Summary
Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.
Abstract
Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) in SJL / J-Mäusen ist ein Modell für rezidivierend-remittierender Multipler Sklerose (RRMS). Klinische EAE Scores Motorik Defizite beschreiben, sind Grund Auslesungen der immunvermittelte Entzündung des Rückenmarks. Allerdings Gewicht Scores und Körper nicht erlauben , für eine in vivo Beurteilung der Entzündung des Gehirns und Neuritis. Letzteres ist eine frühe und häufige Erscheinung in etwa 2/3 MS-Patienten. Hier zeigen wir Methoden für die Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Live - Bildgebung zur Beurteilung EAE Neuritis hervorgerufen, Gehirnentzündung und Blut-Hirn - Schranke (BHS) Störung in lebenden Mäusen unter Verwendung eines in vivo - Bildgebungssystem. Ein Biolumineszenz-Substrat aktiviert durch Oxidasen zeigte in erster Linie optische Neuritis. Das Signal war spezifisch und erlaubt die Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und Krankheitszeitkurse, die die klinischen Bewertungen einher. Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel, die innerhalb der vasculatur bliebe für längere Zeiträume verwendet wurden, die BBB Integrität zu beurteilen. Nah-Infrarot-Bildgebung ergab einen BBB-Leck auf dem Höhepunkt der Krankheit. Das Signal war das stärkste um die Augen. Ein Nahinfrarot-Substrat für Matrixmetalloproteinasen wurde verwendet EAE-evozierte Entzündung zu beurteilen. Auto-Fluoreszenz mischte sich mit dem Signal, erfordern Entmischung zur Quantifizierung. Insgesamt war Biolumineszenz-Bildgebung eine zuverlässige Methode EAE-assoziierte optische Neuritis und Medikamente Effekte und war besser als die Nah-Infrarot-Techniken in Bezug auf Signal Spezifität, Robustheit, einfache Quantifizierung und Kosten zu bewerten.
Protocol
1. EAE Induktion in SJL / J-Mäuse
- Mäuse
- Verwenden Sie 11-Wochen alte weibliche SJL / J-Mäuse und es ihnen ermöglichen, für ca. 7 Tage zur experimentellen Raum zu gewöhnen. Verwenden Sie n = 10 Mäuse pro Gruppe.
- Für die Beurteilung der Arzneimittelwirkungen, die Verwaltung der Drogen-und Placebo für die Kontrollgruppe kontinuierlich über das Trinkwasser oder über Futterpellets beginnend 3 oder 5 Tage nach der Immunisierung (n = 10 pro Gruppe). Während der Höhepunkt der Krankheit, Medikamente verabreichen oder Placebo mit Milch oder 3% Zucker mit Wasser getränkten Maisflocken.
- Immunization Material
- Verwenden ein EAE Induktions Kit, bestehend aus Antigen (Peptid von Proteolipidprotein, PLP 139-151, 1 mg / ml Emulsion) in einer Emulsion mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA, Hitze abgetötete Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) und 2 Ampullen (jeweils 5 ug) lyophilisierter Pertussistoxin (PTX).
- Man löst den PTX (2 ug / ml) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; dh </ Em> 1,5 ml PBS in jedes PTX Rohr, fügen Sie gut mischen, entfernen Sie mit der gleichen Pipettenspitze, und zu 1 ml PBS in einem 50-ml-Röhrchen hinzufügen); gut mischen.
- Immunisierung
- Injizieren PLP / CFA subkutan in 2 Portionen, die jeweils 100 & mgr; l, die beide an der Basis des Schwanzes. Nicht in die Rückseite des Halses zu injizieren, da alle Immunreaktionen in der Haut im oberen Rücken oder Nacken-Bildgebung des Kopfes und des Rückenmarks stören.
- Injizieren von 100 & mgr; l PTX intraperitoneal (ip) zweimal pro Maus, wobei der erste 1 bis 2 h nach der Immunisierung und die zweite bei 24 h.
- Für die Kontrollmäuse, injizieren CFA ohne PLP (2 Portionen von 100 & mgr; l) und PTX ohne PLP.
- Maus - Handling nach der Immunisierung
- Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag bis zum Tag 7, und sie dann täglich wiegen.
HINWEIS: Die Mäuse verlieren etwa 1 bis 2 g Körpergewicht während der EAE. Der Rückgang markiert den Beginn der EAE. - Beurteilen der klinischen Symptome täglich von Tag 7 according zu den Standard - Scoring - Systeme (dh Ergebnis 0: keine offensichtlichen Veränderungen in der Motorik; Score 0,5: distale Lähmung des Schwanzes; erzielt 1: komplette Schwanz Lähmung; Note 1.5: leichte Parese eines oder beider Hinterbeine; Stand 2: schwere Parese der Hinterbeine; Note 2.5: vollständige Lähmung eines Hinterbein; Stand 3: vollständige Lähmung beider Hinterbeine; 3.5 punkten. völlige Lähmung der Hinterbeine und Lähmung eines Vorderbein Euthanize Mäuse mit Noten von 3,5 oder höher für > 12 h.
- Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag bis zum Tag 7, und sie dann täglich wiegen.
- EAE Kurs und Zeit der Bildgebung
- Führen Sie die erste Abbildungs beim Einsetzen der Krankheit, wenn die Mäuse Scores erreichen> 1, die etwa 10 Tage auftreten - 12 nach der Immunisierung.
- Führen Sie die zweite Bildgebung an der Spitze, die 1 oder 2 Tagen erreicht wird, nachdem die ersten Symptome entwickeln und wird für 1 dauern - 3 Tage.
HINWEIS: Anschließend wird die Mäuse vollständig innerhalb von 7 bis 10 Tagen genesen. Imaging während der Intervalle können noch vaskuläre Undichtigkeiten aufweisen,aber Entzündung Indikatoren negativ sein sollte.
2. Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung
- Setup des Abbildungssystems
- Führen in vivo - Bildgebung mit der Ausrüstung, die für die Analyse der Biolumineszenz und nahen infraroten Signalen ermöglicht.
- Halten Mäuse unter 2-2,5% Isofluran-Narkose bei allen bildgebenden Verfahren.
- Position eins oder zwei Mäuse nebeneinander in der Vorrichtung die mittleren Gasversorgung verwendet wird. Positionieren Sie den oberen Wirbelsäule in der Mitte.
- Verwenden Sie zwei Mäuse gleichzeitig, eine pro Gruppe, für die Bewertung von Medikamenten Effekte Paare zu vergleichen. Dies ist wichtig für Biolumineszenz-Bildgebung.
- Abschirmen Stelle der Immunisierung mit schwarzem Tuch und nehmen ein Foto und Ausgangsbild die richtige Positionierung der Maus / Mäuse zu bewerten. Verwenden, um die B-Fokus mit einem 6,5-cm Abstand zur Kamera für alle Bilder.
- Injektion und Bildgebung von Biolumineszenz Entzündung Sonde
- Verwenden Sie die in - vivo - Bildgebung Systemeinstellungen: Epi-BLI, Em Filter geöffnet, Ex - Filterblock, fstop 1, Binning 8, konzentrieren sich B = 6,5 cm, Anzeigenpräsenz 120 s; nehmen ein Grundbild.
- Inject 100 ul ip der ready-to-use Chemilumineszenzmittellösung (40 mg / ml). Gut mischen, bevor die Spritze zu füllen.
- Erfassen Biolumineszenz Bilder 5, 10 und 15 min nach der Injektion. Der Zeitverlauf der biolumineszenten peak unterscheidet zwischen Tieren.
HINWEIS: Die Spitze 5 auftreten - 10 Minuten nach der Injektion; ein Rückgang bei 15 min zeigt an, dass keine weiteren Bilder erforderlich sind. Mit der Maus Paare von Kontroll- und Behandlungsgruppen geringfügige Verzerrungen zu beseitigen, wegen der unterschiedlichen Zeitkurse. - Füllen Sie Beschreibungen relevant für das Experiment. Beachten Sie ein Dialogfenster öffnet sich automatisch; es enthält Informationen, wie zum Beispiel Maus - Stamm, Geschlecht, Zeitpunkt, Zeitpunkt der Sonde Injektion, Gruppe usw. Speichern Sie die Dateien alle in one-Ordner; sie werden Zeit-Tags und alle Beschreibungen haben.
- Injektion und Bildgebung von Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Nanopartikel für BBB - Integrität
- Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der pegylierten fluoreszierende Nanopartikel sind 675/690 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 2-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen.
- Injizieren 70 & mgr; l von pegyliertem fluoreszierenden Infrarot-Nanopartikel iv durch die Schwanzvene und stellen Sie sich die Mäuse 3 h und 24 h nach der Injektion die obigen Einstellungen. Mischen Sie die Lösung gut, bevor die Spritze zu füllen.
- Injizieren 0,9% Natriumchlorid in Kontrollmäusen, die benötigt wird, um die Spezifität des Signals zu bewerten.
- Injektion und Abbildung des nahen Infrarot fluoreszierende Sonde für MMP - Aktivität
- Shave oder enthaaren den Kopf und upper Rückenbereich vorsichtig einen Tag vor dem Ausgangsbild nehmen. Die Haut darf nicht verletzt werden.
- Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der MMP aktivierbare Sonde sind 680/700 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 1-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen.
- Mit 200 & mgr; l 1x PBS auf das 1,5-ml-Röhrchen der ready-to-use-Lösung (20 nmol / 1,5 ml in 1x PBS), so dass es für 10 Mäuse ausreichend sein wird; gut mischen, bevor die Spritze zu füllen.
HINWEIS: Die bereitgestellten Volumen nimmt nicht berücksichtigt, dass einige Volumen während Spritzenfüllanlage und Injektion verloren. - Inject 150 ul der Sonde iv durch die Schwanzvene 24 h vor der Bildgebung. Injizieren PBS nur in Kontrolltieren die Spezifität des Signals zu bewerten.
- Bei 24 Stunden nach der Injektion, nehmen Epi-FL Bilder zumindest bei zwei Wellenlängen, Ex640 / Em700 und Ex 675 / EM720, mit den Einstellungen oben erläutert (1-s Belichtung, Fokus B, Binning 8 und fstop 2).
HINWEIS: Die Verwendung von zwei Wellenlängen ermöglicht Entmischung durch die unspezifische Signal subtrahiert wird.
3. Bildanalysen
- Biolumineszenz - Analyse (BLI)
- Doppelklicken Sie auf die Software, um es zu öffnen.
- In der oberen Menüleiste, klicken Sie auf den Datei - Browser - Symbol, gehen Sie in das Verzeichnis des Ordners des Experiments, und wählen Sie sie aus ; Dadurch werden alle Dateien im Ordner in einer Tabelle öffnen.
- Konfigurieren Sie die Spalten die Beschreibungen relevant für das Experiment zeigt.
- Für die Qualitätskontrolle, doppelklicken Sie auf eine Datei von einem Non-Responder-Maus ohne Symptome von EAE und / oder einem naiven Maus, um die Spezifität der EAE-Signale zu überprüfen.
HINWEIS: Es sollte in Non-Responder-Mäuse kein Signal in naiven Mäusen und minimale Signal sein.- Überprüfen Sie die Basislinienbild vor dem Einspritzen des Prowerden für jede Maus als weitere Kontrolle der Spezifität des Signals; es sollte negativ sein.
- Um ein Bild zu wählen, doppelklicken Sie auf die erste Datei des ersten EAE Maus und überprüfen Sie die Biolumineszenz-Intensität (LUT Bar-Bereich) und Lokalisierung. Überprüfen Sie alle Bilder nacheinander. Schließen Sie die Datei mit der niedrigsten Intensität für jede Maus (dh halten 2 von 3 Bildern pro Maus).
- Bildeinstellung und Ausfuhr
- Doppelklicken Sie auf die erste Datei zu quantifizieren. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Unter "Optionen" (oberes Menü), passen Sie die Etiketten in jedem Bild angezeigt werden soll.
- In der rechten Werkzeugpalette, gehen Sie zu "Bildeinstellung." Standardmäßig werden die minimalen und maximalen Intensitäten auf "auto" und in den Regenbogenpseudo angezeigt. Wählen Sie "Manuell", um die Einstellungen zu ändern, falls erforderlich.
HINWEIS: Zum Beispiel werden alle exportierten Bilder können gleich LUT Bars haben (identische Minima und Maxima) zu sein, leicht vergleichbar.Die Einstellung der Minima und Maxima hat keine Auswirkungen auf die quantitativen Ergebnisse. - Klicken Sie auf das Bild zu exportieren, wählen png, das Verzeichnis, und ein Bild, Namen
- Die Quantifizierung der Regions of Interest (ROI)
- Gehen Sie auf die "ROI" Werkzeug in der Werkzeugpalette. Wählen Sie den ROI-Methode (Kreis, Rechteck, Auto, oder frei Hand) und die Anzahl der ROIs. Beachten Sie die ROI-Fenster im Bildfenster Pop.
- Mit der Maus, passen Sie die Größe und Position. Verwenden Sie identische ROI Schwellenwerte für alle Bilder, wenn die Auto-ROI-Tool verwendet wird. Verwenden Sie identische Bereiche für alle Bilder , wenn ROI Größen und Positionen manuell definiert werden (zB Kreis ROIs).
- Klicken Sie auf "messen RO.I. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Passen Sie die Spalten (zB Dateiname, Tiernummer, Gruppe, Experiment, Fläche, insgesamt zählt, Durchschnitt zählt, SD zählt, min und max zählt, Fläche, Zeit Punkt, der Zeit der Sonde Injektion, etc.). speichern Sie die benutzerdefinierten Einstellungen. Wenn ReAdy, alle auswählen (Strg + A) und kopieren und die Tabelle in eine Tabelle einfügen.
- Exportieren Sie das Bild als png mit den ROIs an Ort und Stelle. Speichern und schließen Sie die Bilddatei.
- Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.1.6 - 3.1.7) für alle Bilddateien, die quantifiziert werden müssen. Kopieren Sie alle ROI Quantifizierungen in die Tabelle.
HINWEIS: Hier können die Ergebnisse nach Gruppen, Zeitpunkt sortiert, usw. und statistisch ausgewertet. Verwenden Sie die Gesamtzahl der Biolumineszenz-Signale in der ROIs für statistische Auswertungen.
- Nah-Infrarot (NIR) Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln
- Verwenden der Bedienelemente in der Software, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. - Optisch vergleichen die bei Ex / Em aufgenommenen Bilder 675/720 und Ex / Em 640/700 die Spezifität des Signals zu bewerten.
- Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder bei Ex / Em 675/720 für die quantitative Analyse (Anregungsmaximum: 680 nm). Definieren ROIs, für die die automatische ROI Werkzeug verwendet werden kann. Stellen Sie die Auto-ROI Schwelle und verwenden Sie es für alle Bilder. Quantifizieren der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs (siehe Schritt 3.1).
- Verwenden der Bedienelemente in der Software, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
- Nah-Infrarot (NIR) Analyse von Protease-empfindliche Sonde
- Der Einsatz von Software steuert, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. Führen Entmischung der Autofluoreszenz. Die Entmischung Werkzeug in lebenden Bild umgesetzt. Die Auto-Entmischung verwendet die Ex / Em 640/700 als spezifische und 675/720 als Autofluoreszenzbild. - Wählen Sie das ungemischte Bild und definieren Sie die ROIs, wie oben beschrieben. Verwenden Sie die Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs für quantitative und statistische Analysen.
- Der Einsatz von Software steuert, stellen Sie die Schwelle des Bildes.
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Representative Results
Zeitverlauf der Biolumineszenz von Neuritis
Das Biolumineszenz-Signal der Entzündung Sonde war das stärkste um die Augen und trat ausschließlich in EAE Mäuse mit Optikusneuritis. Ein Signal, trat bei keiner der nicht-EAE Mäuse noch die Mäuse nicht mit der Entzündung Sonde injiziert. Das Signal verschwunden, wenn die Mäuse gewonnen. Daher ist das Signal für Optikusneuritis spezifisch und die Spitze des Signals Parallelen der Spitze der klinischen EAE-Scores. 1 zeigt zwei Beispiele von SJL / J - Mäusen am Tag 10 und 14 abgebildet , nachdem EAE - Induktion. Das Biolumineszenz-Signal war der höchste am Tag 10 und verschwand, als die Mäuse zu erholen begann. Die Zeitverläufe der klinischen Scores entsprach dem Verschwinden des Biolumineszenz-Signals (Beispiel-1) oder vorangestellt (Beispiel-2) den Rückgang der Punkte.
Abbildung 1. Zeitlicher Verlauf der Neuritis und klinischen Scores in EAS-SJL / J - Mäuse. Biolumineszenz Bilder Optikusneuritis wurden 10 min nach der Injektion der Entzündungs Sonde (100 ul ip) während der 1. flare der Krankheit in zwei SJL / J - Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung eingefangen. Die Biolumineszenz-Bilder (links) wurden 10 und 14 Tage nach der Immunisierung gewonnen und werden als Regenbogen Pseudo Foto-Overlays dargestellt. Lut Bars reichen von blau (Nieder-) bis rot (High-Biolumineszenz). Maßstabsbalken: 1 cm. Das rechte Bild zeigt Balkendiagramme der einzelnen Gesamt Biolumineszenz zählt in ROIs (Mittelwert ± sd von 3 Bildern pro Stück) und die zeitlichen Verläufe der klinischen EAE-Scores. Die roten Pfeile markieren die Abbildungs Tage. Bitte klicken Sie hier , um eine größere version dieser Figur.
Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung
Die Entzündung Sonde
Die Wirkungen der Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) 5 sind in Abbildung 2 dargestellt. Fünf Beispiele der biolumineszenten Bilder in jeder Gruppe dargestellt. Die Noten im Fahrzeug und Behandlungsgruppe waren heterogen, aber in allen Mäusen, die Biolumineszenz - Signal in der Augenentzündung im Sehnerven zeigt niedriger war in der Medikamentengruppe (2A). Die Quantifizierung der Gesamt Biolumineszenz - Zählungen in ROIs bestätigt signifikante Wirksamkeit der Behandlung (2B, mit Box - Plots der gesamten Biolumineszenz zählt, ungepaarten t-Test, p <0,05 bis 2 tailed). Die Abbildungsergebnisse mit dem therapeutischen Effekt vereinbartens der Medikamente im Hinblick auf die klinischen Scores und histopathologischen Manifestationen von EAE im Rückenmark und Sehnerven 5.
Abbildung 2. Die Wirksamkeit von Medikamenten in EAE-SJL / J - Mäuse Mit Biolumineszenz Imaging. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden nach der Injektion der Entzündungs Sonde (100 ul ip) an der 1. EAE Peak erfasst, n = 10 pro Gruppe. EAE in 10.07 in beiden Gruppen entwickelt und EAE Non-Responder waren ohne Signal. A) Biolumineszenz Bilder in lebenden Mäusen gefangen 5 bis 15 Minuten nach der ip - Injektion von 100 & mgr; l der Entzündung Sonde werden als Regenbogen Pseudo Foto - Overlays dargestellt. LUT Bars reichen von blau (Nieder-) bis rot (hoher Intensität). Maßstabsbalken: 1 cm. Die einzelnen Spitzender gesamten Biolumineszenz-Zählungen in ROIs wurde für die Quantifizierung verwendet. ROIs wurden auf den Kopf beschränkt. Die PLP Injektionsstellen wurden mit schwarzem Tuch abgeschirmt. B) Box - Plots die Quantifizierung der Gesamtzählungen in ROIs zeigt. Die Box stellt den Quartilabstand, die Linie ist die mittlere und die Whiskers zeigen das Minimum zum Maximum. Die Gesamtzahl unterschieden sich signifikant zwischen den Gruppen (2-seitig ungepaarten t-Test, p <0,05), eine Reduktion von Neuritis und Enzephalitis bei Mäusen, die Medikation zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel
Epifluoreszenz Bilder von Nahinfrarot-Nanopartikel ergab Gefäßlecks um die Augen und im Gehirn in beiden Behandlungs groups (3A, 2 Beispiele). Die Partikel verteilen sich sehr langsam aus dem Blut in den Zwischenraum, mit Ausnahme von Entzündungsstellen, wo der Farbstoff, so dass für eine Bewertung von BBB Integrität ansammelt. Die Leckage war offensichtlich bei 3 h und 24 h nach der Injektion der Nanopartikel, aber es war zu dem späteren Zeitpunkt stärker. Es gab kein spezifisches Signal in nicht-EAE Mäuse oder Mäuse nicht mit Nanopartikeln (rechts) injiziert. Daher war das Signal spezifisch. Die quantitative Analyse von Strahlungseffizienz in ROIs (3B) zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen (n = 3 pro Gruppe, ungepaarten 2-tailed t-Test, p <0,05).
Abbildung 3. Bewertung der Blut - Hirn - Barriere - Störung mit pegyliertem Fluoreszierende Nanopartikel. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-flurbiprofde 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden 3 h und 24 h nach der Injektion von nahen Infrarot-markierte Nanopartikel (70 ul iv) während der ersten EAE peak erfasst, n = 3 pro Gruppe. EAE Non-Responder waren ohne Signal. Die Auto-ROI Tool wurde für die Quantifizierung der Strahlungseffizienz verwendet. Die ROIs wurden auf den Kopf beschränkt. Die PLP Injektionsstellen wurden abgeschirmt. A) Beispiele für Epifluoreszenz Bilder von lebenden Mäusen, eingefangen 3 h und 24 h nach der Injektion von Nanopartikeln. Bilder von Mäusen ohne EAE oder ohne die Injektion von Nanopartikeln wurden als Abbildungs Kontrollen verwendet. Maßstabsbalken: 1 cm. LUT Bars reichen von dunkelrot (Nieder-) bis gelb (hohe Intensität). B) Balkendiagramme die Quantifizierung der Strahlungseffizienz in ROIs (Mittelwert ± SD gezeigt). Die Behandlungsgruppen unterschieden sich nicht signifikant (2-seitig ungepaarten t-Test). Bitte klicken Sie hier , um die v IEW eine größere Version dieser Figur.
Matrix - Metalloproteinase-empfindliche Sonde
Nachdem die Autofluoreszenz Subtrahieren Bilder der Protease-aktivierbare MMP - Sonde zeigte , Entzündung im Gehirn und Rückenmark in EAE - Mäusen (4A, Beispiele für 4 Mäuse pro Gruppe). Es gab kein Signal in Mäusen, die mit der Sonde nicht gespritzt, und ein schwaches Signal trat in einem EAE-Maus ohne klinische Symptome (non-responder). Bilder in Abbildung 4 zeigen das Signal bei Ex / Em 640/700 durch das Bild subtrahiert bei Ex / Em 675/720. Unterschiede zwischen den Behandlungen ergab , wurden erst nach der quantitativen Analyse der Strahlungswirkungsgrad in auto-ROIs nach der spektralen Entmischung (4B, ungepaarten 2-tailed t-Test, n = 6 und 4, P <0,05).
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Abbildung 4. Bewertung der Metalloproteinase Aktivität mit Nahinfrarot-MMP-empfindlichen Imaging - Sonde. SJL / J-Mäuse erhielten Vehikel oder Medikamente (R-Flurbiprofen 5 mg / kg / d) von Tag 5 nach der Immunisierung. Bilder wurden 24 h nach der Injektion der Sonde (150 ul iv) bei der 1. EAE Peak erfasst, n = 6 und 4. Die Injektionsstellen PLP abgeschirmt wurden. EAE Non-Responder und Mäuse ohne MMP Sonde Injektionen wurden als Kontrollen verwendet. Jede 2 Bilder wurden bei Ex / Em 640/700 nm (spezifische Signal) und 675/720 nm (Autofluoreszenz) erfasst. Verwendung der spektralen Entmischung Werkzeug wurde der Auto-Fluoreszenz abgezogen und anschließend wurde das auto-ROI-Tool verwendet, um die Stellen von spezifischen MMP-Aktivität zu identifizieren. Die Gesamtstrahlungseffizienz wurde für die Quantifizierung verwendet. A) Beispiele für Epifluoreszenz Bilder in lebenden Mäusen eingefangen 24 Stunden nach der Injektion Sonde. Die Bilder sind das Ergebnis der Entmischung (UMX). Maßstabsbalken: 1 cm. LUT bars-Bereich von dunkelrot (Nieder-) bis gelb (hohe Intensität). B) Box - Plots die Quantifizierung der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs zeigt. Die Box stellt den Quartilabstand, die Linie ist die mittlere und die Whiskers zeigen das Minimum zum Maximum. Der Stern zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (2-sided ungepaarten t-Test, P <0,05). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die vorliegende Video zeigt Techniken zur Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Fluoreszenz in vivo Bildgebung von EAE in SJL / J - Mäusen. Wir zeigen, dass Biolumineszenz-Bildgebung eine entzündungs empfindliche Sonde zeigt hauptsächlich optische Neuritis verwenden, und die Quantifizierung stimmt mit der klinischen Bewertung von EAE Schwere und die Auswirkungen von Medikamenten. Jedoch war die Biolumineszenz - Bildgebungsverfahren nicht in der Lage Entzündung des lumbalen Rückenmarks zu erkennen, die eine primäre Ort der EAE Manifestation 17 ist , wahrscheinlich , weil das Signal von der Wirbelsäule absorbiert wird.
Die Nah-Infrarot-Bildgebung ist empfindlicher, aber auf Kosten der hohen Interferenz mit Auto-Fluoreszenz, die mit Biolumineszenz nicht auftritt. Die Belichtungszeit von NIR ist viel kürzer (1 - 2 s) zu BLI Vergleich (2 bis 5 min), die mit sich schnell ändernden Signalintensitäten für Zeitreihen NIR das bevorzugte Verfahren ist.
Kritische Schritte mitim Protokoll und Grenzen der Technik
Signale der Immunisierungsstelle interferieren mit Rückenmarks Bildgebung in EAE, aber dies kann durch Anordnen beide Injektionsstellen an der Basis des Schwanzes umgangen werden, die nicht schlechter als die empfohlene Injektionsstellen (Hals und der Basis des Schwanzes) war. Dennoch ist es notwendig, die Injektionsstellen mit schwarzem Tuch abzuschirmen.
Für Biolumineszenz-Bildgebung ist es wichtig, eine Zeitreihe von Bildern zu erfassen, weil die Kinetik zwischen Tieren unterscheiden. Zu vermeiden , indem die Kinetik verursacht Verzerrungen, Abbilden von Paaren von Steuer (zB Fahrzeug oder Wildtyp) und verum (beispielsweise Arzneimittel oder transgenes) -Mäuse vorteilhaft. Nach Angaben des Herstellers sollte das Signal für 30 min stabil sein. Doch in EAE beobachteten wir schneller und transiente Kinetik, mit Spitzenwerten bei 5 auftretenden - 10 min und einem deutlichen Rückgang bei 15 min.
Für Nah-Infrarot-Bildgebung, die manufacturer empfiehlt die Ex / Em Einstellung für eine bestimmte Sonde. Trotzdem war es sinnvoll, eine Filterserie zunächst und immer erfassen Bilder an mindestens zwei Anregungs- / Emissions-Kombinationen zu laufen, die eng an die Ex / Em Maxima berichtet entsprechen und kann später für Entmischung unspezifischer Signale verwendet werden.
Es ist wichtig, weiße Mäuse zu verwenden, wie SJL / J, weil Licht und Fluoreszenz von schwarzem Fell hoch absorbiert werden. Schwarze Mäuse müssen auf den Kopf und wieder einen Tag vor der Bildgebung vorsichtig rasiert werden. Die Hautveränderungen müssen vermieden werden, weil sie als entzündliche Flecken erscheinen und stören die Bildgebung des Gehirns oder des Rückenmarks. Für NIR-Bildgebung, empfiehlt der Hersteller die Enthaarung aller Mäuse, auch weiße Mäuse. Auch nach der Rasur, waren die Kopf- und Rücken Ergebnisse in schwarzen Mäuse weniger überzeugend als mit weißen Mäusen (nicht dargestellt). Für die primäre progressive EAE-Modell in C57BL6 Mäuse, weiß C57BL6 Mäuse, die im Handel erhältlich sind, können ein Alter seinheimisch. Hairless, sind immunokompetente SKH1 Mäuse nützlich für die Nah-Infrarot-Bildgebung, aber nicht EAE, da diese Mäuse einen Albino-genetischen Hintergrund haben und nicht zuverlässig entwickeln EAE (maximale Punktzahl: 0,5-1). Biolumineszenz-Bildgebung die Entzündung Sonde in diesen Mäusen zeigte mehrere Entzündungsstellen in der Haut (nicht gezeigt), wo die Haarfollikel verloren werden.
NIR-Bildgebung der Protease-Aktivität zeigte, Hirn- und Rückenmarksentzündung, sondern Signale, die durch Autofluoreszenz überlagert wurden, erfordern Entmischung vor quantitative Analyse. Daher war NIR-Bildgebung weniger robust als Biolumineszenz-Bildgebung und war teurer. die Verwendung von Protease-aktivierbare Sonden können für die Beurteilung von Arzneimitteln ist jedoch nützlich, die spezifisch Matrixmetalloproteinasen Ziel.
Vorteile und Nachteile
Die verschiedenen Bildgebungstechniken sind kostenlos und richten spezielle Fragen. Die Vorteile der Bioluminzier Bildgebung sind Erschwinglichkeit (ca. 20 Euro / Maus); ein Mangel an auto-Biolumineszenz, die das Signal stören würden; hohe Spezifität; bequem ip-Injektion und Bildanalyse; und Robustheit und Zuverlässigkeit. Nachteile sind lange Belichtungszeiten und Signalaufnahme durch schwarzes Fell und Knochen.
Vorteile der NIR sind die breitere Verfügbarkeit von NIR-markierten Sonden, die einfache kundenspezifische NIR Etikettierung, kurze Belichtungszeit und eine hohe Empfindlichkeit. Nachteile sind hohe Kosten (50 bis 100 Euro / Maus), Absorption durch Fell, starke Interferenzen mit Autofluoreszenz und die Notwendigkeit für Entmischung und Bildverarbeitung vor der Analyse.
Eine Anzahl von Sonden zur Verfügung, die Entzündungsstellen erkennen , da sie durch proinflammatorische Enzyme aktiviert werden , die an Entzündungsstellen (beispielsweise Peroxidasen oder Metalloproteinasen) aufgrund der Infiltration von Immunzellen hochreguliert werden. Einige dieser Sonden werden auch cance erkennenrs zeigt Immunzellinfiltration in der Tumor - Mikroumgebung oder die Freisetzung von Enzymen , durch den Tumor selbst (zB MMPs). Sonden, die im Gewebe infolge Kapillarwirkung Leckage ansammeln erkennt Störungen in der BBB, sondern auch an anderen Stellen der Entzündung und Krebs.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden
Die Kombination von "imaging und klinischen Wunden" überlegen war "Noten" Für die Bewertung des Krankheitsstatus und den Nachweis von Medikamentenwirkungen. Das Biolumineszenz - Signal um die Augen stimmt auch mit früheren Studien histopathologischen Zerstörung des Myelins und Immunzellen infiltriert im Sehnerven 5 zeigt. Etwa 2/3 der MS-Patienten entwickeln Episoden von Neuritis. Bisher gibt es keine zuverlässigen, nicht-invasive Methoden Neuritis zu quantifizieren bei Mäusen außer Diffusion der Magnetresonanztomographie (MRT) und op lebentischen Kohärenztomographie (OCT), die 18 technisch anspruchsvoll sind. Oktober wurde als eine Methode zeigt , Netzhautveränderungen und Atrophie bei EAE, was auf eine Autoimmunreaktion in dem Sehnerv 19 in EAE eingeführt.
Im Vergleich zu dem Verfahren in diesem Manuskript beschrieben ist, ist OCT höheren Stressor für die Mäuse, weil sie tiefer Anästhesie erfordert. Die Anzeige ist nicht eine direkte Visualisierung des Sehnervs 19.
Nah-Infrarot-Bildgebung von fluoreszierenden Nanopartikeln war nützlich, um die Störung der BHS zu visualisieren, die ein weiteres Merkmal der EAE und MS ist. Neben MRI 20, 21, gibt es keine nicht-invasive Methode zur in vivo Überwachung der Integrität BBB. Dies würde sehr nützlich sein, weil experimentelle Drogen und Phyto-Medikamente speziell wirken , indem sie die Barriere 22 Anziehen 23, die normalerweise übermäßige Lymphozyten Rekrutierung in das ZNS 24 behindert. Verhindern von Leukozyten - Befestigung oder Transmigrations durch die BBB und seine leakiness zu reduzieren , ist eine wirksame Strategie in der MS - Behandlung 25 und Nanopartikel - Bildgebung kann die Wirksamkeit von Arzneimittelkandidaten zu bewerten helfen. Bisher sind die Partikel teuer. Intravitalmikroskopie ist eine andere Technik verwendet , um BBB - Integrität 26 sichtbar zu machen, aber es erfordert in der Regel lang anhaltende, tiefe Narkose (zB mit Ketamin und Xylazin) wegen der Kraniotomie und nicht zulässt , Wiedererweckung die Mäuse, daher verhindert Zeitverlauf analysiert. Jedoch liefert Intravitalmikroskopie hochauflösende Bilder auf zellulärer auf subzellulärer Ebene, die nicht erreichbar mit in vivo - Bildgebung ist.
Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach der Technik Mastering
Zusammenfassend ist die Abbildungs techniques in der vorliegenden Video-Hilfe stellte die einzelnen Kurse der Krankheit zu bewerten und die Wirkung von Medikamenten, die teilweise waren nicht von klinischen Scores zeigte, allein zu überwachen. Die Techniken, stimmen mit den drei "R" Grundsätze der Vermeidung, Verminderung und Verfeinerung in Tierversuchen und sind nützliche Add-on-Tools in der Arzneimittelforschung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) und der Forschungsförderungsprogramm "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) des Landes Hessen, Forschungszentrum für Translationale Medizin und Pharmakologie TMP und der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS), Graduiertenkolleg Translationale Forschung Innovation - Pharma (TRIP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AngioSpark-680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10149 | Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity |
| MMP-sense 680 | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | NEV10126 | Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation |
| XenoLight RediJect Inflammation Probe | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | 760535 | Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation |
| PLP139-151/CFA emulsion | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| Pertussis Toxin | Hooke Labs, St Lawrence, MA | EK-0123 | EAE induction kit |
| IVIS Lumina Spectrum | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | Bioluminescence and Infrared Imaging System | |
| LivingImage 4.5 software | Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA | CLS136334 | IVIS analysis software |
| Isoflurane | Abbott Labs, Illinois, USA | 26675-46-7 | Anaesthetic |
References
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