Summary
Denne studien omfatter metoder for å avdekke effekter på en modell fisk rekke etter forandring av huden og tarmmiljøer mikrobiomer sammensetning av et antibiotikum.
Introduction
Det har blitt fastslått at antibiotika kan forstyrre den menneskelige mikrobiomer fører til dysbiosis, noe som betyr en mikrobiell fellesskap ubalanse. Den microbiota sin kompositoriske endring etter antibiotika behandlinger har vist seg å redusere samfunnets mangfold, redusere sentrale medlemmer, og endre samfunnet metabolisme, spesielt i tarmen 1, 2. Antibiotikum forstyrrelse av tarmen mikrobiomer kan redusere kolonisering motstand mot Clostridium difficile 3, 4 og 5 Salmonella.
I tillegg har avbrudd av den bakterieflora vært knyttet til utvikling av mange syndromer og sykdommer hos mennesker (f.eks antibiotika-assosiert enterokolitt, inflammatorisk tarmsykdom, metabolske forstyrrelser, osv.). Antibiotika er også mye implementert i landbruket som vekst arrangører istorfe og fjørfe produksjon 6. Bruken av disse kraftige verktøyene er ikke uten sikkerhet effekter, som er tydelig i den raske veksten av antibiotikaresistens, samt effekten av en forstyrret mikrobiomer har med sine bebodde vert. Mange studier har vist at bredspektret antibiotika-bruk har langvarige konsekvenser for strukturen og funksjonen av bakterieflora, men likevel bivirkninger fra en antibiotika-forstyrret mikrobiomer påvirker verts fysiologi er bare spekulasjoner som ennå ikke er støttet.
Samspillet mellom verts, bakterieflora, og antibiotika er langt fra å bli forstått i en kortfattet måte. Derfor er en enkel og mer medgjørlig modell fordel å belyse den meget komplekst pattedyr system. Slimhinneoverflater hos mennesker, inkludert tarmen, havnen den høyeste tettheten og mangfoldet av mikrober, og også de mest intime mikrobe-vert interaksjoner. Slimhinnene hud mikrobiomer av fiske tilbud several fordeler som et modellsystem. Den Teleostei (beinfisk) er en av de tidligste linjene til divergerer i Vertebrata betyr at teleoster har både medfødte og ervervede immunforsvar som har co-utviklet et forhold med commensal bakteriesamfunn 7. Fiskeskinnet deler mange egenskaper med type 1 mukosale overflater av pattedyr, slik som fysiologiske funksjoner, immunkomponenter, og anordningen av mucus-produserende celler 8. Den eksterne plassering av fiskeskinn mukosale overflaten gir en mikrobiomer lett å manipulere og eksperimentelt prøven.
Den vestlige mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), er en modell fisk som har blitt brukt tidligere for å studere parring og toksikologi 9, 10, 11. Gitt den lille størrelsen, befolkningen overflod i naturen som en invaderende art, m inimal omsorg kostnader, og hardfør art, har vi utviklet G. affinis som en slimhinne mikrobiomer modell. Videre Gambusia dele fysiologi for å føde levende unger med vivipare pattedyr, som er uvanlig i fiskearter. Vi fullførte den mest omfattende studien på tidspunktet for fiskeskinn normal bakterieflora ved hjelp av 16S profilering med Gambusia 12. Videre arbeid demonstrerte tre negative effekter på verten følgende avbrudd i huden og tarmen microbiota ved hjelp av en bredspektret antibiotikum 13.
Fem forskjellige effekter ble undersøkt i fisken følgende antibiotika eksponering. Den mest veletablerte rekke fordel for mikrobiomer er konkurransedyktig utelukkelse av patogener. Fisken patogen Edwardsiella ictaluri er kjent for å forårsake utbrudd av enteriske septikemi i kommersielle steinbit gårder 14. E. ictaluri har også vist seg å lethally infisere sebrafiskclass = "xref"> 15, 16 og Gambusia 17. En utfordring med denne organismen fra vannsøylen kan tjene som et mål for eksklusjon. Som en sammenligning for å mottakelighet for en individuell patogen, ble overlevelse ved eksponering for en høy tetthet av blandede organismer også utført. Avføring og organisk-rik jord ble brukt som vanlig forkommende kilder til mikrobielle samfunn.
En annen etablert rolle bakteriell tarm samfunnet utfører er næringsstoff prosessering og energi høsting, og dermed påvirke den generelle næringsopptaket for verten. Som en grov måling av ernæring, ble fiskekroppsvekt sammenlignet før og etter en måned for å bli matet en standard diett. Antibiotika-behandlet fisk i gjennomsnitt gått ned i vekt mens kontrollfisken i gjennomsnitt gått opp i vekt i løpet av måneden. Mekanismen for denne manglende vektøkning er uklart. En mulig medvirkende faktor er transittiden av mat i tarmen. En GI motiheten Metoden ble tilpasset fra sebrafisk (Adam Rich, SUNY Brockport, personlig kommunikasjon) for å bestemme transitt tid. Det er ennå ikke bestemt om antibiotika-behandlet fisk har en endret transitt tid.
En felles utfordring opplevde i naturen av alle organismer, spesielt fisk, er osmotisk stress. Gambusia er blitt vist til raskt å tilpasse når akutt understreket i høye konsentrasjoner av salinitet 18. Overraskende fisk med en antibiotika-forandres mikrobiomer oppviste redusert overlevelse til en høy salt stress. Mekanismen for denne romanen fenotype er under etterforskning. En annen vanlig belastning på akvatiske dyr, særlig i akvarier, er toksiske former av nitrogen (ammoniakk, nitrat og nitritt). Overlevelse mot nitrat var ikke signifikant forskjellig mellom antibiotika-behandlet og kontrollfisk. Metodene som presenteres i dette manuskriptet kan brukes med Gambusia eller lignende fisk modellorganismer, slik som sebrafisk og medaka, for å måle fenotyper i fisken etter eksperimentell manipulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført under godkjenning av IACUC protokoller, nummerert 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, og 14-04-17-1018-3-01.
1. Animal Collection, håndtering, og livssyns Care
- Samle Gambusia affinis fra feltet området (identifikasjon guide på http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) med en liten dip net og sted til 19 L bøtter. Bruk visuell inspeksjon for å identifisere arter.
- Rest fisk for 1-2 d i en bøtte med vann i dammen. Etterpå overføre fisken inn 76 eller 189 L akvarium tanker fylt med halve dammen vann / halvparten vann fra springen ved 25 ° C, karbonisert med en boblende airstone. Bruk en liten dip net ved håndtering av fisk som til minimal forstyrre deres hud mikrobiomer.
MERK: Fisketettheten bør ikke være høyere enn 20 fisk / 38 liter akvarium vann. Fisk er akklimatisert til akvariet i minst 5 d før eksperimentering. - Mate fisk på en daglig diett med 5 mg flake mat per fisk. HoLD fisk med en 12 timers lys / 12 timers mørk syklus.
2. Første Antibiotika eksponering for alle eksperimenter
- Tegning all fisk fra hvert forsøk fra samme akvariet, plasser i to separate grupper (behandlet: utsettes for antibiotika og kontroll: ueksponerte) i 19 L bøtter. Tidligere data samlet inn viser at fisk i samme akvariet har homogenisert hud microbiomes som har liten variasjon i samfunnet komposisjon. 12
- Under forsøk, holder fisken i 2 liter kunstig dam vann (APW, 0,33 g / l CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l NaHCO3) som er sterilisert ved autoklavering før bruk.
- Klargjør rifampicin antibiotikum forrådsløsning ved tilsetning av 50 mg / ml i dimetylsulfoksid (DMSO). Rifampicin er en representant bredspektret antibiotikum som er ikke-giftig for fisken. Hos mennesker og mus, det distribuerer godt i vev.
- Fra rifampicin lager administrere en endeligkonsentrasjon på 25 ug / ml i 2 liter APW for antibiotikum eksponering av den behandlede fisk gruppen i 3 dager. Legg merke til at etter 3 d, dyrkbar hud bakterietall tilbake lignes med forbehandlet fiskeskinn.
- Parallelt holde en gruppe av ubehandlet fisk i APW og gi en ekvivalent mengde av DMSO (0,5 ml pr liter APW) i vannsøylen for å virke som en kontrollgruppe.
- Som forsøk har til hensikt å måle effekten av en antibiotika-endret mikrobiomer på fiske fenotyper, for å unngå effekter direkte fra antibiotikumet i seg selv, etter tre dagers antibiotikum eksponering (eller kontroll) periode, overføre fisk inn i en bøtte med 2 liter frisk APW.
- Bruker en 10 timers hvileperiode slik at antibiotikumet er fjernet ved organer av fisken. Base denne eliminering tid på eksperimenter hvor fisken ble eksponert for 25 ug / ml av antibiotikum i tre dager. Avlive fisken ved snipping ryggmargen etterfulgt av pithing, deretter homogenisere hele kroppen ved hjelp av en vev jeksel.
- Bestemme tilstedeværelsen antibiotikum ved å plassere 50 ul av denne suspensjonen etter 0,2 mikrometer filtrerings inn i sentrum av en agar petriskål. Lag hull til denne suspensjonen ved å trykke på en opp-ned steril 200 mL pipette inn i agar, som fjerner en liten plugg.
- Bruk agar plater med 20 ml målte volum av næringsagar, og spredt jevnt ved hjelp av en bomullsdott med en indikatororganisme, Bacillus subtilis, som er følsom for rifampicin. Skaff B. subtilis fra et næringsstoff agar inkuberes ved 25 ° CO / N og bruke bomullspinne for å få en koloni. Observere en sone av inhibering etter inkubering over natten ved 25 ° C indikerer nærvær av antibiotika i fiskevevet.
3. mikrobiomer Utvinning
- Ekstraher en hud mikrobiomer prøve fra de ytre slimhinnehuden ved å plassere fisken i en steril 15 ml konisk rør fylt med 2 ml sterilt PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosfat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) oppløsning og vortexblanding ved en innstilling på 10 i 1 minutt med intervaller på 10 s eller midlertidig. Vaskemiddel og salt i bufferen fremmer også dispersjon av bakterier i oppløsning. Sammenlignbare resultater ble funnet med 0,85% saltvann, men senket bakterietall med rent vann.
- Overføre fisken fra den koniske rør til et gjenvinnings bøtte. Letalitet av hud ekstraksjon er vanligvis lavere enn 10%. Heller, analysere bakteriesuspensjonen i røret umiddelbart ved ekstraksjon eller pelletere bakteriene med en 2 min sentrifugering i en sentrifuge ved romtemperatur ved 15 000 xg og oppbevar ved -80 ° C for fremtidig analyse.
MERK: All kultur og biokjemiske analyser er umiddelbar; DNA eller protein ekstraksjon kan være fra frosne prøver. - For å få en gut mikrobiomer prøve, først legg fisken i en steril petriskål. Avlive fisken ved å adskille den cervikale ryggmargen direkte bak hodet med kirurgiske sakser, etterfulgt av pithing, Og deretter eksternt rense kroppen med 70% etanol våtservietter.
- Etter disseksjon, fjerne hele tarmen ved å kutte etter spiserøret og før anus.
- Skjær tarmen i små seksjoner 1 - 2 mm i lengde og plassere alle deler i to ml PBST løsning i en konisk tube. Etter virvling i 1 min, fjern supernatanten til et annet rent rør (ta forsiktighet for å ikke trekke opp tarm seksjoner).
MERK: Supernatanten inneholder hentet tarmbakterier som enten kan brukes til direkte analyser eller pelletert ved den forrige metoden nevnt for hudprøver.
4. Infeksjon Modell Utarbeidelse og Bath av en spesifikk Patogen
- Skaff en smittsom stamme av Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) og holde kulturen lagret ved -80 ° C. Strain 93-146 brukt i denne studien, isolert fra en infisert steinbit, ble hentet fra Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University.
- streak E. ictaluri lager på en selektiv og differensial media kalles E. ictaluri media (EIM) agar 19 til kultur bakterier og inkuber i 2 d ved 27 ° C.
- Overføre en ren isolert koloni fra kulturen og inokulere en 150 ml kolbe inneholdende 40 ml næringsbuljong (NB; 5 g / l pepton, 4 g / l kjøttekstrakt). Sted kolbe i et risteapparat satt på 150 rpm i 2 d ved 27 ° C.
- Etter inkubasjon fortynne en prøve av kulturen i PBST til et spektrometer avlesning på 0,2 OD ved 650 nm for å kalibrere E. ictaluri kultur for ønskede infeksjonsdosevolum.
- Neste transfer begge behandlet (etter 3 d av antibiotika eksponering) og ubehandlede fiskegrupper i individuelle plast kopper som inneholder 130 ml fersk kunstig dam vann, eller APW for ca 10 timer for narkotika klarering fra fiske vev.
- Deretter fra begge gruppene, overføre på nytt hver fisk i åtte-unse plast kopper som inneholder 130 ml ren APW. Gi hver fisk en dødelig dose inneholdende 2,8 x 10 6 CFU / ml av E. ictaluri kultur i APW (bad-infeksjonsmodell) og holde i en 27 ° C inkubator i 24 timer.
- Etter E. ictaluri bad, overføre fisk individuelt inn i nye kopper med 130 ml APW.
- Etter vannutskiftning, rekord fiskedødelighet over varigheten av en uke. Fisk er ikke lei i løpet av denne perioden. I motsetning til steinbit, Gambusia viser ingen ytre tegn på infeksjon, derfor er det viktig å bruke dødelighet som et eksperimentelt endepunkt.
5. polymikrobielle Challenge med avføring og Jord
- avføring Treatment
- Skaff ferske menneskelig avføring fra en frisk frivillig emne som ikke har fått antibiotika i de siste to ukene, ved hjelp av sterile hansker og et sterilt 50 ml konisk tube.
- Ved innsamling, samle avføring i en steril plastpose og deretter overføre til et sterilt 15 ml conical tube. Skape en lager-konsentrasjon ved å suspen avføring i PBST for å gi en stamløsning av 500-800 mg / ml. Dette tykke blandingen er best å overføre anvendelse av en 1 ml eller større plast pipettespiss som har blitt kuttet ved bunnen med steril saks, slik at åpningen blir større.
- Etter initial antibiotikum eksponering av behandlede og ubehandlede kontroll fiskegrupper, skilles i individuelle plastkopper som inneholder avføringssuspensjonen ved sluttkonsentrasjoner på enten 15 mg / ml eller 10 mg / ml til APW med et totalt volum på 130 ml. Hold kopper i en inkubator ved 25 ° C.
- Vanlig fiskedødelighet under avføring eksponering ved nøye observasjon i løpet av to d.
- Jord Treatment
- Samle 1 - 2 kg av rik organisk matjord (skal inneholde den høyeste tettheten og mangfoldet av mikrober) ca 7-15 cm ned i dybden og legge det i en ren plastbeholder. Vær oppmerksom på at jorda skal brukes innen to dager etter samlingen.
- directly etter innledende eksponering, skille begge grupper av antibiotika behandlet og ubehandlet fisk i individuelle plastkopper som inneholdt 18,2 g av jord i 130 ml APW. Bland jord i vann godt for hånd før tilsetning av fisken. Mesteparten av partiklene ikke suspendere og bo på bunnen av koppen.
- Expose fisk for en varighet på 3 d ved 25 ° C og registrere all dødelighet.
6. osmotisk stress Challenge
- Etter behandling etterfulgt av en 10 timers hvileperiode som er beskrevet ovenfor, individualisere fisk inn i separate kopper inneholdende NaCl ved 17,5 mg / ml (300 mM) i 150 ml APW. Dette er halvparten av den typiske saltinnholdet i sjøvann, noe som ikke er fullt ut dødelig (<50%) for å styre fisk, men er sterkt belastende, krever effektiv osmoregulering.
- Observer for fisk dødelighet over en periode på 36 timer.
7. Nitrat Toxicity Challenge
- Rest fisk for en 10 timers periode etter antibiotika exposure, og deretter separat fisk inn i individuelle kopper inneholdende et natriumnitratkonsentrasjon på enten 10 mg / ml (118 mM) eller 17,5 mg / ml (206 mM) i 130 ml APW.
- Rekord for dødelighet over 4 d for lav dose og en d for høy dose.
8. Vekst Analyse av Individualisert eller Gruppert Fish
- Komplett 3 d antibiotika eksponering eller kontrollperioden som grupper i bøtter.
- For Individuell, fyller 8-oz Styrofoam kopper med 150 ml APW hver, overføre en enkeltfisk i koppen og ta total kroppsvekt for innledende vurdering.
- Gjenta for all fisk i både behandlet og ubehandlet grupper. Bruk hvite Styrofoam kopper i stedet for klar plast kopper fordi fisken ikke vil spise når du er i den klare kopper.
- Mate fisk daglig med standard diett av to pellets per fisk. Pelletene ble anvendt i stedet for flak, fordi pellets har lav varians i individuell masse (3,53 ± 0,42 mg hver, eller 8% variasjon), resulting i fisk motta lignende mengder mat. Overvåk forbruket med visuelt opptak uspist fôr. Forbruk prisene var vanligvis over 80%.
- Ved slutten av hver uke i løpet av 4 uker, bestemme fiskevekt. Klargjør en ny kopp med fersk APW, plassere på en balanse, og deretter ta opp vekten. Deretter helles en fisk inn i en dip net fra den opprinnelige koppen og inn i den nye kopp, som deretter veid igjen. Fisk er ikke håndteres for å unngå stress.
- For grupper, plassere 2 liter APW inn i en 19 L bøtte og tare skalaen. Hold fisken sammen i begge gruppene ved overføring til nye APW bøtter og registrer totale gruppen vekt. Vanlig fiskegruppen vekt hver uke over en måned tidsrom ved å overføre til en ny bøtte.
9. Gut Transit Tid
- Bruke fluorescein-merket 70 kDa anionisk dekstran. Dekstran er ikke vesentlig fordøyd, og er for stor til å bli absorbert på tvers av tarmen lag, således passasje vil måle transitt-tiden gjennom tarmen.Merket dekstran ble innlemmet i fiskefôr.
- Inn i et sterilt 1,7 ml rør, tilsett 360 ul sterilt avionisert vann og 52 mg gelatin (13% oppløsning), og plassere røret på en 60 ° C varmeblokk inntil gelatin smelter og er fullstendig oppløst.
- Grind gullfisk matvareflak til et fint pulver ved bruk av en morter og pistill, og tilsett 40 mg av dette pulver til røret, sammen med 20 ul av fiskeolje. Etter blanding, tilsett 1,6 mg FITC-dekstran.
- Tilsett den varme væsken blandingen i 20 mL faller oppå Parafilm på lab benken, og la dem raskt kjølig og stivne. Drops kan lagres i opptil 4 d før de blir for vanskelig for fisk å spise. Lagres i kjøleskap faller ved å plassere Parafilm på halvparten av en petriskål, som deretter fløtet på sterilt vann inne i en forseglet plastbeholder, som holder dråpene fuktede.
- Like før fôring, faller kvartal i seksjoner ved hjelp av et barberblad. Akklimatisere fisken til Styroskum kopper individuelt for 2 dager uten fôring (Merk: Bare ueksponerte kontroll fisk ble brukt). Plasser fire fjerdedeler av mat i koppen med fisken, og observere fisken i 30 minutter for hvor mange biter av maten de hver spise.
- Til å begynne overvåkingsperioden, overføre fisk individuelt i kopper med 80 ml APW med en dukkert nett. Hver 2 h, forsiktig virvel APW for hånd, og deretter ta en 1 ml prøve og lagre i en merket 1,7 ml rør ved 4 ° C. Ta prøver for 36 timer.
- Record fluorescens, med et fluorescens-spektrofotometer, av alle prøver ved samme tid etter fullføring av analysen. Plasser hele 1 ml prøve i en kyvette, og registrere fluorescens målt ved hjelp av eksitasjon ved 495 nm og emisjon ved 520 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En samlet skjematisk diagram av det eksperimentelle system som brukes til å studere fisk verts effekter av antibiotikum eksponering 13 er vist på figur 1A og omfatter teknikk for ekstraksjon av hud (figur 1B) og tarmer (figur 1C) microbiomes fra fisken. Tre dager ble valgt som antibiotika periode eksponering fordi tidligere data viser at mens det totale huden dyrkbare antall dråper tidlig i behandlingen, har det kommet tilbake til nivået før behandlingsnivåer etter 3 d. I mellomtiden samfunnet sammensetning, bestemt ved 16S profilering, har vært sterkt endret. Derfor bør den tre-dagers periode være optimal for å analysere virkningene av en endret fellesskap av tilnærmet samme tetthet. Merk at kultur analyse, med koloni tall på agarskåler kan utelate en rekke arter. Effektivitet av huden mikrobiomer dispersjonen metode (figur 1B 10 april-10 mai CFU / g fiskevekt) til koloni tall fra flere fisk utsatt for den samme suspensjonen fremgangsmåte en gang (for å tallfeste eventuell gjenværende bakterie). Tellinger fra denne andre suspensjonen var lavere enn 100 CFU / g, noe som tyder suspensjonen metoden er effektiv (upublisert).
Fisk med en antibiotika-endret mikrobiomer ut til å være mer utsatt for en E. ictaluri smitte enn kontrollfisken (figur 2). Forskjellen i midlere tid til død 56,1 ± 15 timer for den behandlede fisk og 98,5 ± 48 timer for kontrollfisken var ikke statistisk signifikante (to-halet t-test, p = 0,12). Dette er sannsynligvis på grunn av den lille gruppestørrelsen (behandlet n = 6, kontroll n = 5). Gruppestørrelser på minst et dusin er derfor anbefalt. En fordel med denne infeksjonsmodell er den bath protokollen, som ikke krever nåler for infeksjon eller sporing av matinntak. E. ictaluri invaderer naturlig steinbit fra vannsøylen. Sikkerhet er høy fordi E. ictaluri er temperaturfølsom, og dermed dårlig smittsomme for mennesker. Andre studier har avdekket at tiden i hjel i G. affinis korrelerer med den første dosen av bakterier. Den inkubasjonstemperatur på 27 ° C ble valgt som optimale for både bakterier og fisk.
Behandlet eller kontrollfisken ikke har store forskjeller i overlevelse i vann som er forurenset med høye tellinger av blandede mikrober. Ingen dødelighet ble observert i løpet av 4 dager for kontroll (n = 8) eller behandlet (n = 9) fisken når jord ble brukt som mikrobiell kilde. Mens noen dødelighet forekom med menneskelig avføring som kilde av mikrober (Tabell 1), behandling med antibiotika gjort noen forskjell. Når konsentrasjonen av avføring i APW var på 20 mg / ml, 40 - 50%av fisken døde. Men konsentrasjonen av oppløst oksygen var bare 10% (sammenlignet med> 80% i bøtter eller akvarier), og dermed de hypoksiske betingelser vist tolkningen. Ved lavere nivåer av 16 eller 10 mg / ml ble anvendt, ble overlevelsesrater matchet (tosidig Fishers eksakte test, p = 0,95 eller større for en forskjell mellom grupper). Oksygennivå i disse to studiene var 65% eller høyere. Gambusia er en svært hardføre arter som kan leve i lav kvalitet på vannet. Det ville være interessant å bruke disse analysene av naturlig mikrobiell eksponering for å måle overlevelsen av andre arter mot en utfordring av forurenset vann. Prøver av vann fra bestemte miljø områder, spesielt de som utsettes for eutrofiering, kan bli brukt i en lignende analyse, selv om vannkvaliteten (oppløst O 2, nitrat, saltinnhold, osv.) Trenger å bli bestemt som et potensielt problemfaktor.
Fish eXposed til rifampicin var mer utsatt for osmotisk stress enn kontrollfisk (figur 3). Log-rank test observert en signifikant forskjell (p = 0,049) i overlevelsesrate (43% død i kontrollgruppen og 88% død i behandlede gruppe, n = 9 for begge grupper) når utfordret med forhøyet saltinnhold. Resultatene fra denne analysen avtalt med en bestemmelse av 18,1 mg / ml som LC 50 for NaCl med G. affinis på 24 timer i ferskvann 20. Tegn på saltvann stress som fisk utstillingen omfatter rødhet rundt gjellene og redusert svømming bevegelse. Med denne analyse, saltnivå over 18 mg / ml medførte rask fiskedød.
Når de utsettes for toksinet nitrat i vannsøylen, har pre-eksponering for antibiotikum ikke påvirke overlevelse (tabell 2). For hvert forsøk, ble døden spilt både på kort og lang tid punkt, som representerer akutte og mer kroniske effekter. konsentrasjonenpå 10 mg / ml ble valgt basert på det å være LD 50 for G. affinis i ferskvann på 48 h 21. Resultater fra denne analysen var i overensstemmelse med denne LD 50-verdien, med en 50% dødelighet i både behandlede og kontrollgruppene etter 90 timer. En høyere utfordring av nitrat (17,5 mg / ml) ble også undersøkt, fører til hurtigere død. Igjen var det ikke forskjell i behandlingsgruppene. Nitritt er dramatisk mer toksisk enn nitrat til G. affinis, med en LD 50 av 0,0015 mg / ml ved 48 t 22. Fellesskap biokjemisk analyse ved hjelp av analyseprofilen indekssystem (upublisert) viser at fiskeskinnet bakterieflora har potensiale til å redusere nitrat. Imidlertid forble nitrittnivåene i APW under begge forsøk under deteksjonsgrensen (0,001 mg / ml). Denne utfordringen metoden kan brukes med noen små løselige kjemikalier.
Når individualiseres i kopper og matet than samme mengde av hver fisk for en måned, ble en tendens observert for antibiotika-behandlede fisk til ikke få vekt, så vel som kontrollfisk, uten en statistisk signifikant forskjell (data ikke vist). For å unngå stress av individualisering, ble fisk plassert sammen som en gruppe for behandlet og ubehandlet fisk i bøtter for en måned og gitt matchet mengder mat. Begrensningen av dette oppsettet er at fisken ikke kan motta den samme maten på individuell basis. Men i gruppen modell, behandlet fisk i gjennomsnitt gått ned i vekt og kontroll fisk i gjennomsnitt gått opp i vekt (Tabell 3). Mengden mat fisken ble forbruker ikke synes å være påvirket av tidligere antibiotika eksponering, så appetitt undertrykkelse er en usannsynlig kandidat forklaring på manglende vektøkning. Mange andre faktorer kan bidra, inklusive endringer i betennelse i tarmen, nivåer av slimproduksjon, gut permeabilitet og / eller tarm motilitet. En stor fordel med denne assay for å måle ernæring foronal effekter er enkelhet. Det er billig, og krever bare et laboratorium balanse som instrumentering. Det er hensiktsmessig å screene for en effekt, som fører til andre involverte eksperimentering for å bestemme mekanisme.
Et eksempel faktor for å undersøke relatert til fisk vektøkning er mat transittiden, som er relatert til tarmbevegeligheten. FITC-merket dekstran kan innlemmes i gelatinert mat og er-dødelige for fisken. Å måle fluorescens i det omgivende vann over tid gir et mål på hvor raskt den FITC-dekstran passerer gjennom tarmen. Fluorescens ovenfor bakgrunn kan oppdages så snart som 2 timer, med en maksimal oppnådd etter 16 timer etter mating (figur 4). Dette resultatet er med kontrollfisken fra et akvarium. Pålitelige resultater fra antibiotika-behandlede fisk har ennå ikke blitt oppnådd. En begrensning ved denne fremgangsmåten er at en 2-d sulteperiode er nødvendig for fisken å spise maten. en adv antage av protokollen er høy følsomhet (lav bakgrunnsfluorescens), som fisk spiser bare en mat delen kan gi resultater, selv om dataene er mer konsekvent når to seksjoner er spist. Denne protokollen er mindre komplisert enn en tilsvarende og dødelig metode for mus 23.
Figur 1: Skjematisk oversikt over den felles Forsøksprotokoll. A er et flytskjema som illustrerer, fra venstre til høyre, fisk overføres fra akvarium, separert i antibiotika-behandling (representert ved rød vann) eller kontroll (blå) grupper, og deretter plassert i individuelle kopper for å spore fenotyper. B og C viser prosessen med å trekke fiskeskinnet og tarm microbiomes. Etter virvling, blir bakterier suspendert i oppløsningen for analyse av den mikrobielle samfunnet.55170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Patogen følsomhet. En overlevelseskurve under eksponering til E. ictaluri for fisk forbehandlet med rifampicin (rød linje), eller en ubehandlet kontrollgruppe (sort linje) fisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mottakelighet for osmotisk stress. En overlevelseskurve under eksponering til høy salinitet for fisk i begge antibiotika-behandlede og ubehandlede grupper. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Mat Transit Time. Fluorescens over tid i vannet fra to fisk foret FITC-dekstran. Fisk A spiste to gelatin mat seksjoner og fisk B spiste en. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Mottakelighet for høy mikrobiell miljøer. Eksponering for menneskelig avføring ble vurdert på 3 forskjellige konsentrasjoner. Død forholdet mellom x og y viser det totale antall fisk døde ved den angitte tid punktet x i forhold til det totale antall fisk i den eksperimentelle gruppen y.
Tabell 2: Nitrat Toxicity Challenge. Registreres tidspunktet for fiskedød i behandlede og kontrollgrupper gjennom eksponering til et giftig nitratkonsentrasjon. Død forholdet mellom x og y viser det totale antall fisk døde ved den angitte tid punktet x i forhold til det totale antall fisk i den eksperimentelle gruppen y.
Tabell 3: Vekst Analyse. Endringer i total kroppsvekt etter en måned følgende antibiotika eller kontroll behandling. Den prosentvise forskjell i utgangs midlere kroppsvekt (for fisk ved at prøvegruppe) i forhold til endelig midlere kroppsvekt er kolonnen Δweight. N er antall fisk i den gruppen. Gjennomsnittlig vekt per fisk på slutten av rettssaken er undervektig / fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noen utfordringer krever en hvileperiode i ren APW etter antibiotikabehandling for at stoffet skal bli tømt i fiske vev. Hvis hvileperioden er utelatt, da antibiotika tilstedeværelse kan forvirre resultatene, særlig når analysen innebærer eksponering for bakterier. For å undersøke effekter av et endret mikrobiomer sammensetning uten store endringer i det totale antallet mikrober på verten, setting overvåking mikrobiomer sammensetning (16S profilering eller hele genomsekvensering) og befolkningstetthet (16S kvantifisering via qPCR) i løpet av antibiotika eksponering ville være påkrevd. Mens 3 d er optimale i dette systemet, endring av vert og / eller antibiotika ville kreve rekalibrering.
Typisk for biomedisinsk forskning, er det musemodell som vanligvis benyttes for mikrobiomer studier. Den vanligste fisken modellen er sebrafisk. For å få en bedre forståelse av de universelle egenskaper av struktur og funksjon av mukosal Microbiomes og vert interaksjoner, nye og atypiske modeller er en nødvendighet. Vår WT fisk modellen fungerer som en autentisk kilde for å studere verts mikrobiomer interaksjoner ved å inkludere naturlig vert genetisk variasjon som andre modeller har tapt på grunn av generasjoner av lab-høynet dyr innavl 24. En stor eksperimentell fordel av Gambusia er deres hardfør art, tolerer en rekke forhold. Høye overlevelse har blitt observert i vannet som varierer i temperatur (4-38 ° C), saltholdighet (0-17 mg / ml), oppløst oksygen (110-25%), og pH (4-8). Dette gjør det mulig ikke bare å undersøke mange miljøforhold, men også for flertrinns eksperimentelle prosedyrer som ofte er for stressende for andre fiskearter.
Prosedyrene som presenteres her er egnet for rask screening for å oppdage verts effekter fra en bestemt behandling. Oppfølgingsstudier er nødvendig for å fastslå direkte årsakssammenheng og mekanisme. Eksempel forlengelse studies for fisken mikrobiomer verts effekter er: måling tarmbetennelse, undersøkelse av fiskehelsen ved å tallfeste fettlagrene, og måling av slim nivåer på huden og i tarmen. En gnotobiotiske Systemet er utviklet for å studere i detalj lenker til spesifikke mikrober til bestemte verts fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
