Summary
Die Pankreaskanalinfusion ist eine wichtige Technik, die eine Linienverfolgung, Geneinführung und zelllinienspezifisches Targeting ermöglichen kann. Eine Pankreaskanal-Infusionstechnik für die Verabreichung von Medikamenten und Viren an Pankreaszellen wird hier vorgestellt.
Abstract
Die Bauchspeicheldrüse ist ein bifunktionales Organ mit endokrinen und exokrinen Komponenten. Eine Reihe von Pathologien kann die Bauchspeicheldrüse betreffen, einschließlich Diabetes, Pankreatitis und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Alle drei dieser Krankheiten markieren aktive Studienbereiche, nicht nur um eine sofortige Therapie zu entwickeln, sondern auch, um ihre Pathophysiologie besser zu verstehen. Es gibt nur wenige Werkzeuge, um diese Studienbereiche zu entwickeln. Die Pankreaskanalinfusion ist eine wichtige Technik, die eine Linienverfolgung, Geneinführung und zelllinienspezifisches Targeting ermöglichen kann. Die Technik erfordert die komplizierte Dissektion des zweiten Teils des Zwölffingerdarms und der Ampulle, gefolgt von der Okklusion des Gallengangs und der Kannulation des Pankreasgangs. Obwohl die Technik zunächst technisch anspruchsvoll ist, gibt es unzählige Anwendungen. Unklarheiten in den Besonderheiten des Verfahrens zwischen Gruppen zeigten die Notwendigkeit eines Standardprotokolls. Diese Arbeit beschreibt die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in der Bauchspeicheldrüse nach der Pankreasganginfusion eines viralen Vektors, der GFP exprimiert, im Vergleich zu einer Scheinoperation. Die Infusion und damit die Expression ist spezifisch für die Bauchspeicheldrüse, ohne dass eine Expression in einem anderen Gewebetyp vorhanden ist.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse ist ein bifunktionales Organ mit endokrinen und exokrinen Komponenten. Eine Reihe von Pathologien kann die Bauchspeicheldrüse betreffen, einschließlich Diabetes, Pankreatitis und Bauchspeicheldrüsenkrebs1. Alle drei dieser Krankheiten markieren aktive Studienbereiche, nicht nur um eine sofortige Therapie zu entwickeln, sondern auch, um ihre Pathophysiologie besser zu verstehen.
Eine gezielte therapeutische Verabreichungsmethode wäre von Vorteil. Wir haben eine Pankreasgang-Infusionstechnik entwickelt, die eine effektive und selektive Methode für die Verabreichung von Medikamenten und Viren an Pankreaszellen ist. In diesem Modell wird der Pankreasgang selektiv kanuliert und der gemeinsame Gallengang ist verschlossen, so dass die Abgabe ausschließlich an die Bauchspeicheldrüse ermöglicht wird.
Diese Technik kann die Abstammungsverfolgung bestimmter Zelltypen ermöglichen, um die für die Entwicklung und Pathologie der Bauchspeicheldrüse wichtigen Entwicklungswege weiter aufzuklären2,3. Verschiedene Promotoren in viralen Vektoren ermöglichen das gezielte Targeting von Zelllinien und die Einführung von Genen in diese Zelllinien4,5. Diese Arbeit zeigt die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in der Bauchspeicheldrüse nach der Pankreasganginfusion eines viralen Vektors, der GFP exprimiert, im Vergleich zu einer Scheinoperation.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Animal Research and Care Committee am Children's Hospital of Pittsburgh und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt.
1. Präoperative Vorbereitung
- Inhalatives Isofluran (1 - 3% zur Aufrechterhaltung und bis zu 5% zur Induktion) über einen Nasenkegel auf ein geeignetes Anästhesieniveau verabreichen. Überwachen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch Zehenklemme mit einer Zette. Das Fehlen einer Reaktion wird als ausreichend angesehen, und achten Sie darauf, nicht zu viel zu behandeln, da Atemdepression auftreten kann.
- Legen Sie das Tier auf den Rücken auf die Seziermikroskopstufe, wobei der Bauch mit Blick auf das Objektiv zentriert ist. Immobilisieren Sie das Tier mit chirurgischem Klebeband. Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um Trockenheit während der Unternarkose zu verhindern.
- Tragen Sie eine glatte, dicke Schicht Haarentfernungscreme auf und lassen Sie sie 3 Minuten an Ort und Stelle. Überprüfen Sie einen kleinen Bereich für die Haarentfernung. Wischen Sie die Creme und das Haar vorsichtig mit 70% ethanolgetränkter Gaze ab.
- Reinigen und desinfizieren Sie den Bauch des Tieres, indem Sie ihn mit einer 70% ethanolgetränkten Gaze abwischen, gefolgt von einer mit Betadin getränkten Gaze. Halten Sie sterile Bedingungen während des gesamten chirurgischen Eingriffs aufrecht.
2. Richtige Belichtung
- Machen Sie einen Mittellinienschnitt in die Haut vom Xyphoid-Prozess zum Nabel mit einem Skalpell. Heben Sie das Peritoneum mit einer Adson-Zette an und machen Sie mit einer Schere ein kleines Loch in der Mittellinie.
- Verlängern Sie den Peritonealschnitt auf die Länge des Hautschnitts und achten Sie darauf, auf der Mittellinie (Linea alba) zu bleiben.
HINWEIS: Dies führt zu einer Laparotomie des oberen Mittellinienabdominus. - Heben Sie die Leber mit stumpfen Retraktoren an, um den gemeinsamen Gallengang freizulegen. Klemmen Sie den gemeinsamen Gallengang mit einer gekrümmten Bulldoggen-Gefäßklemme.
HINWEIS: Dieses Manöver verhindert eine unerwünschte Infusion in die Leber.
3. Identifizierung der Pankreaspapille und Duodenotomie
- Identifizieren Sie den Zwölffingerdarm und ziehen Sie ihn mit einer Arruga-Zette kaudal zurück, um die Papille anzuzeigen.
HINWEIS: Die Papille ist ein weißer Fleck auf der vorderen Oberfläche des zweiten Teils des Zwölffingerdarms. - Ziehen Sie den Zwölffingerdarm kaudal zurück, um den Verlauf des Pankreasgangs zu identifizieren. Punktieren Sie mit einer 301/2-Gauge-Nadel die Wand des Zwölffingerdarms tangential, direkt gegenüber der Papille.
HINWEIS: Die Nadel sollte dem gleichen Winkel wie der Kanal folgen, wenn sie in den Zwölffingerdarm eintritt.
4. Infusion.
- Führen Sie den Katheter durch die in Schritt 3.2 erzeugte Duodenotomie, bis der Katheter im Kanal sichtbar ist. Den Katheter nicht mehr als 1 cm in den Kanal vorstoßen, um die Umgehung kleinerer duktischer Nebenflüsse zu verhindern.
- Klemmen Sie den Katheter mit einer zweiten gekrümmten Bulldoggen-Gefäßklemme an Ort und Stelle. Schalten Sie die Pumpe ein und geben Sie das ausgewählte Volumen auf. Das infundierte Volumen kann zwischen 25 und 250 μL liegen, mit einem idealen Volumen von etwa 150 μL.
- Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von etwa 1,5 ml Kochsalzlösung, um Verluste auszugleichen. Bedecken Sie den freiliegenden Darm mit einer feuchten Gaze, um Austrocknung zu verhindern.
- Entfernen Sie am Ende der Infusion die Bulldoggenklemme, die den Katheter an Ort und Stelle hielt. Verwenden Sie die Bulldoggenklemme, um den Katheter vorsichtig aus dem Pankreasgang zu entfernen. Lösen Sie die Klemme aus dem gemeinsamen Gallengang.
- Schließen Sie das Peritoneum und die Haut in ein oder zwei Schichten mit einer laufenden Naht.
HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, die Duodenotomie zu schließen, da sie sich von selbst versiegelt. - Als postoperative Analgesie verabreichen Sie eine Dosis Ketofen in Höhe von 5 mg/kg während des Eingriffs und eine Dosis am folgenden Tag.
- Bringen Sie die Maus in ihren Käfig unter einer Wärmelampe zurück, bis sie sich erholt hat. Versorgen Sie die Maus ad libitum mit Nahrung und Wasser.
- Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege zu erhalten. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, erst dann in Begleitung anderer Tiere zurück, wenn es sich vollständig erholt hat.
5. Probenvorbereitung
- Legen Sie das Tier in eine Kohlendioxidkammer oder führen Sie eine zervikale Dislokation durch.
- Ernten Sie die Bauchspeicheldrüse mit Milz, Leber und Zwölffingerdarm als Kontrollen. Fixieren Sie das Gewebe über Nacht bei 4 °C in Paraformaldehyd. Kryoschutz der Probe in 30% Saccharose über Nacht, wie zuvor beschrieben6.
- Schnappen Sie die Proben ein. Das Gewebe mit einer Dicke von 6 μm mit einem Mikrotom durchtren. Führen Sie die Bildgebung an einem Mikroskop mit Fluoreszenzbildgebung durch, wie zuvor beschrieben7.
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Representative Results
Mit Übung und sorgfältiger Operationstechnik sollte die Überlebensrate dieser Mäuse größer als 95% sein. Eine Woche nach der Infusion sollte der gewünschte Effekt in der Bauchspeicheldrüse sichtbar sein. Mäuse im Alter von 10 bis 12 Wochen wurden für Pankreasganginfusionen verwendet. Hier verwenden wir einen Adeno-assoziierten Virus-Serotyp 8 (AAV8) mit einem CMV-Promotor, um grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu exprimieren, verglichen mit einer Scheinoperation. Mäuse Bauchspeicheldrüsen wurden 7 Tage nach den Infusionen geerntet. Abschnitte von Bauchspeicheldrüse, Milz und Zwölffingerdarm wurden mit Insulinantikörpern und Hoescht gefärbt. Abbildung 1 zeigt, dass es eine umfangreiche Expression von GFP in der gesamten Bauchspeicheldrüse bei den Mäusen gibt, die sich einer Pankreaskanalinfusion mit AAV8 unterzogen haben, im Gegensatz zu denen, die sich einer Scheinoperation unterzogen haben. Es gibt keine Expression in leber, milz oder Zwölffingerdarm bei diesen Mäusen, was die selektive Natur der Infusion dokumentiert. Diese Daten können mit verschiedenen anderen Methoden bestätigt werden, einschließlich DNA- und RNA-Expressionsprofilen.
Abbildung 1. Expression von GFP nach Pankreasgang-Infusion. (a) Scheinoperation im Vergleich zu (b) Pankreasganginfusion mit AAV8, die GFP exprimiert. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt detailliert die Methodik hinter der Pankreasganginfusion, einem effektiven Mausmodell für die Abgabe von Genen und anderen Molekülen spezifisch und effektiv an die Bauchspeicheldrüse. Unklarheiten in den Besonderheiten des Verfahrens zwischen verschiedenen Gruppen zeigten die Notwendigkeit eines standardisierten Protokolls8,9,10.
Es gibt mehrere kritische Schritte des Verfahrens, beginnend mit der Auswahl junger, gesunder Mäuse. Die Perforation des Zwölffingerdarms, wie klein und kontrolliert sie auch sein mochte, ist ein traumatisches Ereignis bei der Maus, das zweifellos zur Rekrutierung von entzündlichen Zytokinen und anderen Faktoren führt, die nicht vollständig charakterisiert wurden. Daher ist eine empfindliche Dissektion entscheidend, ebenso wie die Schaffung einer möglichst kleinen Duodenotomie für die Einführung des Katheters. Der wichtigste Schritt des gesamten Verfahrens ist die Kannulation des Pankreasganges mit dem Abgabesystem.
Schwierigkeiten können bei übermäßiger Störung der Pankreaspille auftreten, was zu einer überwältigenden systemischen Entzündungsreaktion führt. Die Bauchspeicheldrüse ist ein empfindliches Organ; In der chirurgischen Gemeinschaft wird es umgangssprachlich als ein Organ beschrieben, mit dem man sich nicht "anlegen" sollte. Die Erfolgsraten variieren nur geringfügig mit den Fähigkeiten des Praktikers. Solange der Gallengang richtig verschlossen ist, ist die Infusion zu 100% spezifisch für die Bauchspeicheldrüse allein.
Die Lernkurve für das Verfahren ist ziemlich steil, und die Haupteinschränkung wird mit übung überwunden. Wie bereits erwähnt, kann eine übermäßige Manipulation des Zwölffingerdarms und der Bauchspeicheldrüse zu einer überwältigenden Entzündungsreaktion führen, die vermieden werden muss.
Das Verfahren ist in vielen verschiedenen Disziplinen breit anwendbar. Es kann als Methode zur gezielten Genabgabe durch die Verwendung spezifischer viraler Vektoren verwendet werden11. Das Verfahren kann auch die spezifische Infusion von Molekülen ermöglichen, die bei der Aufklärung der Funktion von Pankreaszellen helfen. Die spezifische Abgabe bestimmter Moleküle ist eine ansprechende Methode, um die Signalwege innerhalb der Inseln zu modifizieren, um eine Proliferation zu erzeugen12. Das System kann auch die Notwendigkeit einer transgenen Züchtung vermeiden, indem es direkt einen gewünschten Genotyp und Phänotyp innerhalb der Bauchspeicheldrüse produziert. Die Anwendungen sind zahlreich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren haben keine Danksagungen. Die Finanzierung wurde von der Stiftung für Gesundheit und Familienplanung der Provinz Zhejiang (Grant 20146242) und der Foundation of Wenzhou Science & Technology Bureau (Grant Y20140248) erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
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