluidsystem er ideel til udførelse af fundamental studies på kavitation boble (r) celle-interaktioner, der er relevante for en bred vifte af terapeutiske ultralyd applikationer, såsom SWL, HIFU, og sonoporation. Vi har vist, at vores mikrofluidsystem kan anvendes til at undersøge forskellige kavitation-inducerede biologiske virkninger, herunder cellemembranens deformation, membran porering, levedygtighed og calcium respons, i en mere kontrollerbar og reproducerbar måde. Mest bemærkelsesværdigt den retningsbestemte jetting flow produceret af tandem bobler tillader os at undersøge den mekaniske egenskab og calcium respons i individuelle celler under høje strain satser, som ikke er godt karakteriseret. Den lokaliserede, impulsiv mekanisk belastning produceret af en sådan jetting flow ikke kan opnås ved traditionelle stretching metoder, såsom mikropipette aspiration 25 og brugen af optiske 26 og magnetiske pincet 27. Derudover, i modsætning til tidligere undersøgelser under anvendelse af ultralydskontrastmidler 8,28-30 eller laser-induceret enkelt bubbles 31,32, tilbyder vores mikrofluidsystem bedre kontrol med celle geometri og adhæsionsforhold, og dermed reducere deres væsentlig betydning for cellulær respons og bioeffekter 16.
Mens vores teknik er pålidelig og reproducerbar, må man følge protokollen forsigtigt for at sikre, at det eksperimentelle system trofast bliver reproduceret. Kvaliteten af overfladevand mønster i mikrokanalplade er hovedansvarlig for reproducerbarheden af boble-boble-celle-interaktioner og den kaskade af downstream bioeffekter. For eksempel til HeLa-celler, skal arealet af hver guld prik være omkring 25-30 um 2 at sikre en stabil boble generation samtidig forhindre cellerne i at klæbe. På den anden side, arealet af hver fibronectin-coatede ø har at være omkring 700-900 um 2 for at lette passende spredning af en enkelt celle i en firkant samtidig reducere risikoen for flere celler, der danner aggregater på øen. Justeringmellem guld prikker og de fibronectincoatede øer er specifikt udføres ved hjælp af masken aligner at holde vinkelfejlen inden for 1 ° og den aksiale fejl inden for 0,5 um. Desuden denne eksperimentelle system giver alsidighed i overvågningen en række arrangementer, med deres tid skala varieres ved størrelsesordener (f.eks boble dynamik: mikrosekunder, celle deformation: ms, membran porering: s, apoptose: h). Derfor er det vigtigt præcist at styre tidspunktet for erhvervelsen billedet og registrering af hver sekvens ved at finjustere trigger signaler (kontrolleret af en digital forsinkelse generator). Den fælles-cellekultur skal være godt vedligeholdt i mikrokanal at minimere celle-til-celle variation i fænotype (hovedsagelig benævnt morfologi). Derfor er et minimum 2-timers inkubation kræves til cellebinding og spredning på øerne før du fortsætter med efterfølgende celle behandling. Det anbefales altid at holde flowet i microchannel under 3 uL / min, således at strømmen forskydningsspænding frembringes af cirkulerende dyrkningsmedium på cellen er inden for det fysiologiske område.
En strømbegrænsning af vores teknik er, at tandem boble interaktion og den resulterende jetting flow kun kan anvendes til en målcelle gang, fordi guld prikker skal fjernes af laser bestråling. Denne ulempe begrænser muligheden for vores eksperimentelle system til at efterligne biologiske virkninger frembragt af terapeutisk ultralyd, hvor cellerne er ofte udsat for kavitation begivenheder. Dette kan dog tidsmæssig begrænsning afhjælpes ved at anvende en anden tyndt lag af siliciumdioxid for at beskytte guld prikker fra direkte eksponering i væsken 15. Samlet set vores mikrofluidsystem tilbyder velkontrollerede eksperimentelle betingelser for at undersøge de biologiske virkninger fremstillet af kavitation boble (r)-celle interaktioner og har flere unikke funktioner. Først, både størrelsen og placeringen af kavitation bobler i vores experimental systemet kan styres præcist ved at justere indfaldende laserenergien absorberes af guld prikker. For det andet, er geometri og vedhæftning af de enkelte celler standardiseret af celle mønster for at minimere deres virkninger på celle responser og biologiske virkninger, der fører til mere reproducerbare resultater. Tredje, de parallelle arbejdsbetingelser enheder i mikrofluid chip design gør det muligt at studere downstream biologiske virkninger, såsom cellevækst, proliferation og potentielt genekspression, efter kavitation eksponering, idet hver celle kan behandles og kontrolleres individuelt. Sammenfattende vores mikrofluidsystem og metode skaber pålidelige boble-boble interaktioner at studere de biologiske virkninger af de enkelte celler med forbedret præcision.
Vores nuværende chip er udformet til analyse af individuelle HeLa-celler. Men en modifikation af mønstret øer for andre mammale cellelinjer er også mulige. kan gøres flere forbedringer yderligere udvide applications af chippen. For eksempel kunne erstatninger af PLL-g-PEG-molekyler undersøges for at stoppe individuelle mønstrede celler i at migrere selv efter 24 timer. Derudover kan nye chip designs med mikrofluide ventiler undersøges for at kontrollere den lokale mikromiljø af cellerne, således at kemikalier såsom fluorescens markører eller toksiske reagenser kun vil blive anvendt til et bestemt sted, uden at påvirke cellerne i andre områder af chippen . Med disse forbedringer, kan mikrofluidsystem præsenteres her giver muligheder for at studere de langsigtede biologiske virkninger af enkelte celler, såsom stofskiftet, segregation, differentiering og genekspression, efter kavitation eksponering eller mekaniske stimuli produceret af en impulsiv flow.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Materials | |||
| 75 mm x 38 mm Plain Microscope Slides | Corning | 2947-75X38 | |
| Acetone | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%, FCC, FG |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS reagent, 95.0-98.0% |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Direct write mask |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | 1-methyl-2-pyrrolidinone based |
| S1813 photoresist | Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Paraffin film | HACH | 251764 | |
| SU-2025 photoresist | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Microbore Tubing | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metal pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (straight), 0.025” OD x 0.017” ID x 0.50” Long |
| HeLa cells | Duke Cell Culture Facility | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| DPBS (1x) buffer | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| DMEM culture medium | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Carboxylate Microspheres 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Carboxylate Microspheres 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) |
| Reduced serum media | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar plasma ashing of photoresist and other organic materials |
| Mask aligner | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| E-beam evaporator | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (oxide/ nitride/ polymer) etching |
| Stereoscope | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Stereo Microscope |
| Syringe pump | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Cell culture incubator | NuAire | AutoFlow NU-8500 Water Jacket CO2 Incubator | |
| Biological Safety Cabinets | NuAire | NU-425-400 | |
| Water bath | VWR | 1122s | |
| Centrifuge | IEC | Centra CL2 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG laser (laser 1) | New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG laser (laser 2) | New Wave Research | Orion | |
| Delay generator | Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | |
| Flash lamp | Dyna-Lite | ML1000 fiber-coupled flashtube | |
| high speed camera | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| high speed camera | Shimadzu | HPV-X | |
| high speed camera | Vision Research | Phantom V7.3 | |
| PIV software | LaVision | DaVis 7.2 | |
| camera | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| software | Zeiss | AxioVision | |
| PTI system | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio software | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | version 2.3.125.86 |
| 63× objective | Zeiss | LD Plan Neofluar |
References
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al.
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H.
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101 (2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
