간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.
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이 논문에서
요약
초록
만성 간 손상 동안 전구 세포는 염증 세포의 침윤과 상피 세포 활성화의 모양을 수반 ductular 반응이라는 프로세스에 확장. 이러한 염증 반응 동안 전구 세포 인구는 대부분 조직 학적 분석이나 유동 세포 계측법 기반 기술에 의해 하나, 하나의 표면 마커를 사용하여 조사되었다. 그러나, 새로운 표면 마커가 간 전구 내에서 다양한 기능적으로 별개의 하위 집합을 식별 / 셀 구획 줄기. 여기에 제시된 방법은 분리 및 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 선조 세포 계측법 분석 서브 세트의 상세한 흐름을 설명한다. 또한, 다양한 전구 세포 서브셋 고순도 자기 자동화 사용하여 FACS 정렬 기반의 방법으로 분리 될 수 있는지 보여준다. 중요한 간 새롭고 단순화 분해 효소는 높은 생존력 이러한 희귀 세포군의 분리를 허용즉 기존의 방법에 비해 우수하다. 이는 시험관 내에서 상기 전구 세포 연구 또는 유전자 발현 프로파일을 분석하는 고품질의 RNA를 분리하는 데 특히 적합하다.
서론
간 재생 주로 간세포의자가 재생산 능력과 관련된다. 그럼에도 불구하고, 만성 간 손상은 간세포 및 담관 1, 2, 3, 4로 분화 할 수있는 능력과 관련이있는 전구 세포 활성화 및 확장으로 발생한다. 만성 상처 중에 간세포 증식 효과가없는 경우가 있기 때문 특히 적합하다. 전구 세포를 표적 다중 유전자 추적 연구에도 불구하고, 간 재생에서의 역할은 5, 6, 7, 8 논란이 남아있다. 또한, 전구 세포의 활성화는 부상 9시 자신의 정확한 역할에 대한 질문을 제기 간에서 증가 섬유 성 반응에 연결되어 있습니다10.
선조 세포 구획의 이질적인 성질 긴 미세 절제 또는 세포 분류 기반의 방법
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프로토콜
모든 실험 절차 부르크 대학 의료 센터의 윤리와 동물 관리위원회의 승인을 실시 하였다.
재료 및 버퍼의 1. 준비
- 갓 세균 오염을 방지하기 위해 살균 성분 및 층류 후드를 사용하여 간 소화에 필요한 모든 버퍼를 준비한다.
- RPMI 배지 49.5 mL의 소 태아 혈청 0.5 mL를 혼합하여 수집 버퍼 (CB)를 준비 (FBS를 낮은 독소는 열 불 활성화)를 1 % (v / v)의 용액을 달성하기 위해. 추가 사용까지 얼음에 솔루션을 저장합니다.
참고 : 약 25 CB mL를 하나의 전체 간을 소화 할 필요가있다. - 하기 성분을 사용하여 소화 버퍼 (DB)를 준비 : RPMI 배지 1 % (V / V) FBS (낮은 독소는, 열 불 활성화), 콜라게나 제 P를 (0.2 ㎎ / ㎖)의 DNase-I (0.1 ㎎ / ㎖) 및 디스 파제 (0.8 ㎎ / ㎖).
참고 : 약 25 DB mL를 하나의 전체 간을 소화 할 필요가있다. t의 DB를 사전 따뜻하게사용하기 전에 그는 37 ° C의 물을 욕조. - 행크스 평형 염 용액에 도착하면 효소 (HBSS; collagense의 P 및 디스 파제) 재구성하거나에서의 DNase를-I을 완충액 (50 % (v / v....
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결과
실질 비 실질 간세포 (도 1 및도 2a)를 포함하는 단일 세포 현탁액 효소 결과의 신규 한 혼합물을 사용하여 간 소화 여기 제시된 방법. 적혈구의 ACK-용균 후, 단일 세포 현탁액 계측법 분석 직접적인 유동이 가능 (도 1 및 2)이다. 게이팅 전략은 이중선과 죽은 세포 (그림 2a)의 배제를 포함한다. CD45, CD31, 및 ASGPR1 마이너스 된 세포 게이팅된다. 이것은 인구 간 전구 세포를 포함하고 자신의 gp38 및 CD133의 발현 (도 2a)에 기초하여 그룹화 될 수있다. gp38 + CD133 +와 gp38 - 건강한 성인 마우스 리브 셀 - CD31 - -
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토론
간 염증과 다른 기원의 부상 전구 세포 확장 및 활성화 2, 3을 동반하는 간에서 재생 프로세스를 트리거합니다. 이러한 간 전구 세포는 세포의 특성을 가지고 줄기 가능성 각종 간 질환의 pathomechanism에서 중요한 역할을한다.
간 전구 세포의 이질성 오랫동안 제안되어왔다. 다른 표면 마커를 운반 서브 세트를 식별하고 간 손상 12시 염증 관련 유전자들의 고유 한 집합을 표현할 수 CD133 및 gp38의 신규 표면 마커의 조합을 사용하여 간 선조 부분 집합의 재평가. 여기에 기재된 방법은 희귀 세포 계측법 분석 직접 유동 각종 간 손상 모델에서의 직접적인 비교를 허용한다. 각종 부상 여러 전구 (S)의 활성화를 트리거로 이는 특히 관련ductular 반응 3,.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
이 작품은 VLK에 알렉산더 폰 훔볼트 재단 Sofja Kovalevskaja 수상에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| 페놀 레드 프리 DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| 콜라겐 분해 효소 P | 시그마-알드리치 | 11249002001 | |
| DNAse-I | 시그마-알드리치 | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | ||
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | 1% 원액 준비 |
| 10% BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS 헹굼 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | 0.5% (v/v) BSA를 첨가하고 얼음에 보관 |
| 페놀 레드 프리 DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| 계수 비드 카운트 Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR 차단 시약 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| 사체 제거 키트 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | 희석: 1:100 |
| CD16/32 정제된 | BioLegend | 101302 | 희석: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | 희석: 1:200, 조혈 세포 표시 |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | 희석: 1:200, 내피 세포 |
| 표시 ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | 희석: 1:100, 간세포 |
| 표시 Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | 희석 : 1 : 1,400, 전구 세포 표시 |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | 희석 : 1 : 1,400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | 3 µ 사용; L, 전구 세포 |
| 표시 CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | 희석: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | 희석: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | 희석: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | 희석: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | 희석: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | 사용 10 µ L |
| 마우스 IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| 쥐 IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| 쥐 IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| 쥐 IgG2a, κ 비오틴 | BioLegend | 400504 | |
| 쥐 IgG2a, κ 브릴리언트 바이올렛 421 | BioLegend | 400535 | |
| 시리아 햄스터 IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| 시리아 햄스터 IgG 비오틴 | BioLegend | 402004 | |
| 일반 염소 IgG 제어 정제 | Bio-Techne | AB-108-C | |
| 당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | 희석 : 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | 희석: 1:400 |
| 100 &마이크로; m 필터 메쉬 | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS 열 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브 | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus 미니 키트 | Qiagen | 74134 | RLT 용해 완충액이 포함되어 있습니다. |
참고문헌
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....
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재인쇄 및 허가
