호스트 표현형의 시험에 Gambusia의 affinis입니다 다음은 항생제 치료

이 연구는 항생제에 의해 피부와 장내 마이크로 바이 옴의 사회 구성의 변경 다음 모델 물고기 호스트에 효과를 나타 내기 위해 방법을 포함한다.

이 실험 시스템의 전반적인 목표는 항생제 처리 후 숙주 유기체에 대한 부정적인 부작용을 조사하는 것입니다. 따라서 이 방법은 교란된 마이크로바이옴에 의해 매개되는 숙주의 건강에 대한 엔박 관련 부작용과 같은 마이크로바이옴 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 이 시스템이 척추동물 숙주의 생리학적 표현형을 검사하는 데 간단하고 저렴하며 점막 마이크로바이옴에 대한 비침습적 파괴를 허용한다는 것입니다.

이 기술의 함의는 동물의 마이크로바이옴의 붕괴가 어떻게 심각한 부작용으로 이어질 수 있는지를 특징짓습니다. 시작하려면 이전에 획득하여 동결된 Edwardsiella ictaluri 감염성 균주를 E.Ictaluri 선택적 및 차등 배지 한천에 줄무늬로 삽입합니다. 배양물을 섭씨 27도에서 이틀 동안 배양합니다.

배양물에서 순수한 분리 콜로니를 옮기고 40ml의 영양 육수가 포함된 150ml 플라스크를 접종합니다. 플라스크를 섭씨 27도, 150RPM의 진탕 인큐베이터에 이틀 동안 놓습니다. 배양 후 원하는 감염 선량량에 대해 E.Ictaluri 배양을 보정하려면 PBST를 사용하여 배양 샘플을 OD 650 0.2로 희석합니다.

Gambusia affinis를 수집하고 3일 동안 물기둥에서 리팜피신으로 물고기를 처리한 후, 항생제 처리된 어군과 처리되지 않은 대조군 어군을 130ml의 신선한 인공 연못 물(APW)이 들어 있는 개별 플라스틱 컵에 약 10시간 동안 옮겨 물고기 조직에서 약물을 제거합니다. 그런 다음 생선을 130ml의 깨끗한 APW가 들어 있는 개별 8온스 플라스틱 컵으로 다시 분리합니다. 각 물고기에 치사량의 E.Ictaluri 배양을 투여하고 물고기를 섭씨 27도에서 24시간 동안 배양합니다.

E.Ictaluri 목욕을 마친 후 각 생선을 130ml의 APW가 담긴 새 컵에 옮깁니다. 물고기에게 먹이를 주지 않고 일주일 동안 물고기 폐사를 기록합니다. 수집된 배설물을 멸균 비닐 백에 모은 후 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 옮긴 다음 PBST를 사용하여 밀리리터당 500-800밀리그램의 배설물 농도를 생성하고, 팁이 잘린 상태에서 1밀리리터 이상의 플라스틱 피펫을 사용하여 15밀리리터당 130밀리리터 또는 APW에서 밀리리터당 밀리리터당 10밀리그램의 배설물을 준비합니다.

항생제 처리 또는 처리되지 않은 생선을 용액의 개별 컵에 옮긴 다음 물고기를 섭씨 25도에서 이틀 동안 배양하여 이 기간 동안 폐사율을 면밀히 관찰하고 기록합니다. 물고기를 흙으로 처리하려면 1-15cm 깊이의 풍부한 유기 표토 1kg을 모아 깨끗한 플라스틱 용기에 옮깁니다. 18.2g의 흙과 130ml의 APW가 들어 있는 개별 플라스틱 컵을 준비하고 흙을 손으로 잘 섞은 다음 항생제 처리 또는 처리되지 않은 생선을 컵에 옮기고 3일 동안 섭씨 25도에서 유지하면서 폐사율을 기록합니다.

항생제 치료 후 APW에서 10시간 휴식을 취한 후, 생선을 염화나트륨 1밀리리터당 17.5밀리그램과 APW가 들어 있는 개별 컵에 옮기고, 36시간 동안 물고기의 폐사를 관찰하고, 질산염 독성 챌린지를 수행하기 위해 이전과 같이 10시간의 휴식 시간 후에 생선을 10밀리리터당 10 또는 17.5밀리그램의 질산나트륨과 130밀리리터의 APW가 들어 있는 개별 컵으로 분리합니다. 하루 동안 물고기를 관찰하여 고용량의 질산나트륨으로 인한 폐사율을 확인하고, 4일 동안 저용량의 물고기를 관찰합니다. 3일간의 항생제를 투여하거나 집단 투여를 통제한 후, 개별 물고기의 경우 8온스의 스티로폼 컵에 150ml의 APW를 채우고, 채워진 컵의 무게를 잰 후 물고기를 컵에 옮긴 다음 초기 평가를 위해 총 체중을 기록합니다.

물고기 한 마리당 매일 두 알의 먹이를 물고기에게 먹이고, 먹지 않은 알갱이를 시각적으로 기록하여 소비량을 모니터링하십시오. 4주 동안 매주 말에 먼저 신선한 APW 컵의 무게를 측정하여 물고기의 무게를 측정하고 무게를 기록한 다음 물고기를 딥 네트에 붓고 새 컵에 옮긴 다음 컵의 무게를 다시 잰다. 물고기 그룹의 경우 150ml의 APW를 컵에 넣고 저울의 무게를 잰다.

물고기를 APW의 새 용기로 옮길 때 두 그룹에 함께 보관한 다음 총 그룹 무게를 기록하십시오. 한 달 동안 매주 말에 계량을 반복합니다. 장 통과 시간을 분석하려면 멸균 1.7ml 튜브에 360마이크로리터의 멸균 탈이온수와 52mg의 젤라틴을 넣고 젤라틴이 녹아 완전히 용해될 때까지 섭씨 60도의 열 블록에 놓습니다.

필멸자와 유봉을 사용하여 금붕어 음식 조각을 고운 가루로 갈아서 40mg의 분말과 20마이크로리터의 생선 기름을 튜브에 넣습니다. 혼합 후 FitC 덱스트란 1.6mg을 추가합니다. 뜨거운 액체 20마이크로리터를 실험실 벤치의 파라필름에 떨어뜨리고 빠르게 식히고 응고시킵니다.

파라필름을 페트리 접시의 절반에 놓고 밀봉된 플라스틱 용기 안의 멸균수에 띄웁니다. 응고된 방울은 물고기가 먹을 수 없을 정도로 딱딱해지기 전에 최대 4일 동안 냉장고에 보관하십시오. 수유 직전에 면도날을 사용하여 방울을 4등분으로 자릅니다.

물고기를 먹이지 않고 이틀 동안 개별 스티로폼 컵에 적응시키고, 음식의 4/4를 물고기 컵에 넣고, 물고기가 각각 몇 조각의 음식을 먹는지 30분 동안 관찰합니다. 모니터링을 시작하려면 개별 물고기를 80ml의 APW가 담긴 컵으로 옮기고 2시간마다 1ml의 샘플을 채취합니다. 섭씨 4도에서 라벨이 붙은 1.7ml 튜브에 보관하십시오.

분석이 완료된 후 전체 1ml 샘플을 큐벳에 넣고 형광 분광 광도계를 사용하여 495나노미터의 여기와 동시에 모든 샘플에 대해 520나노미터의 방출에서 형광을 기록합니다.여기에서 볼 수 있듯이 항생제로 변형된 마이크로바이옴을 가진 물고기는 대조군 물고기보다 E.Ictaluri 감염에 더 취약했습니다. 처리된 물고기와 대조군 물고기의 평균 사망 시간의 차이는 유의하지 않았습니다.

이것은 그룹 크기가 작기 때문일 수 있습니다. 이 그래프는 리팜피신에 노출된 물고기가 대조군 물고기보다 삼투압 스트레스에 더 취약하다는 것을 보여주며, 이 분석을 통해 염분 수치가 밀리리터당 18mg 이상일 경우 물고기가 급격히 죽었다는 것을 보여줍니다. 이 표에서 입증된 바와 같이, 물기둥의 질산독소에 노출되었을 때 항생제 치료에 대한 사전 노출은 생존에 영향을 미치지 않았습니다.

밀리리터당 10밀리그램에서 90시간에 항생제 투여군과 대조군 모두에서 50%의 치사율이 관찰되었다. 수족관에서 대조군 물고기를 사용한 이 실험에서는 FitC 덱스트란이 표시된 식품의 두 섹션 또는 한 섹션을 물고기에게 먹이어 시간 경과에 따른 주변 물의 형광을 측정하여 식품 이동 시간을 조사했습니다. 이 절차에 따라 총 체지방 저장량을 측정하고 피부 점액 생성을 정량화하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 메커니즘을 이해하고 부정적인 숙주 효과에 기여할 수 있는 교란 요인을 좁힐 수 있습니다.