Name: 호스트 표현형의 시험에 Gambusia의 affinis입니다 다음은 항생제 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 학습하세요 항생제 처리 후 미생물군 변화가 Gambusia affinis의 생리적 표현형에 미치는 영향을 분석하는 비침습적 방법을 통해. 이 기술은 저렴하고 간단하며 동물 건강에 대한 미생물군 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 샘 휴스턴 주립 대학의 EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities)에서 TPP 및 JMC에 FAST (Faculty and Student Team) 상을 수여하여 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

모든 동물 실험은, IACUC 프로토콜의 승인하에 수행, 14-05-05-1018-3-01 13-04-29-1018-3-01 및 14-04-17-1018-3-01 번호가되었다. 1. 동물 수집, 처리, 및 윤리 관리 <ol><li> 19 L 버킷에 작은 딥 그물과 장소를 사용하여 필드 사이트 (http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm에서 식별 가이드)에서 Gambusia affinis입니다를 수집합니다. 종을 식별하기 위해 육안 검사를 사용합니다. </li><li> 연못 물을 양동이에 2 일 - 1 나머지 물고기. 그 후, 버블 링 airstone와 포 25 ° C에서 절반 연못 물 / 반 수돗물 가득 76 또는 189 L 수족관 탱크에 물고기를 전송합니다. 최소한 자신의 피부 마이크로 바이 옴을 방해으로 물고기를 처리 할 때 작은 딥 그물을 사용합니다. 참고 : 물고기의 밀도는 20 생선 / 수족관 물 38 L보다 높을 수 없습니다. 물고기는 실험 전에 적어도 5 일 동안 수족관에 적응하고 있습니다. </li><li> 물고기 당 플레이크 음식의 5 밀리그램과 매일식이 요법에 물고기를 먹이. 호12 시간 조명 / 12 시간 다크 사이클 LD 물고기. </li></ol> 모든 실험 2. 초기 항생제 노출 <ol><li> 같은 수족관에서 각 실험에서 모든 물고기 그리기, 두 개의 그룹으로 배치 (처리 : 노출 항생제 및 제어 : 노출되지 않은) 19 L 버킷있다. 이전 데이터는 같은 수족관에 물고기가 지역 사회 조성에 약간의 변화가 피부 microbiomes을 균질화 한 것을 쇼를 모았다. (12) </li><li> 실험을하는 동안, 인공 연못 물 2 L 물고기를 유지 (APW, 0.33 g / L 염화칼슘 2, 0.33 g / L 황산 0.19 g / L의 NaHCO3) 사용 전에 고압 증기 멸균 소독한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 50 ㎎ / ㎖를 첨가하여 리팜피신 항생제 스톡 용액을 제조 하였다. 리팜피신은 물고기에 독성이 대표 광범위 항생제이다. 인간과 쥐에서는 조직에서 잘 분배한다. </li><li> 리팜피신 재고에서 최종 관리3 일간 처리 된 물고기 그룹의 항생제 노출 APW의 2 L에 25 μg의 / mL의 농도. 3 일 후, 배양 피부 세균 수는 전처리 물고기의 피부와 유사한 반환합니다. </li><li> 병행하여, APW에서 미처리 물고기의 그룹을 유지하고 대조군 역할을 수층으로 DMSO의 당량 (APW의 L 당 0.5 ml)에 제공한다. </li><li> 실험은 2 L 양동이에 사흘 항생제 노출 (또는 제어)주기, 전송 물고기 다음, 항생제 자체에서 직접 영향을 피하기 위하여, 어류의 표현형에 항생제 변경 마이크로 바이 효과를 측정하도록 구성되기 때문에 신선한 APW. <ol><li> 항생제는 물고기의 몸에 의해 제거되도록 10 시간의 휴식 기간을 사용합니다. 자료 물고기가 사흘 동안 항생제의 25 μg의 / mL의에 노출 된 실험에서이 제거 시간. pithing 다음 척수로 자르는 것은 물고기를 안락사 후 조직 분쇄기를 사용하여 전신 균질화.</li><li> 한천 배양 접시의 중심으로 0.2 μm의 필터링 한 후이 현탁액 50 μL을 배치하여 항생제의 존재를 확인합니다. 작은 플러그를 제거 한천로 멸균 200 μL 피펫 팁을 거꾸로 아래로 눌러이 서스펜션에 대한 구멍을 확인합니다. </li><li> 영양 한천의 20 mL를 측정 볼륨 한천 플레이트를 사용하고, 리팜피신에 민감한 지표 생물, 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)과 면봉을 사용하여 균일하게 확산. 25 ° CO / N에서 배양 영양 한천에서 B. 서브 틸리 스를 확보하고 면봉을 사용하여 식민지를 얻었다. 25 ° C에서 하룻밤 배양 한 후 억제의 영역을 관찰하면 물고기 조직에서 항생제의 존재를 나타냅니다. </li></ol></li></ol> 3. 마이크로 바이 옴 추출 <ol><li> 2 mL의 멸균 PBST (137 밀리미터 나 가득 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 물고기를 배치하여 외부 점막 표피에서 피부 마이크로 바이 옴 샘플을 추출10 초 일시 중지 단위로 1 분 동안 10의 설정에서 CL, 10 mM의 인산, 0.1 % 트윈 20, pH를 7.4) 솔루션 및 텍싱. 버퍼에 세제와 소금 용액에서 박테리아의 균일 분산을 촉진한다. 비교 결과는 0.85 %의 식염수로 찾았지만 순수한 물과 세균 수를 감소했다. </li><li> 복구 양동이에 원뿔 튜브에서 물고기를 전송합니다. 피부 적출의 치사율은 일반적으로 10 % 미만이다. 어느 즉시 추출시 튜브 내의 세균 현탁액을 분석 또는 미래의 분석을 위해 -80 ℃에서 15,000 × g으로 저장 실온에서 원심 분리기에서 2 분간 회전하여 세균 펠렛. 참고 : 모든 문화와 생화학 적 분석은 즉시이다; DNA 또는 단백질 추출 냉동 샘플에서 할 수있다. </li><li> 첫 번째 멸균 페트리 접시에 물고기를 배치하는 장내 마이크로 바이 옴 샘플을 구하십시오. pithing 다음, 수술 가위로 머리 바로 뒤에 자궁 경부 척수를 절단하여 물고기를 안락사다음 외부 70 % 에탄올 잎사귀로 몸을 소독. </li><li> 해부 후 식도 후 항문 전에 절단하여 전체 창자를 제거합니다. </li><li> 길이 2mm 및 원뿔 튜브에 두 mL의 PBST의 솔루션으로 모든 섹션을 배치 - 작은 섹션으로 1 창자를 잘라. 1 분 동안 텍싱 후, (창자 섹션을 작성하지에주의을) 다른 깨끗한 튜브에 뜨는을 제거합니다. 참고 : 상등액 중 피부 샘플에 대한 언급 이전 방법에 의해 직접 분석에 사용 또는 펠렛 할 수 있습니다 추출 장내 세균이 포함되어 있습니다. </li></ol> 특정 병원체 4. 감염 모델 준비 및 목욕 <ol><li> 인 Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri)의 감염 균주를 확보하고 -80 ° C에서 보관 문화를 유지한다. 스트레인 93 - 감염된 메기로부터 고립 된이 연구에 사용 된 146, 마크 로렌스, 동물 용 의약품의 대학, 미시시피 주립 대학에서 얻었다. </li><li> 헤어 구조 강화박테리아 문화 (19) 한천 E. ictaluri 미디어 (EIM)라는 선택적 및 차동 미디어와 27 ° C에서 2 일 동안 배양에 AK E. ictaluri 재고. </li><li> 문화에서 순수한 고립 식민지를 전송하고 영양 배지 40 mL를 함유하는 150 mL의 플라스크에 접종 (NB를, 5g / L의 펩톤, 4g / L 쇠고기 추출물). 27 ° C에서 2 일 동안 150 rpm으로 설정 통에 넣어 플라스크. </li><li> 배양 후, 원하는 감염 투여 볼륨 E. ictaluri 문화를 보정하는 650 nm에서 0.2 OD의 분광계 읽기에 PBST에서 문화의 샘플을 희석. </li><li> 다음 전송을 모두 처리 물고기 조직에서 의약품 허가를위한 약 10 시간 동안 130 신선한 인공 연못의 물 용액, 또는 APW를 포함하는 개별 플라스틱 컵에와 치료 물고기 그룹 (항생제 노출의 3 일 후). </li><li> 그런 다음 두 그룹 모두에서 깨끗하고 APW 130 mL로 포함 8 온스 플라스틱 컵에 다시 각각의 물고기를 전송합니다. </li&gt; <li> 각 물고기에게 APW에 E. ictaluri 문화의 2.8 × 106 CFU / ㎖ (목욕 감염 모델)를 포함하는 치사량을 지정하고 24 시간 동안 27 ° C 배양기에서 유지. </li><li> E. ictaluri 목욕 후, APW 130 mL로 새로운 컵에 개별적으로 물고기를 전송합니다. </li><li> 물 교체, 일주일의 기간에 걸쳐 기록 물고기 사망률 다음과 같습니다. 물고기는이 기간 동안 공급되지 않습니다. 메기 달리 Gambusia 따라서는 실험적 포인트로 치사를 사용하는 것이 필수적이며, 외부 감염의 징후를 표시하지 않는다. </li></ol> 대변 ​​및 토양 5. Polymicrobial 도전 <ol><li> 배설물 처리 <ol><li> 멸균 장갑과 멸균 50 ML 원뿔 튜브를 사용하여 이전 2 주 동안 항생제를받지 못한 건강한 자원 봉사 대상에서 신선한 인간의 배설물을 얻습니다. </li><li> 수령시, 멸균 비닐 봉지에 대변을 수집 한 후 멸균 15 ML의 C로 전송onical 튜브. 800 ㎎ / ㎖ - 500의 재고 솔루션을 제공하기 위해 PBST에 대변을 중단함으로써 주식 농도를 만듭니다. 이 혼합물을 두께 개구부가 커지도록 멸균 가위 하부 절단 된 1 mL의 이상 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 전송할 최상이다. </li><li> 처리 및 제어 미처리 생선 기의 초기 항생제 노출시킨 후, 130 mL의 총 부피로 APW 중 15 ㎎ / ㎖, 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도에서 배설물 현탁액을 함유하는 개별 플라스틱 컵으로 분리한다. 25 ° C에서 인큐베이터에 컵을 개최합니다. </li><li> 2 일 이상 경과 관찰에 의해 대변 노출되는 동안 기록 물고기 사망률. </li></ol></li><li> 토양 처리 <ol><li> 풍부한 유기 표토의 2kg (미생물의 높은 밀도와 다양성을 포함한다) 약 7 - 1 - 수집 15cm 아래로 깊이 깨끗한 플라스틱 용기에 넣습니다. 토양이 모음 다음과 같은 두 가지 일 이내에 사용해야합니다. </li><li> 무서운ctly 초기 노출 기간 후에, APW 130 ㎖의 토양의 18.2 g을 포함하는 개인 플라스틱 컵에 항생제 치료와 치료 물고기의 두 그룹을 구분합니다. 물고기를 추가하기 전에 손으로 우물에서 토양을 섞는다. 미립자의 대부분은 일시 중단과 컵의 하단에 머물하지 않습니다. </li><li> 25 ° C에서 3 일의 기간 동안 물고기를 노출하고 사망률을 기록합니다. </li></ol></li></ol> 6. 삼투압 스트레스 도전 <ol><li> 상술 한 바와 같이 10 시간 휴식 기간 뒤에 처리 후, APW 150 mL의 17.5 ㎎ / ㎖ (300 밀리미터)에 NaCl을 함유하는 별도의 컵에 물고기를 개별화. 이 생선을 제어 완전히 치명적인없는 해수의 염도 통상 (&lt;50 %)의 절반이지만 삼투 효과를 필요 강한 스트레스. </li><li> 36 시간의 기간에 걸쳐 물고기 사망률에 대한 관찰한다. </li></ol> 7. 질산 독성 도전 <ol><li> 항생제 박람회 후 10 시간 동안 나머지 물고기의 질산 나트륨 농도를 함유하는 개개의 컵에 URE 후 별도 생선 중 10 ㎎ / ㎖ (118 mM)을하거나 APW 130 ㎖의 17.5 ㎎ / ㎖ (206 mm)이다. </li><li> 저용량에 대한 사망률 4 위에 D와 고용량 1 D 녹음. </li></ol> 개별 또는 그룹화 물고기 8. 성장 분석 <ol><li> 버킷의 그룹으로 완료 3 일 항생제 노출 또는 제어 기간. </li><li> 개인의 경우, 150 mL의 APW 각각 8 온스 스티로폼 컵을 채우기 컵에 개별 물고기를 전송하고 초기 평가를 위해 총 체중을 기록한다. <ol><li> 모두 치료 및 치료 그룹의 모든 물고기를 반복합니다. 때 투명 컵에 물고기가 먹을 수 없기 때문에 대신에 투명한 플라스틱 컵 흰색 스티로폼 컵을 사용합니다. </li></ol></li><li> 물고기 당 두 개의 펠릿의 표준 식단과 함께 매일 물고기를 먹이. 펠릿 개별 질량 낮은 분산 (3.53 ± 0.42 mg을 각각 8 %의 변동) resultin 있기 때문에 펠렛 플레이크 대신 사용했다음식의 비슷한 금액을받는 물고기 g. 시각적으로 먹지 알약을 기록하여 소비를 모니터링합니다. 소비 비율은 80 % 이상 일반적이었다. </li><li> 사주 위에 각각 주말에, 생선의 무게를 결정한다. 신선한 APW와 함께 새로운 컵을 준비 균형에 배치 한 다음 무게를 기록한다. 그런 다음, 원래 컵에서 딥 그물로 물고기를 부어 다시 칭량 새로운 컵으로 전송합니다. 물고기는 스트레스를 방지하기 위해 처리되지 않습니다. </li><li> 그룹의 경우, 19 L 양동이에 APW의 2 L를 배치하고 규모를 용기를. 다음 전체 그룹의 체중을 기록 새로운 APW 버킷로 전송할 때 두 군 모두에서 함께 물고기를 유지합니다. 기록 물고기 그룹의 무게 새로운 버킷에 전송하여 한 달의 시간 범위에 걸쳐 매주. </li></ol> 9. 굿 환승 시간 <ol><li> 형광 표지 된 70 kDa의 음이온 덱스 트란을 사용합니다. 덱스 트란 분해 크게하고 장내 층에 걸쳐 흡수하기에 너무 큰 것은 아니며, 따라서, 통로는 소화관을 통해 통과 시간을 측정한다.레이블이 덱스 트란은 물고기 음식에 통합되었다. </li><li> 멸균 된 1.7 ㎖의 튜브에 멸균 증류수 360 μL 젤라틴 52 밀리그램 (13 % 용액)을 첨가하고 배치 튜브를 60 ° C 열 블록 젤라틴하고, 녹을 때까지 완전히 용해시킨다. <ol><li> 박격포와 유 봉 및 생선 기름의 20 μL와 함께 관이 분말 40 mg의 추가를 사용하여 미세 분말로 분쇄 금붕어 음식 부스러기. 혼합 한 후, FITC - 덱스 트란의 1.6 mg을 추가합니다. </li></ol></li><li> μL 실험실 벤치에 파라 필름에 방울 (20)에 뜨거운 액체 혼합물을 분배하고,이를 신속하게 시원하고 공고히 할 수 있습니다. 그들은 너무 열심히 물고기를 먹을 수되기 전에 상품은 최대 4 일 동안 저장 될 수있다. 스토어는 가습 방울을 유지하는 밀봉 된 플라스틱 용기 내부에 멸균 물에 부유 배양 접시의 반 상 파라 필름을 배치하여 냉장고에 삭제합니다. </li><li> 그냥 공급하기 전에, 분기 면도날을 사용하여 섹션으로 떨어진다. Styro에 물고기를 적응공급없이 개별적으로 2 일간 거품 컵 (참고 : 노출되지 않은 제어 물고기가 사용되었다). 물고기와 컵에 음식의 사방을 배치하고 각 먹는 음식의 얼마나 많은 조각이 30 분 동안 물고기를 관찰합니다. </li><li> 모니터링 기간을 시작 딥 그물을 사용하여 APW의 80 mL의 컵에 개별적으로 물고기를 전송합니다. 모든 2 시간은 부드럽게 손으로 APW 소용돌이, 다음 4 ° C에서 레이블 1.7 ML의 튜브에 1 mL의 샘플 및 저장을. 36 시간 동안 샘플을 가져 가라. </li><li> 분석 종료 후 동시에 모든 샘플의 형광 분광 광도계로 기록 형광. 큐벳으로 전체 1 ML의 샘플을 배치하고 520 nm에서 495 nm에서 여기 및 방출을 사용하여 측정 된 형광을 기록한다. </li></ol>

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일부 문제는 약물이 물고기 조직에서 고갈 될 항생제 치료 후 깨끗한 APW의 휴식 기간이 필요합니다. 나머지 기간은 스킵 경우 항생제 존재는 분석이 세균에 대한 노출을 수반 특히 결과를 혼동 할 수있다. 것 항생제 노광시 호스트 예비 실험 모니터링 마이크로 바이 조성물 (16S 프로파일 또는 총 유전체) 인구 밀도 (qPCR을 통해 16S 정량)의 미생물의 수의 큰 변화없이 변경된 마이크로 바이 조성물의 효과를 조사하기 위해서 이 필요합니다. 3 일이 시스템에서 최적이지만, 호스트를 변경 및 / 또는 항생제가 재 보정을 요구한다. 생물 의학 연구의 전형적인 마우스 모델은 일반적으로 마이크로 바이 연구에 사용된다. 가장 일반적인 물고기 모델 제브라이다. 위해 점막 microb의 구조와 기능의 보편적 인 특성의 더 나은 이해를 얻기 위해iomes 및 호스트 상호 작용, 새로운 비정형 모델이 필요하다. 우리 WT 물고기 모델로 인해 실험실 제기 동물 근친 교배 <sup class=...

이 항생제는 미생물 지역 사회의 불균형을 의미 dysbiosis로 이어지는 인간 마이크로 바이 옴을 방해 할 수 설립되었습니다. 항생제 치료 후 미생물의 조성 변화, 특히 장 1, 2, 지역 사회의 다양성을 낮출 키 회원을 줄이고, 지역 사회의 신진 대사를 변경하는 것으로 나타났다. 장내 마이크로 바이 옴의 항생제 방해는 클로스 트리 디움 디피 3, 4, 살모넬라 5 식민지 저항을 줄일 수 있습니다. 또한, 미생물의 파괴는 많은 신드롬 및 인간 질환의 발전에 연결되어있다 (예를 들면, 항생제 관련 장염, 염증성 장 질환, 대사 질환, 등.). 항생제가 널리 성장 촉진제로 농업 구현가축 및 가금류 생산 6. 이러한 강력한 도구의 사용은 항생제 내성의 급속한 상승뿐만 아니라 마이크로 바이 교란의 효과는 명백하다 거주 된 호스트 갖는 부수적 효과가없는 것은 아니다. 많은 연구가 광범위 항생제 사용이 장시간 동안 지속 미생물의 구조와 기능에 영향 아직 항생제 파괴 마이크로 바이 영향 호스트 생리학에서 부작용되어지지되도록 아직만을 추측이 있는지 보여준다. 호스트, 미생물, 항생제 사이의 상호 작용은 간결한 방식으로 이해되는 거리가 멀다. 따라서, 간단하고 더 다루기 쉬운 모델은 복잡한 포유류 시스템에서 빛을 발산하는 것이 유리하다. 장내 포함한 인체 점막 표면은 또한 높은 밀도 및 미생물의 다양성, 및 가장 친밀한 미생물 숙주 상호 항구. 물고기 이벤트 (S)의 점막 피부 마이크로 바이 옴모델 시스템으로 everal 장점. 진골 어류 (뼈 물고기) 경골 어류는 모두 타고난를 가지고 공생 세균 지역 사회 (7)과의 관계를 공동 진화 면역 체계를 인수하는 척추 동물의 의미 내에서 분기 할 수있는 최초의 계보 중 하나입니다. 물고기 피부 공유 등의 생리 기능, 면역 구성 요소 및 점액 생산 세포 (8)의 배치와 같은 포유 동물의 종류 1 점막 표면, 많은 특징. 물고기 피부 점막 표면의 외부 위치는 실험적으로 조작하기 쉽고 샘플 마이크로 바이 옴을 제공합니다. 서부 mosquitofish, Gambusia의 affinis입니다 (G. affinis입니다)를 결합 및 독성 9, 10, 11을 공부 과거에 사용 된 모델 물고기입니다. 침입 종으로 야생에서 작은 크기, 인구 풍부을 감안할 때, m<html> inimal 관리 비용, 성의 자연, 우리는 점막 마이크로 바이 옴 모델로 G. affinis입니다을 개발했다. 또한, Gambusia 물고기 종의 드문 태생 포유류, 젊은 살고 출산의 생리를 공유 할 수 있습니다. 우리는 Gambusia 12 프로파일 16S를 사용하여 물고기 피부에 정상 미생물의 시점에서 가장 광범위한 연구를 완료했다. 또한 작품은 피부와 장내 미생물의 중단 넓은 스펙트럼 (13) 항생제를 사용하여 다음 호스트에 세 가지 부정적인 영향을 보여 주었다. 다섯 가지 효과는 항생제에 노출 된 후 물고기에 조사 하였다. 마이크로 바이 옴의 가장 잘 설립 된 호스트의 이점은 병원균의 경쟁 제외입니다. 물고기 병원균 인 Edwardsiella의 ictaluri는 상업적인 메기 양식장 14 장 패혈증의 발생을 일으키는 것으로 알려져있다. E. ictaluri은 제브라 치명적 감염을 보였다클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 15, 16, Gambusia 17. 물 열에서이 병원체가있는 문제는 배제의 기준 역할을 할 수 있습니다. 개별 병원체에 대한 감수성에 비교 된 바와 같이, 혼합 된 미생물의 고밀도에 노출시 생존도 행했다. 대변 ​​및 유기 풍부한 토양 미생물 사회의 일반적 발생 소스로 사용 하였다. 장내 세균 커뮤니티가 수행하는 또 다른 역할은 확립 따라서 호스트에 대한 전체적인 영양 섭취에 영향을 양분 처리 에너지 수확이다. 영양의 총 측정으로, 물고기 체중은 표준 식단을 공급되는 한 달 전, 후 비교 하였다. 평균적으로 제어 물고기는 달 체중이 증가하면서 평균 체중 감량으로 물고기를 항생제 처리. 체중 증가의 결여의 메카니즘은 불분명하다. 한 가지 요인은 창자에서 음식의 통과 시간입니다. GI의 모티lity 방법은 전송 시간을 결정하는 제브라 피쉬 (아담 리치, SUNY 브록 포트, 개인 통신)에서 적응했다. 항생제 처리 물고기가 변경된 통과 시간이있는 경우는 아직 결정되지 않았습니다. 모든 생물체, 특히 어류에 의해 자연 환경에서 경험하는 일반적인 문제는 삼투압 스트레스입니다. Gambusia은 급성 염분 (18)의 높은 농도로 강조 할 때 신속하게 적응하는 것으로 나타났다. 놀랍게도, 전시 항생제 변경 마이크로 바이 옴 물고기는 높은 소금 스트레스 생존을 낮췄다. 이 소설 표현형에 대한 메커니즘을 조사 중입니다. 특히 수조 수생 동물에 다른 일반적인 스트레스 독성 형태 질소 (암모니아, 질산염, 아질산염)이다. 질산에 대한 생존 항생제 처리 및 제어 물고기 사이에 유의 한 차이가 있었다. 이 논문에서 제시 한 방법은 이러한 제브라 같은 Gambusia 또는 유사한 물고기 모델 유기체로 사용될 수있다물고기와 송사리는 실험 조작 다음과 물고기의 표현형을 측정합니다.

<table><tbody><tr><td>리팜피신</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>질산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 표지 70kDa 음이온 덱스트란</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 정제</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>정제는 물에 용해되어 PBS를 만듭니다.</td></tr></tbody></table>

호스트 표현형의 시험에<em&gt; gambusia의 affinis입니다</em&gt; 다음은 항생제 치료

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

의학에서 항생제 사용의 공통성은 숙주에 대한 결과의 결과를 이해하는 것이 중요하다는 것을 의미합니다. 항생제는 종종 숙주 마이크로바이옴 군집 다양성을 감소시키고 미생물 군집 구성을 변경합니다. 항생제 관련 장염, 염증성 장 질환 및 대사 장애와 같은 많은 질병은 교란된 미생물군과 관련이 있습니다. 숙주, 마이크로바이옴 및 항생제 간의 복잡한 상호 작용은 숙주-마이크로바이옴 상호 작용을 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델이 필요합니다. 민물 척추 동물은 점막 마이크로바이옴 구조 및 기능의 보편적인 측면을 조사하고 미생물 군집의 변화로 인한 결과적인 숙주 효과를 분석하는 데 유용한 모델 역할을 합니다. 방법에는 알려진 어류 병원체에 의한 감염, 분변 또는 토양 미생물에 대한 노출, 삼투압 스트레스, 질산염 독성, 성장 분석 및 장 운동성 측정과 같은 숙주 문제가 포함됩니다. 이러한 기술은 숙주 표현형을 신속하게 측정할 수 있는 유연하고 유용한 모델 시스템을 보여줍니다.

항생제 노출 13 생선 호스트 효과를 연구하기 위해 사용 된 실험 시스템의 전체 개략도는도 1a에 나타낸 물고기으로부터 피부 (도 1b) 및 장 (도 1C) microbiomes를 추출하기위한 기술을 포함한다. 이전 데이터는 전체 피부 배양 수는 초기 치료에 drops 동안, 그것은 3 일 후 수준으로 처리 사전에 반환 된 것을 알 수 있기 때문에 사흘은 노출의 항생제 기간으로 선정되었다. 한편 커뮤니티 조성물 16S 프로파일에 의해 결정되는, 강하게 변경되었다. 따라서, 3 일 동안은 거의 동일한 밀도 변경 커뮤니티의 효과를 분석하기위한 최적이어야한다. 다수 종을 남길 수 있으며, 아가 플레이트에서 콜로니 수를 이용하여, 그 배양 분석을 참고. 피부 마이크로 바이 분산 방법의 효율 (도 1b </st10 ...

이 연구는 항생제에 의해 피부와 장내 마이크로 바이 옴의 사회 구성의 변경 다음 모델 물고기 호스트에 효과를 나타 내기 위해 방법을 포함한다.

호스트 표현형의 시험에<em&gt; Gambusia의 affinis입니다</em&gt; 다음은 항생제 치료

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

이 실험 시스템의 전반적인 목표는 항생제 치료 후 숙주 생물체에 나타나는 부정적인 부작용을 조사하는 것입니다. 따라서 이 방법은 파괴된 마이크로바이옴에 의해 매개되는 숙주 건강에 대한 항생제 관련 부작용과 같이 마이크로바이옴 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 시스템이 척추동물 숙주의 생리학적 표현형을 조사하는 데 있어 간단하고 비용 효율적이며, 점막 마이크로바이옴에 대한 비침습적인 파괴가 가능하다는 점입니다.이 기술의 시사점은 동물의 마이크로바이옴 교란이 어떻게 주요 부작용으로 이어질 수 있는지를 특징짓습니다. 먼저, 이전에 확보하여 냉동 보관한 Edwardsiella ictaluri 감염 균주를 E.Ictaluri 선택 및 감별 배지 한천에 스트리킹합니다. 배양물을 27 °C에서 2일 동안 배양합니다.배양액에서 순수하게 분리된 콜로니를 전이하여 40 milliliters의 영양 배지가 담긴 150 milliliter 플라스크에 접종합니다. 플라스크를 27 degrees Celsius, 150 RPM 조건의 진탕 배양기에 넣고 이틀 동안 배양합니다. 배양 후, 원하는 감염 용량으로 E.Ictaluri 배양액을 보정하기 위해, PBST를 사용하여 배양액 샘플을 OD 650 기준 0.2가 되도록 희석합니다.Gambusia affinis를 채집하고 수중에 rifampicin을 처리하여 3일간 유지한 후, 항생제 처리군과 미처리 대조군 물고기 모두를 130 milliliters의 신선한 인공 연못물(APW)이 담긴 개별 플라스틱 컵으로 옮겨 약 10시간 동안 물고기 조직 내 약물이 제거되도록 합니다. 그 다음, 물고기를 다시 130 milliliters의 깨끗한 APW가 담긴 8온스 개별 플라스틱 컵에 분리합니다. 각 물고기에 치명적인 양의 E.Ictaluri 배양액을 투여하고 27 degrees Celsius에서 24시간 동안 배양합니다.E. ictaluri 목욕 처리 후, 각 물고기를 130밀리리터의 APW가 담긴 새 컵으로 옮긴다. 물고기에게 먹이를 주지 않은 상태에서 일주일 동안 폐사율을 기록한다. 수집된 분변을 멸균 플라스틱 백에 모은 후 멸균 15밀리리터 원심분리관으로 옮긴다. 그 다음 PBST를 사용하여 분변의 스톡 농도를 500~800밀리그램/밀리리터로 조제한다. 이때 팁 끝을 잘라낸 1밀리리터 이상의 플라스틱 피펫을 사용하며, APW에 분변을 15밀리그램/밀리리터 또는 10밀리그램/밀리리터 농도로 하여 컵당 130밀리리터를 준비한다.항생제 처리 여부에 따른 물고기를 용액이 담긴 개별 컵으로 옮긴 후, 25 °C에서 2일 동안 배양하며 이 기간 동안의 폐사율을 면밀히 관찰하고 기록합니다. 토양으로 물고기를 처리하려면, 깊이 약 7~15 cm의 유기물이 풍부한 표토 1~2 kg을 수집하여 깨끗한 플라스틱 용기에 옮깁니다. 18.2 g의 토양과 130 mL의 APW가 포함된 개별 플라스틱 컵을 준비하고 토양을 손으로 잘 섞은 다음, 항생제 처리 여부에 따른 물고기를 컵에 옮겨 25 °C에서 3일 동안 유지하며 폐사 여부를 기록합니다.항생제 처리 후 APW에서 10시간 동안 휴지기를 거친 뒤, 물고기를 17.5 mg/mL의 염화나트륨과 APW가 포함된 개별 컵으로 옮기고 36시간 동안 폐사 여부를 관찰합니다. 질산염 독성 챌린지를 수행하기 위해, 이전과 마찬가지로 10시간의 휴지기를 거친 후, 물고기를 10 또는 17.5 mg/mL의 질산나트륨과 130 mL의 APW가 포함된 개별 컵으로 분리합니다. 고농도 질산나트륨 투여군의 경우 하루 동안, 저농도 투여군의 경우 4일 동안 물고기의 폐사 여부를 관찰합니다. 그룹별로 3일간의 항생제 또는 대조군 노출을 완료한 후, 개별 물고기를 위해 8온스 스티로폼 컵에 150 mL의 APW를 채우고, 채워진 컵의 무게를 측정한 뒤 물고기를 컵으로 옮겨 초기 평가를 위한 전체 체중을 기록합니다.물고기 한 마리당 사료 2알씩 매일 급여하고, 먹지 않은 사료 알갱이를 시각적으로 기록하여 섭취량을 모니터링합니다. 4주 동안 매주 말에 물고기의 무게를 측정하는데, 먼저 신선한 APW가 담긴 컵의 무게를 측정하여 기록한 후, 뜰채로 물고기를 건져 새 컵으로 옮기고 다시 컵의 무게를 측정합니다. 물고기 그룹의 경우, 컵에 150 milliliters의 APW를 넣고 저울의 영점을 조절합니다.물고기를 새로운 APW 용기로 옮길 때 두 그룹 모두 물고기들을 함께 유지한 다음, 그룹의 총 무게를 기록하십시오. 한 달 동안 매주 마지막에 무게 측정을 반복하십시오. 장 통과 시간을 분석하려면, 멸균 탈이온수 360 µL와 젤라틴 52 mg을 멸균된 1.7 mL 튜브에 넣고, 젤라틴이 녹아 완전히 용해될 때까지 60 °C 가열 블록 위에 두십시오.막자와 막자를 사용하여 금붕어 사료 플레이크를 고운 가루로 갈아낸 후, 가루 40 milligrams와 피시 오일 20 microliters를 튜브에 넣습니다. 혼합 후, FitC dextran 1.6 milligrams를 추가합니다. 뜨거운 액체를 실험대 위 파라필름에 20 microliter씩 떨어뜨린 다음, 빠르게 식혀 응고시킵니다.파라필름을 페트리 접시의 절반에 배치하고, 밀폐된 플라스틱 용기 안의 멸균수 위에 띄웁니다. 응고된 방울들은 물고기가 먹기에 너무 단단해지기 전까지 최대 4일 동안 냉장 보관하십시오. 급여 직전에 면도날을 사용하여 방울을 4등분으로 자릅니다.물고기를 개별 스티로폼 컵에 넣어 먹이 공급 없이 이틀 동안 적응시킨 후, 먹이의 4분의 1 분량을 물고기 컵에 넣고 30분 동안 각 물고기가 먹이 몇 조각을 먹는지 관찰합니다. 모니터링을 시작하려면 개별 물고기를 80 milliliters의 APW가 담긴 컵으로 옮기고, 2시간마다 1 milliliter의 샘플을 채취합니다. 채취한 샘플은 라벨이 부착된 1.7 milliliter 튜브에 넣어 4 degrees Celsius에서 보관합니다.분석이 완료되면, 1 mL의 샘플 전체를 큐벳에 넣고 형광 분광 광도계를 사용하여 모든 샘플의 형광을 들뜸 파장 495 nm, 방출 파장 520 nm에서 동시에 기록합니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 항생제로 마이크로바이옴이 변경된 물고기는 대조군 물고기보다 E.Ictaluri 감염에 더 취약했습니다. 처리군과 대조군 물고기 간의 평균 사망 시간 차이는 유의미하지 않았습니다.이는 아마도 표본 집단의 크기가 작기 때문일 가능성이 큽니다. 이 그래프는 rifampicin에 노출된 물고기가 대조군 물고기에 비해 삼투압 스트레스에 더 취약했음을 보여주며, 본 분석에서 18 mg/mL 이상의 염분 농도는 물고기의 급격한 폐사를 초래했습니다. 이 표에서 알 수 있듯이, 수중에 독성 물질인 nitrate에 노출되었을 때, 항생제 처리를 통한 사전 노출은 생존율에 영향을 미치지 않았습니다.10 mg/mL 농도에서, 항생제 처리군과 대조군 모두 90시간째에 50%의 치사율이 관찰되었습니다. 수조 내 대조군 물고기를 이용한 이 실험에서는, 주변 수중의 형광을 시간에 따라 측정하여 먹이 이동 시간을 조사하기 위해 FitC dextran으로 표지된 먹이를 두 섹션 또는 한 섹션 급여하였습니다. 이 절차 이후에, 기전을 이해하고 숙주에 부정적인 영향을 줄 수 있는 혼란 변수를 좁히기 위해 총 체지방 저장량 측정 및 피부 점액 생성 정량화와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

출처: Le, T. A. N . 외, 박테리아 및 화학물질이 카 에노르하브디티스 엘레간스의 장 투과성에 미치는 영향 측정. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 Pseudomonas aeruginosa에 노출된 C. elegans의 장 투과성을 정량화하기 위한 형광 기반 분석 방식을 보여줍니다. 대장균을 먹인 대조군과 비교하면, 병원체 처리된 벌레는 체강으로의 형광체 누출이 증가하여 상피 장벽 손상을 나타냅니다.

세균 노출 후 C. elegans 의 장 투과성 평가

계란에서 웜 (EIW) 분석은 달걀 누워 행동을 정량화 할 수있는 유용한 방법입니다. 달걀 부설의 변화는 모델 유기체의 행동 반응 할 수...

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

광학적으로 투명한 제브라피시 배아는 병원성 미생물과 선천성 면역 세포 간의 상호 작용을 실시간으로 연구하고 시각화하는 데 널리 사용됩니다. 형광 이미징과 결합된 Mycobacterium abscessus의 미세 주입은 제브라피시 배아의 탯줄 형성과 같은 필수 병원성 특징을 면밀히 조사하는 데 사용됩니다.

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.

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인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

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Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

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호스트 병원체 상호 작용의 분석을 위한 아스퍼질러스 포자를 가진 얼룩말 물고기 애벌레의 감염

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현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

학습하세요 항생제 처리 후 미생물군 변화가 Gambusia affinis의 생리적 표현형에 미치는 영향을 분석하는 비침습적 방법을 통해. 이 기술은 저렴하고 간단하며 동물 건강에 대한 미생물군 연구에 활용됩니다.

호스트 표현형의 시험에

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