Summary
травмы печени сопровождаются расширением клеток-предшественников, что представляет собой гетерогенную популяцию клеток. Новые классификация этого клеточный компартмент позволяет различении нескольких подмножеств. Описанный здесь метод иллюстрирует поток цитометрии и высокой чистоты изоляции различных подмножеств, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа.
Abstract
Во время хронических повреждений печени, клетки-предшественники расширяться в процессе, называемом протоками, реакция, которая также влечет за собой возникновение воспалительного клеточного инфильтрата и активации эпителиальных клеток. Популяция клеток-предшественников во время таких воспалительных реакций в основном были исследованы с использованием одиночных поверхностных маркеров, либо с помощью гистологического анализа или с помощью проточной цитометрии методов на основе. Тем не менее, новые поверхностные маркеры идентифицировали различные функционально различных подмножеств в пределах прародителя клеток печени отделение / стволовых. Изложенный здесь метод описывает выделение и детальный анализ проточной цитометрии подмножеств предшественников с использованием комбинаций маркеров романа поверхности. Кроме того, он показывает, как различные прогениторных клеток подмножества могут быть выделены с помощью методов высокой чистоты с использованием автоматизированной магнитной и FACS сортировки на основе. Важно отметить, что новые и упрощенную ферментативная диссоциация печени позволяет изоляции этих популяций редких клеток с высокой жизнеспособностьючто превосходит по сравнению с другими существующими методами. Это особенно актуально для дальнейшего изучения клеток - предшественников в пробирке или для изоляции высокого качества РНК для анализа профиля экспрессии генов.
Introduction
регенерации печени чаще всего ассоциируется с самообновлению мощностью гепатоцитов. Тем не менее, хронические повреждения печени возникают при активации клеток - предшественников и расширения, которые были связаны с их способностью дифференцироваться в гепатоциты и холангиоцитах 1, 2, 3, 4. Это особенно актуально, так как, во время хронических травм, пролиферации гепатоцитов не является эффективным. Несмотря на многочисленные исследования генетической трассировки , ориентированных на клетки - предшественники, их роль в регенерации печени остается спорным 5, 6, 7, 8. Кроме того, активация клеток - предшественников , было связано с увеличением фиброзной реакции в печени, что вызывает вопросы об их точной роли во время травмы 9, 10.
Гетерогенный характер клеток - предшественников купе уже давно было предложено экспрессии генов исследований, изолированных клеток - предшественников , выражающие одну поверхностный маркер с помощью микродиссекции или клетки методов сортировки на основе 1, 11. Действительно, в последнее время , новая комбинация маркер поверхности с помощью gp38 (podoplanin) однозначно связаны предыдущие одиночные маркеры клеток - предшественников различных подмножеств 12. Важно отметить, что эти подмножества не только отличались по экспрессии поверхностных маркеров , но также демонстрируют функциональные изменения во время травм 12.
Несколько моделей на животных были использованы для исследования активации клеток-предшественников и регенерации печени. Кажется , что различные виды травм способствуют активации отличаясь подмножеств клеток - предшественников 12. Это могло бы объяснить фотenotypic дивергенция протоками реакции , наблюдаемой у человека 4. Таким образом, сложные фенотипические и функциональный анализ клеток-предшественников являются ключевыми для понимания их роли в травмах и истинное значение протоками реакции при заболеваниях печени.
Кроме комбинаций поверхностных маркеров, решающие различия в протоколах выделения клеток еще больше осложнить выводы , основанные на предыдущих исследованиях 2. Значительное количество исследований было посвящено роли клеток - предшественников , которые значительно различаются по их протоколу изоляции (например, диссоциации печени (комбинацией ферментов и длительность процесса), средней плотности и скорости центрифугирования) 2. Оптимизированный метод выделения, обеспечивая лучшую жизнеспособность популяций редких клеток и отражает подмножество состава, была разработана и опубликована недавно 12. Цель данной статьи состоит в том, чтобы обеспечить более йеболело протокол этой процедуры выделения клеток печени и анализа подмножества для обеспечения надлежащего воспроизведения техники. Кроме того, протокол включает в себя сравнение с предыдущим методом изоляции, чтобы продемонстрировать различия по сравнению с новым протоколом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены с одобрения комитетов по этике и по уходу за животными в Хомбург University Medical Center.
1. Подготовка материалов и буферами
- Свеже подготовить все буферы, необходимые для переваривания печени с использованием стерильных компонентов и ламинарный капюшон, чтобы избежать бактериального загрязнения.
- Приготовьте сбор буфера (CB) путем смешивания 49,5 мл RPMI среды и 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS; низкая эндотоксин, инактивированной нагреванием) для достижения раствора 1% (об / об). Хранить раствор на льду до дальнейшего использования.
Примечание: Приблизительно 25 мл CB необходимо переварить одну целую печень. - Готовят переваривании буфера (DB) с использованием следующих ингредиентов: RPMI среду, 1% (об / об) FBS (низкий эндотоксин, инактивированной нагреванием), коллагеназы P (0,2 мг / мл), ДНКазы I (0,1 мг / мл) и диспаза (0,8 мг / мл).
Примечание: Примерно 25 мл БД необходимо усвоить одну целую печень. Предварительно нагрейте DB в тон 37 ° C на водяной бане перед использованием. - Развести ферменты по прибытии в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS; collagense P и диспаза) или в ДНКазы I - буфера (50% (об / об) глицерина, 1 мМ MgCl 2, и 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5) , аликвоту его и хранить его при температуре -20 ° C. Хранить ДНКазы I буфер при температуре 4 ° С и использовать его в течение двух месяцев.
2. Подготовка печени одноклеточные Подвеска
- Эвтаназии необработанных мышей дикого типа путем цервикальной дислокации в соответствии с местными комитетов по этике и по уходу за животными.
- Поместите мышей на рассечение борту и влажный мех с 70% этанола. С помощью ножниц, откройте живот с срединный разрез кожи, а затем с помощью Y-разрез в направлении конечностей. Откройте брюшины до грудины с помощью ножниц. Для того, чтобы раскрыть печень, вытесняют кишечник мягко с правой стороны с помощью ватного тампона.
- С помощью ножниц и щипцов, удалить мочки печени,оставляя позади желчного пузыря, а также во избежание загрязнения соединительной тканью. Взвесьте печень и поместить его на льду в чашке Петри, содержащей HBSS.
- Поместите печень на мочки сухой чашке Петри и разрезают ткани печени на однородные кубики размером примерно 2 мм полутуши с помощью скальпеля. Передача части в 15-мл коническую центрифужную пробирку.
- Добавить 2,5 мл БД в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую кусочки печени и поместить его в водяной бане при 37 ° C, чтобы начать процесс пищеварения (здоровая печень занимает 60-70 мин и цирроза печени занимает 80-90 мин ).
Примечание: Если одна целая печень переваривается, печень должна быть разделена на две 15-мл коническую центрифужные пробирки, чтобы обеспечить хорошую жизнеспособность клеток. - Подготовьте новый 15-мл коническую центрифужную пробирку для сбора высвобожденные клетки печени. Поместите полиамид 100 мкм сетчатый фильтр на верхней части трубки и смачивать сетку с 800 мкл СВ. Поместите коническую центрифужную пробирку на льду.
- Смешайте СэмуПлес в водяной бане 37 ° C после 5 и 10 мин для того, чтобы поддержать процесс пищеварения путем встряхивания 15 мл коническую центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени.
- Через 15 мин после начала переваривания, осторожно перемешать кусочки печени с помощью пипетки 1000 мкл, с наконечником, который позволяет вырезать кусочки печени пройти легко. Поместите трубки обратно в ванну с водой и позволяют куски урегулировать в течение 2 мин.
- Удалить супернатант, содержащий распространяемой клетки (как правило, 2x 700 мкл) и добавить его к трубе, полученного на стадии 2.6. Заменить удаленный супернатанта с БД (2x 700 мкл) и поместить его обратно в водяную баню на 37 ° C.
- Повторите процедуру, описанную в пункте 2.8 (как правило, на 30, 40, 50, 55 и 60 мин) до примерно 60-70 мин прошло с момента начала пищеварения. С 40 мин и далее, остальные кусочки печени должны быть достаточно малы, чтобы пройти через неподрезанные 1000 мкл кончика пипетки.
Примечание: Здоровая печень DigeSTED полностью в течение 60-70 мин, в то время как фиброзная печени обычно требуется 80-90 мин. К этому моменту времени, ткани печени, не должна быть видна в коническую 15-мл центрифужную пробирку, содержащую кусочки печени, и все высвобожденные клетки должны быть переданы в трубку, полученного на стадии 2.6. - В конце процесса пищеварения, сбора клеток и их центрифугировать в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл-аммоний хлорид-калия (ACK) буфера для лизиса и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать красные кровяные клетки. Остановить реакцию добавлением 5 мл CB, а затем центрифугировать клетки в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют клеток в 4 мл СВ и хранить их на льду. Граф клеток, как описано в шаге 3.
Примечание: Клеточный осадок рыхлый, и, следовательно, супернатант пипеткой прочь вместо того, чтобы быть декантируют.3. Определение клеточного графа с использованием проточной цитометрии
Примечание: Для определения количества клеток, автоматизированный счетчик клеток или, в идеале, поток клеток Количественное цитометрии на основе описанной ниже предлагается вместо классического метода Нойбауэра камеры на основе. Подвеска печени одноклеточного описано в шаге 2 содержит паренхимы и не паренхимных клеток (NPC) с сильно различающимися размерами и гранулярности. Надлежащее исключение клеточных остатков вместе с литниковой-на рассеяния вперед, боковое рассеивание (FSC-SSC) характеристики РНУ при использовании проточной цитометрии обеспечивает успех описанного протокола 12.
- Готовят аликвоту клеток печени суспензии (20 мкл) и добавляют 174 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и 6 мкл пропидиума йода (PI; конечная концентрация 0,375 мкг / мл). Добавить подсчета шарики, которые позволяют для количественной оценки клеток.
- Ворота на SSC-A-FSC-A, чтобы избежать мусора и далее исключить дублеты с использованием FSC-H и FCS-A.
Примечание: Важно следовать стратегии стробирования , изображенную на рисунке 2. - Ворота из PI-положительные мертвые клетки, измеряют 30 мкл из ваших образцов, а также записывать события. Следуйте руководство изготовителя для расчета количества клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4 по проточной цитометрии измерения, шаги 5 и 6 для изоляции на основе магнитных клеток-предшественников, а также шаги 7 для проточной цитометрии рода субпопуляции клеток-предшественников.
4. Окрашивание одноклеточные подвески печени для FoW цитометрии анализа прародителя подмножествах
антитело клон Host / Изотип Фото Концентрация [мг / мл] разбавление CD64 X54-5 / 7.1 Мышь IgG1, κ 0,5 1: 100 CD16 / 32 93 Крыса IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD45 30-F11 Крыса IgG2b, κ 0,2 1: 200 CD31 MEC13.3 Крыса IgG2a, κ 0,5 1: 200 ASGPR1 Поликлональные Коза IgG 0,2 1: 100 Podoplanin 1/8/2001 Сирийский хомяк IgG 0,2 1: 1 400 Podoplanin 1/8/2001 Сирийский хомяк IgG 0,5 1: 1 400 CD133 Mb9-3G8 Крыса IgG1 0.03 3 мкл CD133 315-2C11 Крыса IgG2a, λ 0,5 1: 100 CD34 RAM34 Крыса IgG2a, κ 0,5 1: 100 CD90.2 53-2,1 Крыса IgG2, κ 0,5 1: 800 CD157 BP-3 Мышь IgG2b, κ 0,2 1: 600 EpCAM G8.8 Крыса IgG2a, κ 0,2 1: 100 Sca-1 D7 Крыса IgG2a, κ 0.03 10 мкл Мышь IgG2b, κ MPC-11 0,2 Крыса IgG1 RTK2071 0,2 Крыса IgG2b, κ RTK4530 0,2 Крыса IgG2a, κ RTK2758 0,5 Крыса IgG2a, κ RTK2758 0,2 Сирийский хомяк IgG SHG-1 0,2 Сирийский хомяк IgG SHG-1 0,5 Нормальный контроль Коза IgG Поликлональные Коза IgG 1 Осел анти-IgG Коза Осел IgG 2 1: 800 стрептавидином 1 1: 400 Таблица 1.
антитело 1 2 3 4 5 CD45 APC / Cy7 Крыса IgG2b, κ
0,5 мкл+ + + + CD31 Биотин + Крыса IgG2a, κ
0,5 мкл+ + + ASGPR1 очищают + + Нормальный контроль Коза IgG
0,2 мкл+ + Podoplanin APC + + + Сирийский хомяк IgG
1 мкл 1:14 Разбавление+ CD133 PE + + </ TD> + + Крыса IgG1
0,45 мклОсел анти-Коза
Alexa Fluor 488+ + + + + стрептавидином
Alexa Fluor 405+ + + + + Таблица 2.
- Поместите аликвоты клеточной суспензии с шага 2,11 в реакционную трубку (1,5 мл) , содержащей 2,5 × 10 5 клеток, определяют , как описано в шаге 3.
- Центрифуга клетки в течение 3 мин при 300 х г и 4 ° С с использованием микроцентрифуге.
Примечание: На этом этапе вакуумный насос может быть использован, чтобы тщательно удалить супернатант. - Ресуспендируют осадок клеток в Fc-блоке смеси и инкубировать ее в течение 5 минут на льду. Подготовьте Fc-блок смесь с общим объемом 50 мкл на пятно. Добавьте 10 мкл FcR-блокирующего реагента, 1 мкл очищенного анти-CD64 (1: 100; 0,5 мкг / пятно), и 40 мкл окрашивающего буфера (ST буфер: HBSS, 1% (об / об) FBS, и 0,01% азид натрия) на пятно.
Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица. - Добавить 50 мкл окрашивания смеси с клетками (общий объем клеток в настоящее время 100 мкл) и инкубируют клетки со смесью антител, защищенном от света и в течение 20 мин на льду.
- Готовят смесь антител с общим объемом 50 мкл на пятно. Для 50 мкл ST буфера, добавьте следующие конъюгированные антитела для основного окрашивания: CD45 (0,5 мкл; 1: 200; 0,1 мкг / пятно), CD31 (0,5 мкл; 1: 200; 0,25 мкг / пятно), ASGPR1 (1 мкл ; 1: 100; 0,2 мкг / пятно), podoplanin (1 мкл 1:14 разведения; 1: 1 400 конечного разведения; 0,014 мкг / пятно) и CD133 (3 мкл; 0,09 мкг / пятно).
Примечание: Таблица1 приведены антитела клонов и разведения использованы для основных пятен и дополнительных поверхностных маркеров различных подмножеств. Подготовьте дополнительные клеточные суспензии для смеси антител , содержащего соответствующие элементы управления изотипа и / или флуоресценции минус один контроль (лесозаготовительных предприятий), как показано в таблице 2. - Добавить 400 мкл буфера для ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° C.Discard супернатант и клетки вновь суспендируют в 100 мкл вторичного антитела смеси, содержащей 0,125 мкл осла против IgG козьего (1: 800; 0,25 мкг / краситель) и 0,25 мкл флуоресцентного-конъюгированный стрептавидин (1: 400; 0,25 мкг / пятно) в 100 мкл буфера для ST.
- Инкубируйте клетки в то время как в защищенном от света и со смесью антител в течение 20 мин на льду. Добавить 400 мкл буфера ST для каждого образца и центрифугировать клетки в течение 4 мин при 300 х г и 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл ST нагишомэр, содержащий 0,25 мкг / мл PI.
ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособность клеток из клеток-предшественников уменьшается со временем; Поэтому, предлагается измерить свежие образцы как можно скорее.
5. Магнитный Microbead на основе Обогащение клеток-предшественников
- Передача аликвоты печени одной клеточной суспензии , содержащей 1,5-2 × 10 6 клеток, на основе подсчета клеток определяли , как описано в шаге 3, в новый 15-мл коническую центрифужную пробирку.
- Центрифуга клеток в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
Примечание: Как правило, один здоровый C57BL / 6 мышей печени (или 1 г ткани печени), должны быть разделены на три 15-мл коническую центрифужную пробирку. - Ресуспендируют клеток в 400 мкл HBSS 0,5% (об / об) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и добавляют 40 мкл анти-CD31 микросфер и 30 мкл анти-CD45 микрогранул. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: Не следует превышать тон инкубацией время, поскольку чистота разделения будет значительно уменьшена. - Добавить 5 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам и отцентрифугированы в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл мертвых бусин удаления клеток и инкубировать их при комнатной температуре в течение 15 мин. В то же время, подготовить разделительную колонку LS и калибровать его с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА.
Примечание: Не превышайте время инкубации, так как чистота разделения будет значительно сокращен. - Добавить 900 мкл HBSS 0,5% (об / об) БСА к клеткам, фильтровать их с использованием 100-мкм сетчатый фильтр из полиамида, и загрузить их на разделительную колонку LS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите один всю печень на одну разделительную колонну LS. - Промыть колонку три раза с 3 мл HBSS 0,5% (об / об) БСА и собирать проточные.
- Центрифуга проточный в течение 8 мин при 180 мкг и 4 ° С (с использованием пониженной ACCEleration / 4 и замедление / 2).
- Ресуспендируют осадок клеток либо в ополаскивание буфере (RB) (PBS и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)), содержащего 0,5% (об / об) БСА или ST буфера, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.
6. Магнитный Microbead на основе Автоматизированная Cell Очистка прогениторных клеток подмножествах В сочетании с нескольких Печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клеток-предшественников подмножества представляют популяции редких клеток, сочетающие в себе клетки из нескольких печени часто требуется для достижения достаточного количества клеток для дальнейших экспериментов. В качестве примера, CD133 + и gp38 + разделение клеток описана ниже.
- Выделение CD133 + клеток - предшественников
- После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 6 клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
- Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и incubели их на льду в течение 5 мин. Добавить 1: 100 анти-CD133 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
- Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 10 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
- Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2). Ресуспендируют осадок в 1 мл РБ.
- Выделение gp38 + клеток - предшественников
- После шага 5.9, подсчет клеток, как описано в шаге 3, и ресуспендируют до 10 6 клеток ( как правило , 4-6 пулинговой здоровых образцов печени) в 100 мкл РБ.
- Добавить анти-CD64 1: 100 и анти-CD16 / 32 1: 100 к клеткам и инкубировать их на льду в течение 5 мин. Затем добавьте 1:100 анти-gp38 биотинилированных антител к клеткам и инкубировать их на льду в течение еще 10 мин.
- Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют клеток в 400 мкл РБ и добавляют 5 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубируйте образца в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Не превышать времени инкубации, так как это снижает чистоту образцов.
- Добавьте 5 мл РБ и центрифуга в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (используя уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл РБ.
- Общие шаги после шага 6.1 или 6.2
- Поместите 15-мл коническую центрифужную пробирку, содержащую магнитно-меченных клеточные суспензии на охлаждающем 5 стойку с двумя дополнительными пустыми трубами для сбора положительных и отрицательных фракций. Поместите чилл стойку на платформе разделения сепаратора.
- Используйте позитивную программу выбора(Possel_d2) с обширной стадии промывки между каждой пробы (опция ополаскивания).
Примечание: Использование колонки на основе ручное разделение клеток вместо автоматического сепаратора уменьшит чистоту образца. - Сбор положительную фракцию и центрифуге в течение 8 мин при 180 х г и 4 ° С (с использованием уменьшенное ускорение / замедление 4 и / 2).
- Ресуспендируют осадок клеток либо в РБ или ST буфер, в зависимости от дальнейшей экспериментальной процедуры.
- Для проверки чистоты, возьмите аликвоты клеток и окрашивать их, как описано в шаге 4.
7. проточной цитометрии сортировки клеток
Примечание: Высокий сорт чистота любого подмножества клеток-предшественников может быть достигнуто с протоколом, описанным ниже. Общий выход клеток значительно ниже, чем это описано в шаге 6, и лучше всего для анализа экспрессии генов.
параметр настройка Размер сопла 85 мкм частота 46.00 - 46.20 амплитудное 38.30 - 55.20 фаза 0 Задержка выпадения 28.68 - 28.84 ослабление выключено Первое падение 284 - 297 Целевой показатель Gap 9.-14 давление 45 фунтов на квадратный дюйм Таблица 3.
- Acquire клетки от магнитного на основе обогащения (описанной на стадии 5); считать их, как описано в шаге 3; и окрашивают их для маркеров-предшественников (CD133, gp38), CD31, CD45 и ASGPR1, как описано в шаге 4.
- Подготовка сортировки среды (SM): фенол-красный свободный DulbecК.О. Модифицированный орла Средний (DMEM), содержащей 0,5% (об / об) БСА и 0,01% (об / об) азида натрия. Ресуспендируют окрашенных клеток в SM, передавать их в полипропиленовую с круглым дном трубы, и поместите их на лед.
Примечание: азид натрия очень токсичен. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как нитрил перчатки, лабораторный халат, а также маски для лица. Не следует использовать азид натрия, если отсортированной клетки используются для функциональных анализов. - С помощью соответствующего программного обеспечения для типа сортировщика, используемого для выделения клеток. Откройте программу и следуйте инструкциям производителя, чтобы настроить параметры сортировки и технические характеристики машины.
Примечание: Технические характеристики машины приведены в таблице 3. В то время как технические характеристики машин может быть различным в различных учреждениях, важно отметить, что снижение сортировочного давления и больший размер сопла необходимо (45 фунтов на квадратный дюйм, и сопло 85 мкм) для повышения жизнеспособности клеток-предшественников populatионов и качество РНК, полученной из отсортированных клеток. Важно использовать обогащенные клетки-предшественники печени для установки компенсации. Другие популяции печени или лейкоциты имеют различную автофлуоресценции и результат в неоптимальным разрешением населения стромы и в ложной стратегии стробирования. - Откалибруйте машину и поместить в 5 мл полипропилена с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл SM в устройстве сбора сортировки. Начать сбор образцов и сортировки. Соберите 1000 событий субпопуляции и остановить поток пробы.
- Возьмем трубку из устройства сортировки и измерения отсортированных клеток на проточном цитометре. Определить процент отсортированного популяции клеток присутствует среди живых клеток. Этот процент дает чистоту отсортированных клеток.
- Если чистота сорт превышает 95%, место 5-мл полипропиленовую с круглым дном пробирки, содержащей 350 мкл RLT буфера для лизиса в устройстве сбора сортировки.
- Начните сортировку и собирать 7000-10000 событий в стромальных субпопуляции.
- Перенесите RLT буфер для лизиса, содержащую отсортированные клетки в реакционной трубке DNase- и не содержащей РНКазы, и хранить образцы при -80 ° C до дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура , представленная здесь для переваривания печени с использованием новой смеси ферментов приводит к одноклеточной суспензии , содержащей паренхиматозные и не-паренхиматозные клетки печени (рис 1 и 2а). После ACK-лизису эритроцитов, прямой проточной цитометрии анализа одной клеточной суспензии можно (1 и 2). Стратегия стробирования предполагает исключение дублетов и мертвых клеток (фиг.2А). Клетки, которые являются негативными для CD45, CD31 и ASGPR1 пропускаются. Эта популяция включает клетки - предшественники печени и могут быть сгруппированы на основе их gp38 и экспрессии CD133 (рис 2а). В gp38 + CD133 + и gp38 - CD133 + клетки представляют собой наиболее многочисленные популяции клеток среди CD45 - CD31 - ASGPR1 - клеток здоровых взрослых мышей Livэ (рис 2а, б). Эти подмножества различаются в экспрессии дополнительных поверхностных маркеров , связанных с ранее клеток - предшественников, таких как EpCAM, Sca-1 и CD34 (Рисунок 2c).
Клетки - предшественники могут быть истощены из кроветворных и паренхиматозных клеток, таких как гепатоциты и печени эндотелиальные клетки синусоидов (LSECs) (фиг.1 и 3), и клетки - предшественники могут быть дополнительно очищен с помощью магнитной микрогранулами на основе изоляции (рис 3а, б) или с высокой чистоты сортировки (1 и 4). Магнитный Microbead на основе изоляции CD133 + или gp38 + клеток приводит к более чем 90% чистоты (рис 3а, б) в отношении каких - либо загр зн ющие CD45, CD31, или ASGPR1 + клеток, и клетки остаются весьма жизнеспособными (рис 3а, б).
2. Это особенно актуально при выборе смеси ферментов, используемой для диссоциации ткани. Здесь, коллагеназы Р вместо коллагеназы D использовали для печени 1, 2, 8. Важно отметить, что уровень экспрессии CD133 на клетках - предшественниках и выход выделенных клеточных популяций были значительно снижается в присутствии коллагеназы D (рис 5а, б). В дополнение к этому, наша смесь содержала диспаза, который очень подходит для нежного дезагрегации и субкультивировани различных типов 13 ячеек. Коллагеназы P вместе с диспаза представляетидеальное сочетание для клеточной диссоциации печени для анализа клеток-предшественников. Эта комбинация была также превосходит трипсина или проназы на основе переваривания печени (данные не показаны). Не менее важно отметить , что центрифугирование плотности, такие как Перколла на основе обогащения 2, 14, не было необходимости прародитель анализ , содержащиеся в этом протоколе.
Рисунок 1: Рабочий процесс описанного протокола. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Novel классификация подмножеств предшественников печени. Одноклеточногосуспензию получали из здоровых печени и затем окрашивают панель поверхностных маркеров: CD45, CD31, CD133 и gp38 (А). Для исключения мертвой клетки, использовали иодид пропиди (PI). Типичные точечные участки с литниковой стратегии изображены. Ворота, используемые для проточной цитометрии определения клеточной массы также отмечены. (B) Проценты и абсолютное количество клеток , присутствующих на грамм ткани печени различных стромальных клеток подмножеств среди CD45-негативных клеток дикого типа необработанных животных показаны. (C) Гистограмма отображения маркеров отличительные характеристики стромальных клеток подмножеств в здоровой печени. Высокая экспрессия CD90.2 и наличие CD157 являются специфическими для А, в то время как CD34 является специфическим для субпопуляции B. Sca-1 присутствует в B, C, D и EpCam присутствует только в популяции C и D. Среднее ± SEM; данные (АС) представляют собой 2-3 независимых экспериментов с п = 3-4 в эксперименте. WER данныее по сравнению с использованием непарный, Стьюдента тест * Р <0,05, ** Р <0,005, *** Р <0,0001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Магнитная Microbead на основе обогащения и очистки автоматизирован клеток. (А) Магнитная Microbead на основе обогащения CD45 -, CD31 - и ASGPR1 - клетки изображены до и после обогащения. (B) Типичные точечные участки автоматизированных Microbead на основе выделениями клеток изображены на CD133 + и gp38 + клеток, на левой стороне . Справа, жизнеспособность клеточных популяций до и после обогащения показаны как процентпропидиум иодида (ПИ) -отрицательные клетки. Среднее значение ± SEM; данные (AB) представляют собой 3 -х независимых экспериментов с п = 3 в эксперименте. Данные сравнивались с использованием непарного, Стьюдента тест * Р <0,05, ** Р <0,005, *** р <0,0001. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Проточная цитометрия рода предшественниках подмножеств с высокой степенью чистоты. Точечные графики показывают чистоту клеточных популяций в отсортированных образцов (после сортировки). Данные представляют собой 3-х независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
= "1"> 
Рисунок 5: Сравнение пищеварения ферментов. Одноклеточного суспензию получали с использованием коллагеназы P (как описано на стадии 2) или коллагеназы D (1 мг / мл + ДНКазы I 0,1 мг / мл) от здоровых печени и затем окрашивают панель поверхностных маркеров: CD45, CD31, CD133, и gp38 (а). Процент клеток, присутствующих на г ткани печени различных стромальных подмножеств клеток среди CD45-негативных клеток дикого типа необработанных животных показаны. (В) Средний показатель интенсивности флуоресценции CD133 изображена для популяции CD133 + клеток. Среднее значение ± SEM; данные (AB) представляют 2 независимых экспериментов с п = 3 в эксперименте. Данные сравнивались с использованием непарного, Стьюдента тест * Р <0,05, ** Р <0,005, *** р <0,0001.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Воспаление печени и травмы различного происхождения вызывают регенеративные процессы в печени, сопровождающихся расширением клеток - предшественников и активации 2, 3. Эти клетки-предшественники печени обладают стволовые клеточные характеристики и, вероятно, играют существенную роль в pathomechanism различных заболеваний печени.
Неоднородность прогениторных клеток печени уже давно было предложено. Переоценка подмножеств предшественников печени с использованием новой комбинации поверхностный маркер CD133 и gp38 могли бы определить подмножества , которые несут различные поверхностные маркеры и выразить уникальный набор генов , связанных с воспалением при поражении печени 12. Описанный здесь метод позволяет для прямого потока цитометрии анализа редких клеток и их прямого сравнения в различных моделях повреждения печени. Это особенно актуально, так как различные травмы вызывают активацию множественных клеток-предшественников сubsets , которые могут быть отражающими клеточной гетерогенностью , наблюдаемой в реакциях с протоками , 3, 4, 11, 12. Следует отметить, что небольшая часть мышиной ткани печени (0,2 г) достаточно, чтобы выделить достаточное количество клеток для анализа потока цитометрии с использованием клеток-предшественников из описанного способа.
Проточной цитометрии сортировки обеспечения населения высокой чистоты подмножеств необходимо исследовать их уникальные профили экспрессии генов. В предыдущих докладах описаны проточной цитометрии на основе клеток - предшественников изоляции 15, 16. Тем не менее, протокол, представленный здесь обеспечивает оптимизированную метод, который обеспечивает высокую чистоту и жизнеспособность этих клеток. Следует отметить, что в пробирке методы культивирования и расширения , описанные выше , могут быть красиво в сочетании с протоколом , представленного здесь 15
Многие виды проточной цитометрии сортировщики доступны в различных учреждениях, а также их конкретные измерительные приборы могут немного отличаться. Тем не менее, общие принципы сортировки клеток представлены в описанном протоколе. Как правило, более низкое давление и больший размер сопла абсолютно необходимо, независимо от типов машин и спецификаций. К тому же, использование соответствующего сортировочного среды может значительно повысить жизнеспособность и качество РНК отсортированных клеток, что является важным фактором, в частности, для генной экспрессии исследований. Сортировку клеток-предшественников, однако, значительно снижает жизнеспособность клеток, а выход клеток после сортировки является относительно низкой (для сорта высокой степени чистоты 7-10,000 событий / субпопуляции, 4-5 здоровых Печень должны быть объединены). Это может быть ограничивающим фактором для дальнейшего анализа в пробирке. Мы предлагаем магнитные Microbead на основе изоляции для ввитро анализы, из - за его более высокой урожайности и жизнеспособности клеток, и проточной цитометрии сортировки для анализа экспрессии генов, особенно при более заданных подмножеством анализов и необходимы обособления.
Исходя из того, что жизнеспособность клеток значительно снижается после того, как поточной цитометрии сортировки, автоматизированный магнитный Microbead на основе изоляции клеток-предшественников была разработана и представлена здесь. Это позволяет для выделения большего количества клеток-предшественников с высокой степенью чистоты (объединение нескольких печенки). Кроме того, жизнеспособность клеток сохраняется, так как время, необходимое для процесса выделения значительно снижается. В то время как меньшее число клеток - предшественников может быть расширена в пробирке 1, 2, 15, 16, рекомендуется рассмотреть вопрос о том , как эти манипуляции в пробирке могут изменить клеточные функции стволовых / Progenсаторной клетки описаны для других мезенхимальных и стромальных клеток популяций 17, 18.
Основным недостатком представленного магнитного микрогранулами на основе изоляции является то , что CD133 + и популяции gp38 + клеток представляют собой разнородные клетки. Дополнительные поверхностные маркеры могут потребоваться для выявления небольших клеточных популяций.
Понимание того , как печеночные стволовые клетки и клетки - предшественники связаны друг с другом далек от завершения, несмотря на отличную учебу Лола Рид и другие 1, 8, 19. Таким образом, тщательное рассмотрение методов, приводящих к повышению урожайности и жизнеспособности, например, один из них предложил здесь, могли бы помочь расширить анализ подмножеств предшественниках и понимание их взаимосвязанных отношений.
В целом, мы описали тон подробно изоляцию и анализ предшественников печени подмножеств , которые были недавно отличившихся 12. Кроме того, за счет использования новой комбинации фермента, редкие клетки-предшественники могут быть проанализированы с помощью прямых измерений методом проточной цитометрии. Кроме того, протокол показывает, как обогатить клеток-предшественников с высокой степенью чистоты, используя или сортировки клеток или автоматизированный метод Microbead основе.
Исправление проблем:
Процентное содержание остатков клеток и умирающие клетки являются высокими
Если, в процессе пищеварения (этап 2), пипетирования образцов печени является слишком жестким, процент умирающих клеток в увеличении суспензионных одноклеточных. Если печень нарезают на крупные куски, чем предполагалось, переваривание менее эффективна и приводит к большему клеточной гибели во время подготовки.
После завершения процедуры в шаге 5, чистота образцов не является достаточным
Если percenTages клеточного мусора и умирающие клетки в одной клеточной суспензии, приготовленной на стадии 2 слишком высока, микросферы связывают неспецифически, и, следовательно, чистота изоляции значительно снижается.
Низкое количество клеток после очистки на основе микрогранулами
Для успешного осуществления описанного протокола, важно, чтобы отношение клеток к микрошариков является оптимальным, как это было предложено в протоколе. Используя более микрошарики снижает чистоту и снижает выход и жизнеспособность изолированных клеток. Если поверхностные маркеры, отличные от тех, представленные в протоколе используются для изоляции прогениторных подмножества, оптимальное соотношение клеток к микрошарики должны быть определены.
Магнитная Microbead изоляция на основе gp38 + CD133 - население
Следуйте инструкциям , приведенным в разделе 5. На этапе 5.3 добавить дополнительно 10 мкл анти-CD133 + микросферы, а затем выполните шаги 5, 6.2 и 6.3 , как описаноd.
Расчет абсолютного числа клеток
Вес печени используется для расчета, сколько ячеек некоторого подмножества присутствуют в ткани печени грамм.
(% От субпопуляции в живых клетках (в расчете на поточной цитометрии) / 100) х общее количество живой клеток, выделенной из куска печени = Z
(1 / масса куска печени) х Z = число клеток / г ткани печени
Другие клеточные популяции, которые могут быть выделены с помощью этого метода
Можно выделить следующие клетки печени , используя этот протокол пищеварения: CD45 + клеток (или субпопуляции гемопоэтических клеток, например , клетки Купфера, дендритные клетки, Т - клетки, NK - клетки и т.д.) и LSECs. Протокол переваривания не подходит для изоляции гепатоцитов или звездчатых клеток печени. Эти клетки присутствуют в относительно низких числа клеток, и они показывают снижение выживаемости по сравнению с флористикуг доступные методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Александра фон Гумбольдта премии Софьи Ковалевской в VLK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1% stock solution |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5% (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1,400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µL, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µL |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
