Summary
Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.
Abstract
In organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) zijn de morfologische en functionele kenmerken van zowel zenuwcellen en gliacellen goed bewaard. Dit model is geschikt voor het aanpakken van verschillende onderzoeksvragen die betrekking hebben op onderzoek naar neuroprotectie, elektrofysiologische experimenten op neuronen, neuronale netwerken of tumor invasie. De hippocampal architectuur en neuronale activiteit in multisynaptic circuits zijn goed bewaard in OHSC, hoewel de segmenteringshulplijnen procedure zelf in eerste instantie laesies en leidt tot de vorming van een gliale litteken. De littekenvorming verandert vermoedelijk de mechanische eigenschappen en diffusive gedrag van kleine molecules, enz. Segmenten kunnen nagaan van tijd-afhankelijke processen na hersenletsel zonder dierlijke chirurgie, en studies over de interacties tussen de verschillende soorten van de hersenen-afgeleide cellen, namelijk astrocyten, microglia en neuronen onder zowel fysiologische en pathologische voorwaarden. Een ambivalente aspect van dit model is het ontbreken van de bloedstroom en bloed immuuncellen. Tijdens de progressie van de neuronale schade, migreren immuuncellen uit het bloed spelen een belangrijke rol. Als deze cellen in plakjes ontbreken, kunnen de intrinsieke processen in de cultuur worden waargenomen zonder buitenlandse inmenging. Bovendien, in OHSC wordt de samenstelling van het medium-externe milieu precies geregeld. Een ander voordeel van deze methode is het lagere aantal geofferde dieren in vergelijking met standaard preparaten. Verschillende OHSC kan worden verkregen van het ene dier gelijktijdige studies met meerdere behandelingen in één dier mogelijk te maken. Om deze redenen, OHSC zijn zeer geschikt voor het analyseren van de gevolgen van nieuwe beschermende therapeutics na weefselbeschadiging of tijdens de invasie van de tumor.
Het protocol gepresenteerd hier beschrijft een methode van de voorbereiding van OHSC waarmee genereren zeer reproduceerbaar, goed bewaard gebleven segmenten die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van experimenteel onderzoek, zoals neuroprotectie of tumor invasie studies.
Introduction
OHSC zijn een goed gekarakteriseerd in vitro model om te studeren zowel fysiologische en pathologische eigenschappen van neuronen, astrocyten en microglia1. Het is gemakkelijk om te controleren de extracellulaire omgeving en controleren van de cellulaire en morfologische veranderingen na verschillende prikkels. De organisatie van de hippocampal neuronen en hun verbindingen zijn goed bewaard gebleven na voorbereiding2,3. Uit verschillende voordelen, OHSC toestaan controle van hersenen letsel en tumor invasie zonder dierlijke chirurgie. Zes tot acht OHSC kan worden verkregen van een enkele knaagdier hersenen. OHSC helpen daarom aanzienlijk verminderen van het aantal dieren en laten testen van meerdere drugs concentraties, genetische manipulaties of laesie van de verschillende modellen in hetzelfde dier. In segment gebaseerde testen, experimentele omstandigheden precies controleerbaar. Bovendien tijdsafhankelijke ontwikkelingsprocessen van pathologische condities als secundaire schade door time-lapse imaging gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd.
In het gegeven protocol, oorspronkelijk opgericht door Stoppini et al. 4, de voorbereiding stappen worden beschreven en belangrijke morfologische bezienswaardigheden voor de selectie van passende segmenten worden gemarkeerd. Het is raadzaam de voorbereiding van postnatale dag 7-9 ratten of muizen postnatale dag 4-5. In deze periodes Toon OHSC een robuuste weerstand tegen mechanische trauma's en een hoog potentieel voor reorganisatie van neuronale circuits. Daarentegen preparaten van embryonaal of volwassen ratten snel veranderen hun structuur en hun organotypic morfologie verliezen tijdens de teelt en zijn daarom minder geschikt voor de studie van langdurige processen in fundamenteel onderzoek5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. een ander kritisch punt voor de overlevingskansen van OHSC is de dikte van het segment zelf als de verspreiding en dus voedingsstoffen levering beperkte12,13,14 zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dier experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig het beleid van ethiek en het beleid inzake het gebruik van dieren in het onderzoek neurowetenschap zoals goedgekeurd door de Europese Gemeenschappen Raad richtlijn 2010/63/EG van het EuropeesParlement en de Raad van de Europese Unie betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden.
1. voorbereiding van de instrumenten en cultuurmedia
- voor bereiding van OHSC de volgende set van instrumenten gebruiken: twee kleine schaar, twee gebogen pincet, een pincet met een fijne tip, drie bladen (twee van maat 11, één van grootte 15), drie scalpel houders, ronde filtreerpapier (diameter: 35 mm), agar, een scheermesje, een pipet van Pasteur ongewijzigd, en een gewijzigd Pasteur Pipetteer zonder een tip. Steriliseren van alle materialen in een autoclaaf vóór gebruik ( Figuur 1).
- Weeg 5 g agar en los het op in 100 mL gedestilleerd water. De oplossing voor 20 min bij 121.7 ° C bij 210.8 kPa in een autoclaaf steriliseren. Verdelen van de 3 mL vloeibare agar oplossing in 60-mm petrischalen met behulp van een steriele glazen pipet, toestaan om te stollen voor 5 h, dek af met plastic paraffine film bewaren bij 4 ° C tot verder gebruik te voorkomen van besmetting. Agar blokken zijn nodig om de hersenen te stabiliseren tijdens de segmenteringshulplijnen procedure.
- Media
- maken 200 mL van het preparaat medium (pH 7,35) bestaande uit 198 mL minimaal essentiële medium (MEM) en 2 mL oplossing van L-glutamine (definitieve concentratie van 2 mM). Bereid de oplossing op de dag van de voorbereiding van de media en het bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden 100 mL gestolde voedingsbodem bestaande uit 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' evenwichtig zoutoplossingen (HBSS), 25 mL (v/v) normale paard serum (NHS), 1 mL oplossing van L-glutamine (definitieve concentratie van 2 mM), 100 µg insuline, glucose 120 mg, 10 mg streptomycine , 10.000 U penicilline, en 800 µg vitamine C zoals eerder gemeld. Warm het medium (37 ° C), de pH-waarde tot pH 7.4 en steriele filter (0,2 µm poriegrootte) aanpassen. Herhaal de procedure (warming-up, pH-waarde, enz.) om de dag voordat u wijzigt het medium. Het medium op het meest gebruikt voor één week wanneer bewaard bij 4 ° C.
- Vul een 35-mm petrischaal met voorbereiding medium voor het opslaan van de hersenen. Plaats twee lege petrischalen voor het verzamelen van het weefsel op een cooling pack in het werkgebied.
2. Voorbereiding en Slicing met een Vibratome
- gebruik hersenen van 7-9 daagse oude ratten of 4-5 dagen oude muizen voor de voorbereiding van de OHSC volgens Stoppini et al.. 4 na de onthoofding van dieren, verwijder de huid van de schedel met schaar.
- Het blad van een fijne scissor introduceren in het achterhoofdsgat en open de schedel door te snijden langs de caudal (terug) rostraal (front) as. Maak twee snijdt loodrecht naar de eerste, zodat de schaar wijs naar de linker en rechter oor, respectievelijk (" T-incisie ").
- Open de schedel zorgvuldig met een fijne Tang, waarbij aandacht wordt besteed niet te verwonden van de hersenen. Gebruik van een scalpel (lemmet maat 11) te snijden het meest rostraal deel van de frontale paal en het cerebellum.
- Door middel van een spatel, verwijderen de hersenen en breng dit zorgvuldig in de petrischaal gevuld met voorbereiding medium ( Figuur 2). Positie van de hersenen op de monsterhouder en repareren met medische Cyanoacrylaat lijm. De stukken van agar kunt verzekeren van de mechanische stabilisatie.
- Ontleden van het weefsel horizontaal in 350 µm dik OHSC met behulp van een glijdende vibratome.
- Evalueren de plakjes optisch met behulp van een verrekijker Microscoop. OHSC van lage kwaliteit onmiddellijk verwijderen. Het is belangrijk om alleen die segmenten met intacte cytoarchitecture van het middengedeelte van de hippocampus geïsoleerd (zie figuren 3 en 4) tussen de dorsale en de ventrale hippocampus.
- Scheiden de hippocampal regio en de cortex van de Entorinale met behulp van een scalpel (ronde mes grootte 15; Figuur 3). De perforant traject en Entorinale cortex moet worden bewaard.
- Zes tot acht OHSC worden verkregen van elk hersenen. Pipetteer 2-3 plakjes in één cel cultuur invoegen (porie grootte 0,4 µm) en plaats deze in een put van een 6-well cultuur schotel met 1 mL gestolde voedingsbodem per putje.
- Broeden de 6-well gerechten bij 35 ° C in een volledig bevochtigde sfeer met 5% (v/v) CO 2 en veranderen het kweekmedium cel elke tweede dag.
Opmerking: Uitvoering van uw experimenten op 6 dagen in vitro (div). Ontstekingsreacties die is gekoppeld aan de segmenteringshulplijnen procedure verdwijnen door dag 6. In dit stadium, microglial cellen weergeven een vertakte morfologie en synaptische verbindingen hebben gerijpt.
3. Evaluatie van de kwaliteit van het weefsel
- fixatie, labeling en visualisatie van de degenererende neuronen in OHSC
- na het uitvoeren van de experimenten, Incubeer de OHSC met 5 µg/mL propidium jodide (PI) gedurende 2 uur voorafgaand aan de fixatie, in om vlekken van de kernen van de degenererende neuronen.
Let op: PI is een verdachte carcinogeen, altijd het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) zoals handschoenen. - Wassen van de OHSC met 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7.4) en pas deze aan met een 4% (v/v)-oplossing van paraformaldehyde (PFA) voor 24 h.
Let op: PFA is een toxische en vermoedelijke kankerverwekkend. Werken onder zuurkast en dragen PPE. - De OHSC in inzetstukken met 1 mL PBS wassen en gebruik dan een borstel rigger te scheiden van de segmenten van het membraan.
- Label van de OHSC met IB 4 kleurstof in een 24-well plaat ( Figuur 5).
- na het uitvoeren van de experimenten, Incubeer de OHSC met 5 µg/mL propidium jodide (PI) gedurende 2 uur voorafgaand aan de fixatie, in om vlekken van de kernen van de degenererende neuronen.
- Geleiding van tumor invasie experimenten met behulp van fluorescently label afzonderlijke cellen
- 24 h vóór de aanvang van een experiment, het label van de tumorcellen met behulp van de fluorescente kleurstof Carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl Ester (CFDA SE).
- Loskoppelen en tellen van de tumorcellen met behulp van een kamer Neubauer.
- Resuspendeer de cellen in het medium, zodat 10 µL van schorsing het nummer van de gewenste cel (normaal 50.000 of 100.000 cellen bevat).
- Breng 10 µL van de celsuspensie op de cultuur van het segment en de cellen binnen te vallen voor 3 dagen toestaan.
- Aan het einde van het experiment, los van de culturen van de segmenten met behulp van 4% (v/v) PFA gedurende 24 uur en label de co culturen met PI voor een andere 24 h te visualiseren van de cytoarchitecture.
Let op: PFA is een toxische en vermoedelijke kankerverwekkend. Werken onder zuurkast en dragen PPE. - Mount de co culturen op een cover slip voor verdere analyse met behulp van de media montage.
4. Evaluatie van de experimenten van de OHSC
de OHSC analyseren met een confocale laser scanning microscoop (CLSM). Voor detectie van PI aangeduid, ontaarden neuronen of de PI cytoarchitecture het label gebruiken monochromatisch licht van de golflengte λ = 543 nm en een uitstoot-band pass filter voor de golflengte λ = 585-615 nm. Voor CFDA label tumorcellen of IB 4 microglia, gebruiken een excitatie golflengte λ = 488 nm. Voor beide experimentele typen, het opnemen van een z-stack met 2 µm dik optische segmenten en gebruikt voor evaluatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuroprotectie studies: Om te bepalen van neuronale schade, het aantal PI positieve kernen en IB4 positieve microglia in elke derde optische sectie van de cellaag van de submodule (GCL) voor de getand gyrus (DG) werd geteld. Voor tumor invasie experimenten, werd de maximale intensiteit z-projectie van de stack gebruikt voor de berekening van het verdragsgebied van tumorcellen, als een maatregel van de invasie en visualiseren van verschillende invasie patronen (Figuur 6).
In de onbehandeld controlegewas OHSC (CTL) bleef neuronen goed bewaard gebleven. In de GCL van het DG werden bijna geen PI positieve neuronale kernen (figuur 5A) waargenomen. In de moleculaire laag, werden de meerderheid van de microglial cellen vertakt. In de GCL van de DG, slechts zeer weinig IB4 positieve microglial cellen (figuur 5A) werden ontdekt. Na incubatie met 50 µM N-methyl-D-asparaginezuur (NMDA) een sterke toename van het aantal PI positieve neuronale kernen (figuur 5B) en IB4 positieve microglial cellen (figuur 5B) werd ontdekt in vergelijking met controle OHSC. Vooraf beschadigde OHSC van lagere kwaliteit kan worden geïdentificeerd door een hoger aantal Wortelpotigen microglia en PI positieve cellen in het DG (figuur 5C) onder controlevoorwaarden. Behandeling van vooraf beschadigde segmenten met NMDA leidde tot vernietiging van DG cytoarchitecture en een groot aantal positieve dodencel PI verspreiden naar de Hilus en CA3 regio (figuur 5D).
Tumor invasie studies: Segmenten werden behandeld met 50.000 cellen van de twee glioblastoma cellijnen U138 (figuur 6A) en LN229 (figuur 6B) voor drie dagen. In beide gevallen de cytoarchitecture van de segment-culturen intact gebleven en de cornu-ammonis en de DG werden bewaard. Bovendien is zowel cellijnen toonde verschillende invasie gedrag. Terwijl U138 cellen gevormd ronde, duidelijk zijn te onderscheiden tumoren (figuur 6A), LN229 cellen een tumor netwerk binnen één tumor spheroïden gebouwd en waren vaak moeilijk te onderscheiden. Wanneer we kijken naar de hoeveelheid tumor massa in segment culturen, bleek een hogere invasiviteit voor LN229 cellen in vergelijking met U138 cellen.
Figuur 1: dissectie instrumenten en materialen. Voor de voorbereiding van segment culturen is een geschikt aantal dissectie hulpmiddelen en materialen vereist zoals. De set bevat drie scalpels met kleine verwisselbare messen, een spatel, twee fijne schaar, drie pincet, een normale Pipet van Pasteur, één Pipet van Pasteur zonder tip, agar, petrischalen, filtreerpapier, een cooling pack, voorbereiding gemiddeld en medische Cyanoacrylaat lijm. De hulpmiddelen van de dissectie gesteriliseerde met autoclaaf vóór gebruik moeten worden en geplaatst in een plastic verpakking te houden in een steriele atmosfeer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: locatie van de hippocampal formatie in de rat hersenen. De hippocampal formatie, blijkt uit de zwarte stippellijn is een bilaterale structuur omsloten door de hersenschors en de thalamus. De hippocampus uitstulpingen in de temporele Hoorn van de laterale ventrikel. De hippocampus is bilaminar, bestaande uit de cornu ammonis (hippocampus juiste) en de getand gyrus (of fascia getand), met één lamina opgerold in de andere. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: visualisatie van rat OHSC. Een segment van de hele hersenen met OHSC wordt gevisualiseerd door een verrekijker om de kwaliteit van het weefsel te beoordelen. Segmenten worden bewaard in een petrischaal gevuld met gekoelde voorbereiding medium (A, B). Vergroting van het segment van de hersenen. De intact hippocampus (HC) en de Entorinale cortex zijn zichtbaar op de linker- en rechterkant van de afbeelding (C). OHSC wordt gescheiden van de rest van de hersenen. De submodule cellaag (GCL) van de DG, het cornu ammonis subvelden CA1 en CA3, de hilus regio (HI), de Entorinale cortex (EG) en de moleculaire laag (ML) zijn duidelijk te onderscheiden (D). C, D: schaal bar = 4 mm.
Figuur 4: Wanneer afhankelijk wordt gewijzigd in OHSC.
Direct na de voorbereiding, microglia en astrocyten beginnen te vormen van een gliale litteken. Vanaf 1-3 dagen in vitro (div) gliosis en oedeem formation in acht worden genomen. De gelaagdheid van hippocampal vorming en DG is niet langer zichtbaar. Op cellulair niveau weer OHSC op 5 div een vermindering in het aantal geactiveerde cellen. 6 div, bijna geen oedeem ontbreekt niet, het segment is dunner en de gebieden die zijn opgenomen in het intrinsieke neuronale circuit hebben overleefd. OHSC kan nu worden gebruikt voor de experimenten. Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: evaluatie van de kwaliteit van het weefsel door CLSM. Zoals geopenbaard door CLSM, wordt een goede neuronale behoud waargenomen in de niet-lesioned control OHSC (CTL). Vrijwel worden geen PI positieve neuronale kernen (rood) en slechts een paar IB4 positieve microglial cellen (groen) aangetroffen in de cellaag van de submodule (GCL) van het directoraat-generaal (A). In tegenstelling tot niet-lesioned OHSC is een sterke stijging in het aantal PI en IB4 positieve cellen zichtbaar in de GCL van NMDA-lesioned OHSC (B). Let op: de morfologie van de DG, geactiveerde microglial cellen en een groot aantal PI positieve kernen in vooraf beschadigde OHSC (C, D). Bars = 50 µM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: visualisatie van tumor invasie door CLSM. PI (in rood) toegepast na de fixatie etiketten de cytoarchitecture van de OHSC, terwijl CFDA (in groen) illustreert de tumorcellen invasie van het segment. Het proces van de invasie van U138 cellen is gevisualiseerd na drie dagen van de tijd van de invasie. Één tumor spheroïdenzijn duidelijk te onderscheiden (A). In tegenstelling, het glioblastoma cellijn LN229 gevormd een tumor netwerk (B). Bars = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de bereiding van OHSC. Dit model kunnen testen van intrinsieke mogelijkheden en reacties van hersenweefsel na de toepassing van fysiologische en pathologische stimuli. Naast analyses van elektrofysiologische parameters, kan OHSC lesioned en de gevolgen van schade voor alle celtypes kunnen worden bepaald. Behandeling met verschillende stoffen en de gedetailleerde beschrijving van lesioning processen of genezing in de afwezigheid van macrofagen en lymfocyten is mogelijk.
The most kritische stappen voor een succesvolle voorbereiding en kweken zijn tot: 1) werken onder steriele condities, 2) bereiden correct, van de media gezien temperatuur en pH, en 3) de ontwikkeling van de nodige handigheid bij de verwerking van OHSC.
Kenmerken van de OHSC
Vanwege de ongewijzigde morfologie van neuronale cellen en hun in vivo-net als van de organisatie, de segmenten organotypic worden genoemd. De OHSC bestaan uit de stratum pyramidale en stratum granulosum, opgebouwd uit de piramidale cornu ammonis (CA1, CA2, CA3) en DG granulaire cellen. Delen van de hippocampus zijn zeer besteld en de projecties afferent vezel in afzonderlijke lagen in een niet-overlappende manier beëindigen. De efferences tussen de Entorinale cortex (het perforant traject), DG, CA3 en CA1 neuronen intact blijven na de voorbereiding en functioneel vergelijkbaar met die in vivogedragen. Zoals eerder getoond, ontwikkeling van dendritische bomen, synaps formatie en netwerk activiteiten van de granulaire cellen in de OHSC zijn vergelijkbaar met acute segmenten verkregen tijd gematched besturingselementen14,15,16.
Oligodendrocyten en de astrocyten zijn bestudeerd in OHSC door zowel licht- en elektronenmicroscopie. Oligodendrocyten weergeven een ruimtelijke verdeling van organotypic, met inbegrip van verschillende morfologische subtypen17,18. Ook worden de axonen myelinated tijdens de eerste twee weken in vitro. Sommige auteurs gepostuleerd dat de laag specifieke lokalisatie van astrocyten is afwezig in segment culturen, en geloven dat de astrocyten niet een volledige rijping in vitro bereiken. Dit aspect kan niet volledig worden beantwoord, aangezien de specifieke markers voor alle activeringsstappen van astrocyten ontbreken nog1,19,20.
In de eerste 3 dagen na de voorbereiding, de cellen van de microglial reageren met migratie en proliferatie en zich ophopen op het oppervlak van de segment waar ze het gliale litteken samen met astrocyten vormen. Alle cellen lijken te zijn in een hoogst-geactiveerde staat. Echter in de binnenste lagen van OHSC en tussen 3 en 6 div wijzigen microglial cellen hun Wortelpotigen morfologie naar een vertakte vorm, gekenmerkt door kleine cellulaire lichamen en lang vertakkende fijne cytoplasmatische uitsteeksels uitgebreid in alle richtingen21 ,22.
Soortgelijke uitdrukking en distributie van glutamaat receptoren zijn gemeld in de volwassen weefsel en OHSC2,23. De frequentie van synaptic stromen, de miniatuur synaptic stromingen en de frequentie van GABAergic stromen in OHSC (7, 14 en 21 div) niet significant verschillend in vergelijking met acute preparaten op postnatale dagen 14 of 15 respectievelijk zijn. Daarentegen is de frequentie van glutamaterge signalen hoger in OHSC dan in acute segmenten15.
Vergelijking van verschillende bereidingswijzen
De voorbereiding van embryonale en vroege postnatale weefsel is vrij eenvoudig, vanwege de goede cel survival tarieven in vitro. Dit moet worden beschouwd dat in dit vroege stadium, de neuronale cellen zijn nog steeds grote afstanden trekkende en actieve leidt tot een verlies van organotypic organisatie van segmenten1. Na 7-9 postnatale dagen, zijn sommige synaptic verbindingen bij ratten gevestigd. Tijdens de volgende 2-3 weken in vitro volwassen de synapsen13. Een van de voordelen van het gepresenteerde model is haar weerstand tegen mechanische trauma's tijdens de voorbereiding en de hoge plasticiteit als gevolg van de leeftijd van de dieren (7-9 dagen)1,14,24. Er moet worden opgemerkt dat de segmenten zeer gevoelig voor mechanische manipulaties zijn door instrumenten. Zelfs de verkeerde hoek van het snijden kan helling snijden van neuronale vezels verantwoordelijk voor anterograde of retrograde neuronale ondergang. De voorbereiding van segment culturen van volwassen dieren op lange termijn ter is uitdagend en nog steeds niet vastgesteld. Dergelijke OHSC tonen een enorme degeneratie kort na de voorbereiding vermoedelijk te wijten aan het verlies van plasticiteit1. Toch is er een sterke behoefte aan een voorbereiding methode waardoor werken met volwassen segmenten.
Voor diverse bereidingswijzen, is het vers verwijderde weefsel gesneden met een dikte van 300-400 µm, met behulp van een weefsel chopper te snijden van de geïsoleerde hippocampus. Deze snelle methode kan vaak leiden tot wijdverspreide weefselschade. Kritische factoren voor de kwaliteit van OHSC zijn hun definitieve dikte en de tijd dat ze worden bewaard in vitro. De beste resultaten met de hoogste overlevingskansen hebben bereikt voor 300-400 µm dikke sneden. In dikkere plakjes ontaarden de bovenlagen tijdens de tijd van de cultuur als gevolg van de diffusie beperkingen1. Afhankelijk van de wetenschappelijke vragen, worden OHSC gebruikt direct na bereiding of na enkele dagen in cultuur. Dus, door de jaren heen verschillende teelttechnieken werden opgericht, zoals de Roller-Tube techniek1,13 of statische segment technieken4.
Uit verschillende bereidingswijzen zijn we ervan overtuigd dat het gebruik van de techniek van de interface samen met een vibratome de meest nauwkeurige en minst pijnlijke procedure is voor het voorbereiden van OHSC tot nu toe. Deze methode is verder verbeterd met behulp van poreuze membranen. OHSC houden hun 3D-structuur functioneel en morfologisch intact blijven voor maanden en kan visueel worden geëvalueerd tijdens de teelt periode25.
Toepassingen
OHSC kan worden bereid uit zowel wild type en transgene dieren14,26. Ze overleven voor maanden en bieden opties voor lange termijn experimenten12,13. OHSC worden gebruikt om aan te pakken van fysiologische, farmacologische, morfologische en ontwikkelingsproblemen vragen14,27 onder zeer standaardized aandoeningen zoals chronische toepassing van de neurotherapeutics of stamcel therapie26,27,28. Het onderzoek van de ontwikkelingsaspecten van neuronal connectiviteit of processen betrekking tot synaptische transmissie, synaptische plasticiteit, effecten van chronische epilepsie van dendritische spines piramidale cellen of neurogenese alle vertegenwoordigen extra velden 29,30,31,32.
Glutamaat, de primaire excitatory neurotransmitter en ionotropic glutamaat receptoren spelen een centrale rol in excitotoxicity. Excitotoxic letsels optreden tijdens neurologische aandoeningen zoals beroerte, Alzheimer ziekte, HIV neurotoxiciteit, traumatisch hersenletsel en reparatie mechanismen14,24. Toepassing van glutamaat-receptor agonisten NMDA, α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) of kainic zuur OHSC nabootsers selectieve en regio bepaalde neuronale cel dood26,28,33 ,34. Gliale cel reactie neuronale schade bv, microglial migratie en fagocytose in OHSC zijn bovendien eerder geanalyseerde3,35geweest. De invloed van microglia tijdens de laesie kan worden voorspeld door farmacologische uitputting van deze cellen door de bisfosfonaat clodronate36.
Een verdere belangrijke toepassing ontstaat nabootsen in vivo voorwaarden voor onderzoek van de invasie van de tumor met behulp van OHSC. Spheroïden gevormd door glioma cellijnen aankonden van een invasie van de segment-culturen, een fenomeen dat was soort overlappende37. Het patroon van de diffuse infiltratie van de gebruikte cellijnen leek op de waargenomen patroon in vivo37. Bovendien, primaire glioblastoma spheroïden OHSC ingeplant gehouden hun invasie potentiële en stamcel karakter over meerdere dagen in vitro38. Dus, het model laat toe de waarneming van de invasie patronen en interacties tussen neuronale weefsels en tumorcellen die overeenkomen met in vivo37,38waargenomen. In vergelijking met collageen of gel lijkt op basis modellen (bijvoorbeeld)39, het gebruik van OHSC gunstiger voor analyses over de invasie van de metastase en tumor in de hersenen. De fysiologische milieu, met inbegrip van neuronale en gliale celtypes en extracellulaire matrix, blijft intact.
Bovendien kunnen OHSC bestuderen van directe interactie tussen één tumorcellen en hersenweefsel onder gecontroleerde omstandigheden. Bijvoorbeeld, werden microglial cellen gevonden om de vermogens van tumorcellen in te voeren van de hersenen door de vorming van leidende structuren voor invasie35te versterken.
Daarnaast kan het effect van tijdelijke en permanente cellulaire veranderingen op invasie processen worden geanalyseerd. Een stabiele expressie van metastase verbonden dikke darm kanker gen 1 (MACC1) in glioma cellen werd geassocieerd met een verhoogde proliferatie en de daaropvolgende invasie40. De tijdelijke wijziging van cel stijfheid in glioblastoma cellijnen was direct gecorreleerd met de invasieve eigenschappen van de cel lijnen41. OHSC en tumor co celculturen kunnen dus potentieel voor drugstests, reproductie van klinische waarnemingen, en model en beeld invasie van de tumor onder zeer gecontroleerde en gestandaardiseerde omstandigheden worden gebruikt.
Na studies in primaire celculturen, OHSC zijn de logische volgende keuze voor het uitvoeren van experimenten in een meer complex systeem tot de onderlinge aanpassing van de voorwaarden in vivo . Een ander gebied van belang in plakjes van de hersenen is de screening van potentiële therapeutische drugs vóór de proef in vivo. Hersenen segmenten toestaan controle en nabootsen van verwondingen onder controle van de waarnemer en zonder dierlijke chirurgie. Maximaal 8 OHSC kan worden verkregen en het aantal benodigde dieren aanzienlijk wordt verminderd. Het is mogelijk om resultaten in hetzelfde dier onder vergelijkbare instellingen maar met verschillende of meerdere voorwaarden te verkrijgen. OHSC is dus een krachtig hulpmiddel om te observeren o.a. morfologische, moleculaire en cellulaire veranderingen tijdens de periode van de laesie, de ontwikkeling van secundaire schade en verspreiding van de tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs bedank Christine Auste voor haar steun met de video-opname en Chalid Ghadban voor zijn uitstekende technische hulp. Urszula Grabiec werd gesteund door de Roux Programm FKZ 29/18/EG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-Well | Falcon | 35-3046 | |
| Agar | Fluka | 5040 | |
| Autoclav | Systec | DX-45 | |
| CFDA | Thermo Fisher | V12883 | |
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 | Carl Zeiss | ||
| Eagle´s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 32360-034 | |
| Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Labs | FL-1101 | |
| Glucose | Merk | 1083371000 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 24020-133 | |
| Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 14170-138 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I5500 | |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | |
| L-Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| LN229 | Cell-Lines-Service | 300363 | |
| Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) | B.Braun | 1050052 | |
| Millicell Culture Inserts | Millipore | PICMORG50 | |
| NMDA N-methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Normal Horse Seum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillin Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Petri dishes (all sizes) | Greiner | 627160/664160/628160 | |
| PFA | Roth | 0335.1 | toxic |
| Propidium iodid (PI) | Sigma Aldrich | 81845-25MG | toxic |
| U138 | ATCC | HTB-14 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1200 |
References
- Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
- Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
- Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H.
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
- Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
- Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
- Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
- Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
- Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
- Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
- Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
- Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
- Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
- He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
- Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
- Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
- Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
- Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
- Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
- Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
- Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
- Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
- Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).
