Abstract
Die Beurteilung von Antibiotika-Maßnahmen mit neuer Arzneimittelentwicklung, die auf anaerobe Bakterien gerichtet ist, ist schwierig und technisch anspruchsvoll. Um einen Einblick in mögliche MOA zu erhalten, können morphologische Veränderungen, die mit der Antibiotika-Exposition verbunden sind, mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sichtbar gemacht werden. Die Integration von SEM-Imaging mit traditionellen Kill-Kurven kann unsere Einsicht in die Drogen-Aktion verbessern und den Drogenentwicklungsprozess vorantreiben. Um diese Prämisse zu testen, wurden Killkurven und SEM-Studien unter Verwendung von Arzneimitteln mit bekannten, aber unterschiedlichen MOA (Vancomycin und Metronidazol) durchgeführt. C. difficile Zellen (R20291) wurden mit oder ohne Anwesenheit von Antibiotika bis zu 48 h gezüchtet. Während des 48-Stunden-Intervalls wurden die Zellen zu mehreren Zeitpunkten gesammelt, um die antibiotische Wirksamkeit und die Bildgebung auf dem SEM zu bestimmen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten hatten Vancomycin und Metronidazol eine signifikante bakterizide Aktivität nach 24 h Behandlung, gemessen durch eine koloniebildende Einheit (CFU)Ting Mit SEM-Bildgebung haben wir festgestellt, dass Metronidazol signifikante Auswirkungen auf die Zelllänge hatte (> 50% Reduktion der Zelllänge für jedes Antibiotikum, P <0,05) im Vergleich zu Kontrollen und Vancomycin. Während die phänotypische Reaktion auf die medikamentöse Behandlung bisher nicht auf diese Weise dokumentiert wurde, stimmen sie mit dem MOA des Arzneimittels überein, das die Vielseitigkeit und Zuverlässigkeit der Bildgebung und Messungen und die Anwendung dieser Technik für andere experimentelle Verbindungen zeigt.
Introduction
Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das jährlich etwa 500.000 Infektionen in den USA verursacht und als Bedrohungsstufe für die Disease Control and Prevention (CDC), das höchste Risiko, als Bedrohungsniveau angesehen wird. 1 Das vergangene Jahrzehnt hat eine beträchtliche Arzneimittelentwicklung in antimikrobiellen Mitteln mit Aktivität gegen C. difficile beobachtet . 2 , 3 In-vitro- Studien sind ein notwendiger Bestandteil des Arzneimittelentwicklungsprozesses. 4 Herkömmlicherweise werden in vitro- Anfälligkeit und Zeit - Tötungsstudien verwendet, um zukünftige Tier- und andere in vivo- Studien zu validieren.
Während diese Methoden eine wichtige Rolle bei der Bewertung von Tötungsaktionen spielen, erfassen sie nicht die phänotypische Reaktion der Zellen auf die pharmakologische Behandlung. Durch die Einbeziehung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit StandarD töten kinetische Studien, eine gründlichere Charakterisierung der antibiotischen direkten Effekte ist möglich. 5 , 6 , 7 Hier stellen wir ein Verfahren vor, bei dem SEM als Mittel zur Profilierung der Wirksamkeit der Antibiotika-Behandlung verwendet wird.
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Protocol
1. Trennung von C. difficile aus verschiedenen Umwelt- oder klinischen Quellen
- Umgebungsisolate: Mit einer vorsterilisierten Baumwolllehre (leicht benetzt mit 0,85% NaCl), die Oberfläche eines beliebigen Bereichs (Boden, Tür, Griff, Regal usw. ) abtupfen. 8 Achten Sie darauf, sterile Handschuhe zu tragen und legen Sie den Tupfer in ein sterilisiertes Rohr nach abgeschlossen.
- Klinische Isolate (Stuhl): 10 bis 100 mg klinische Stuhlproben auf Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (CCFA) unter Verwendung einer Impfschleife plattieren und unter strengen anaeroben Bedingungen für 48 - 72 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen. 7 , 9 , 10
- Anreichern Sie die Umwelt-Tupferproben in Hirnherz-Infusion (BHI) -brühe mit 0,05% Natriumtaurocholat und legen Sie sie in eine anaerobe Kammer bei 37 ° CFür 5 Tage. 1 ml der Kultur bei 10.000 xg zentrifugieren und das Pellet in 100 ul Ethanol resuspendieren.
- Die resuspendierten Zellen (50 & mgr; l) auf Cycloserinecefoxitin-Fructose-Agar (CCFA) -Platten pipettieren und in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 40-48 h inkubieren. Lagern Sie isolierte Kolonien von C. difficile Lager in Kryovials bei -80 ° C für weitere Analysen.
- Testen Sie vermutete C. difficile Kolonien unter Verwendung des Latexagglutinationsreagenzes oder der PCR.
2. Kultivierung C. difficile und Killing Kinetic Procedures
- Wachsen Sie gereinigte umwelt- oder klinische C. difficile- Stämme auf Blut-Agar-Platten in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C für 48 h.
- Nehmen Sie eine isolierte Kolonie mit einer Impfschleife, überführen sie in 5 ml BHI-Medium in einem 15-ml-Röhrchen und wachsen für 24 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C.
- Verdünnen Sie die Vorkulturen 1: 100 bis ca. 10 6 Kolonie bildende EinheitS (CFU) / ml in frischem, vorreduziertem BHIS (BHI plus 5 g / l Hefeextrakt und 1% L-Cystein), ergänzt mit 0,1% Natriumtaurocholat und der entsprechenden Konzentration an Antibiotika (T0).
- Sammeln Sie bei jeder Zeitspanne (T0, T6, T24, T48) eine 1-ml-Probe mit einer Pipette und verteilen Sie ein kleines Aliquot (100 μl in seriellen Verdünnungen) auf eine Blut-Agar-Platte. Die Zellen wachsen auf der Blut-Agar-Platte für 48 h in einer anaeroben Kammer bei 37 ° C und zählen die resultierende Anzahl von Kolonien, um CFU zu bestimmen.
3. Proben für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereiten
- 1 ml Zellen aus jedem Zeitpunkt in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und 10 min bei 10.000 xg zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und Zellen in PBS waschen.
- Die Proben bei 10.000 xg für 10 min erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zellen in 1 ml 4% Paraformaldehyd erneut verdünnen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugen Sie die Proben erneut für 10 min bei 10,000 xg und verwerfen den Überstand. Zellen zweimal mit destilliertem Wasser waschen und in 100 μl destilliertem Wasser umspülen. Lautstärke einstellen abhängig von der Trübung der Lösung.
HINWEIS: Das Erstellen mehrerer serieller Verdünnungen ist eine gute Idee. - Etikettendeckel und 40 μl der Probe darauf geben. 15 Minuten lang in einer Durchflusshaube inkubieren, um die Flüssigkeit zu verdampfen und den Zellen zu erlauben, an dem Deckglas zu haften. Wenn Flüssigkeit noch vorhanden ist, verwenden Sie ein Gebläse, um die Flüssigkeit zu entfernen.
- Legen Sie markierte Deckgläser mit Zellen in einem Schreibtisch Sputter-Maschine und Klebeband nach unten. Sichern Sie reines Gold in der Sputtermaschine. Maschine einschalten und bei niedrigem Druck (50 mTorr) mit Sputtern beginnen. Coat Zellen für 30 s bei 80 mA, was auf 20 nm Goldbeschichtung übersetzt.
- Übertragen Sie beschichtete Zellen auf das Rasterelektronenmikroskop.
4. Imaging C. difficile Zellen auf einem Rasterelektronenmikroskop
- Entlüftung des Rasterelektronenmikroskops (SEM) durch prDie Entlüftungsknopf auf der Computer-Software.
- Mit Kohleband befestigen Sie die beschichteten Deckgläser auf die Metallstufe. Sobald die SEM belüftet ist, sollte sich die Tür leicht öffnen. Verriegeln Sie die Metallstufe in die SEM-Kammer, indem Sie sie einschrauben.
- Klicken Sie auf die PUMP-Taste auf der Computersoftware. Der SEM wird nutzbar sein, wenn das System "Vac OK" liest.
- Klicken Sie auf den SE-Detektor unter der Registerkarte Detektoren. Schalten Sie den Strahl ein, indem Sie auf die Schaltfläche klicken, die die Spannung anzeigt. Starten Sie die Bildgebung bei einer niedrigeren Spannung (5 kV), bevor Sie die Spannung erhöhen (bis zu 15 kV). Nach dem Einschalten des Strahls erscheint ein Bild.
- Mit der Tracking-Funktion finden Sie einen Bereich auf den beschichteten Deckgläschen zum Bild. Untersuche die Region und findet stabförmige Strukturen. Diese sind clostridium difficile .
- Vergrößern und fokussieren Sie das Bild, um das System zu kalibrieren. Dies sollte bei mehreren Arbeitsabständen erfolgen: 15, 9 und 5 mm. Bild bei einem Arbeitsabstand von 5 mm.
- Schalte die u einLtra hochauflösenden Imaging-Modus und beginnen zu konzentrieren und optimieren Astigmatismus.
- Beginne bei hoher Vergrößerung. Verwenden Sie dazu den Grob- und Feinfokus. Passen Sie auch Astigmatismus an, um ein klareres Bild zu erhalten.
- Den Astigmatismus bei hoher Vergrößerung anpassen. Um dies zu tun, passen Sie die Astigmatismus-Toggles (sie sehen ähnlich wie die feinen / groben Fokus schaltet) und überprüfen Sie das Bild für Klarheit durch digitales Zoomen auf der Computer-Software.
- Se die langsame Scan-Funktion, um ein qualitativ hochwertiges Bild zu sammeln. Speichern Sie das gesammelte Bild als .TIFF-Datei, die für die Analyse verwendet wird. Vergewissern Sie sich, dass die Datenleiste ausgewählt ist, wenn während der Analyse Messungen vorgenommen werden.
- Sammeln Sie Bilder in verschiedenen Winkeln (bis zu 52 ° durch manuelles Drehen des Winkels direkt auf dem SEM. Abgewinkelte Bilder neigen dazu, mehr Tiefeninformationen zu enthüllen.
- Wechseln Sie die Strahlspannung abhängig von den abgebildeten Zellen. Halten Sie dies vor allem zwischen 5 - 15 kV für alle Experimente. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, schalten Sie den Strahl aus und erhöhen den Arbeitsabstand auf 20 mm. Die Kammer kann dann entlüftet und die Bühne entfernt werden. Kopiere alle Bilder auf ein Laufwerk zur weiteren Analyse.
5. Bildverarbeitung und -analyse
- Laden und installieren Sie die frei verfügbare Software, FIJI (http://fiji.sc), auf den Computer.
- Öffnen Sie die Bilddatei in FIJI.
- Verwenden Sie die Linienfunktion, um die Waage genau zu verfolgen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Analysieren im FIJI-Programm und wählen Sie die Select Scale-Funktion aus. Es erscheint ein Fenster, das die Einstellung der bekannten Distanz auf der Skala benötigt. Ändern Sie die Längeneinheit und klicken Sie auf OK.
- Nun, da das Programm für die Entfernung kalibriert ist, verwenden Sie die Linienfunktion, um die Zelllänge zu messen. Um die Länge zu erhalten, benutze die Linienfunktion, um die Zelle in ihrer Gesamtheit zu verfolgen. Wählen Sie erneut die Registerkarte Analysieren und klicken Sie dann auf Messen. Die Länge sollte appOhr in den zuvor genannten Einheiten.
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Representative Results
Clostridium difficile ist ein sporenbildendes Bakterium und daher ist es wichtig, die Morphologieunterschiede zwischen vegetativen und Sporenzellen vor einer funktionellen Analyse zu bestimmen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von vegetativen Zellen, die während der exponentiellen Phase der Wachstumskurve und Sporenzellen eingefangen wurden. Wie dargestellt, sind vegetative Zellen lange, glatte, stabförmige Strukturen, während Sporen kleine, ovale Strukturen sind, die ein raues Äußeres haben. Funktionell wachsen und teilen sich vegetative Zellen schnell und sind verantwortlich für die Virulenz von C. difficile Infektionen durch die Sekretion von Toxinen, während Sporen normalerweise mit wenig Aktivität ruhen. Daher sind Antibiotika meist gegen vegetative Zellen aktiv, während Sporen in der Regel resistent gegen eine medikamentöse Behandlung sind, und zwar aufgrund mehrerer Schichten, die den Kern mit der DNA schützen, und der Mangel an physiologischer Aktivität. Aufgrund dieser Tatsachen, die MehrheitDer morphologischen Analyse konzentriert sich auf die vegetativen Zellen. 11 , 12
Eine antibiotische Tötungskurve ist die Standardmethodologie, um die antibiotische Wirksamkeit gegen wachsende Bakterien zu demonstrieren. Die mit dem C. difficile-Stamm R20291 verwendeten Konzentrationen basierten auf den MIC-Werten, 1 μg / ml für Vancomycin und 0,51 μg / ml für Metronidazol. Wie in Fig. 2 gezeigt , wachsen die Kontrollzellen und erreichen ein Plateau, während die behandelten Zellen in den gesamten koloniebildenden Einheiten (CFU) bis zur Grenze des Nachweises (LOD) abnehmen, was eine bakterizide Wirkung zeigt. Wie gezeigt, sind Vancomycin (Abbildung 2A ) und Metronidazol (Abbildung 2B ) wirksam beim Abtöten von C. difficile bei supraMIC-Konzentrationen (4xMIC). Man kann feststellen, dass die Antibiotika-Töten Kurven ähnlich aussehen, aber die Medikamente haben unterschiedliche Mechanismen von ac(Vancomycin verhindert die Zellwandsynthese, während Metronidazol die DNA-Replikation beeinflusst). Daher schlagen wir vor, dass Antibiotika-Tötungskurven nicht genug von einer diskriminierenden Macht haben, um detaillierte Unterschiede zwischen diesen Antibiotika zu liefern. Wir haben die Mikroskopie eingesetzt, um mehr Diskriminierung zu bieten.
Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist C. difficile ohne hohe Vergrößerung nicht möglich. Dies hat eine Chance für die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), eine bildgebende Methode, die eine Auflösung im Nanometer-Skala erhalten kann, um die detaillierten Effekte der antibiotischen Behandlung direkt auf die Zellen zu beurteilen. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurden die Zellen vor und nach der medikamentösen Behandlung abgebildet, um zu bestimmen, wie sich die Morphologie änderte (Abbildung 3A ). Wie gezeigt, waren einige der Wände der Zellen betroffen, wie im Fall von Vancomycin, und einige der Zellen waren kleiner in der Größe,Wie es bei metronidazol der Fall war. Um zu testen, ob die Zellengröße betroffen war, analysierten wir die Zelllänge mit dem Programm FIJI. Die Vegetationszellgröße kann im Kontrollfall etwas variieren, die meisten sind jedoch etwa 6 μm lang (Abbildung 3B ). Bei der Betrachtung vieler Zellen aus der Kontrolle und den behandelten Einstellungen kann man schnell feststellen, dass die Zelllänge bevorzugt in Metronidazol betroffen ist, aber nicht von Vancomycin behandelt wird (Abbildung 3C ).
Abbildung 1: Differenzierung zwischen Zelltypen durch Rasterelektronenmikroskopie. Gezeigt sind repräsentative Bilder von Clostridium difficile vegetativen und Sporenzellen. Vegetative Zellen sind Stabstrukturen, die lang und geißelt sind. Im Gegensatz dazu sind Sporenzellen klein und haben eine grobe und holprige Fell. Sporen sind pseudofarbig für Bild purNur ses Maßstäbe werden auf den Bildern angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Antibiotika-Zeit-Kill-Kurven. SupraMIC-Tötungskurven wurden für vier verschiedene Antibiotika durchgeführt: Vancomycin (A) , Metronidazol (B) . Diese Antibiotika hatten eine signifikante Tötungswirkung gegen den C. difficile- Stamm R20291 und nähern sich der Grenze des Nachweises (LOD) zum Zählen von koloniebildenden Einheiten (CFU). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen der Antibiotika-Behandlung. Bilder von behandelten und nicht behandelten Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Tötung der kinetischen Studien (A) aufgenommen. Gezeigt ist ein repräsentatives Beispiel für eine kontrollierte vegetative Zelle, die für die Länge (B) gemessen wurde. Behandelte und nicht behandelte Zellen wurden gemessen und verglichen (C) . Experimente wurden in mindestens Duplikat durchgeführt und> 17 Zellen wurden pro Gruppe gemessen. * P <0,05 im Vergleich zu Kontroll- und Vancomycin-Behandlungsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, eine Hochdurchsatzmethode zur Isolierung von C. difficile und zur Untersuchung von Antibiotika-Suszeptibilität mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) als Mittel zur gründlicheren Charakterisierung der pharmakologischen Wirkung des Antibiotikums zu schaffen. Mit den hier skizzierten Protokollen haben wir gezeigt, dass die bildgebung der phänotypischen Antwort der Zelle auf die antibiotische Behandlung einen Einblick in die pharmakologische Wirkung des Arzneimittels zeigt. Insgesamt nimmt der bildgebende Teil dieses Protokolls etwa 2 h in der Dauer nach dem Sammeln der Zellen auf, kann aber viel diskriminierender sein als typische Tötungskinetische Studien allein. Während das Lernen, ein SEM zu benutzen, technisch anspruchsvoll sein kann, ist die Vorbereitung der Proben relativ einfach und schnell. Wir glauben, dass diese hier skizzierten Protokolle einen objektiven Ansatz zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung der Antibiotika-Behandlung bieten.
Angesichts der Ähnlichkeiten unter tEr antibiotische Tötungskurven (Abbildung 2 ), wir haben versucht zu bestimmen, ob es Unterschiede zwischen der Antwort der Zelle auf die pharmakologische Behandlung gab. Mit SEM haben wir festgestellt, dass Metronidazol Auswirkungen auf die Zelllänge bei supraMIC-Konzentrationen des Medikaments hatte. Während diese Phänotypen bisher nicht berichtet wurden, stimmen sie mit den Wirkmechanismen der Antibiotika überein und deuten auf eine Wirkung auf den Zellstoffwechsel und das Wachstum hin. Im Gegensatz dazu hatte Vancomycin signifikante Auswirkungen auf die Zellwand, was auch mit seinem Wirkungsmechanismus übereinstimmt. 13 Während es Ähnlichkeiten zwischen der Tötungskinetik zwischen diesen Antibiotika gibt, ergibt sich aus den SEM-Bildern, dass es signifikante phänotypische Unterschiede gibt. Die Schaffung einer antibiotischen Phänotyp-Bibliothek ermöglicht eine gründlichere Charakterisierung von Medikamenten, die möglicherweise keinen klaren Wirkmechanismus haben, wie dies bei Ridinilazol der Fall ist.
BecausE Diese Methode ist technisch anspruchsvoll, es müssen eventuell Modifikationen vorgenommen werden, um die wissenschaftliche Frage zu behandeln, einschließlich konsequenter Zellpräparation und Änderungen beim Sputtern von Goldbeschichtung. Zu viel Beschichtung kann jegliche Effekte auf die Außenseite der Zellen verschwimmen, aber nicht genügend Beschichtung kann zum Aufladen des Strahls führen und die Bilder verzerren. Um dies zu vermeiden, bereiten Sie Proben mit unterschiedlichen Mengen an Goldbeschichtung vor, um die Sputterzeit zu optimieren. Schließlich ermöglicht eine konsequente Methodik zwischen Studien inter-experimentelle Vergleiche.
Eine Einschränkung der Verwendung von SEM ist, dass es auf die Beobachtung der Zellmorphologie Änderungen beschränkt ist; Daher sind funktionelle Studien notwendig, um jede vermutete Antwort zu bestätigen. Aus diesem Grund glauben wir, dass dieses Bildgebungsprotokoll als Mittel zur Steuerung von Funktionsstudien verwendet werden kann. Trotz dieser Einschränkung kann die Immunogold-Markierung unter Verwendung von SEM durchgeführt werden, um vermutete Veränderungen des Proteinhandels oder der Aggregation zu bestätigen;Allerdings haben wir diese Experimente noch nicht durchgeführt.
Aufgrund der aktiven Pipeline neuer Antibiotika für die C. difficile- Behandlung ist eine gründlichere Beurteilung der Wirkstoffaktivität erforderlich. Wie hier präsentiert, bietet SEM eine einzigartige, hochdurchsatzreiche und zuverlässige Möglichkeit zur Charakterisierung von pharmakologischem Handeln. Durch die Abbildung vieler verschiedener antibiotischer Effekte unter verschiedenen Stämmen von C. difficile , werden wir in der Lage sein zu verstehen, warum einige Antibiotika wirksamer sind als andere gegen spezifische pathogene Stämme wie der 027 / NAP1 / BI-Epidemie-Stamm. 14 Darüber hinaus kann die SEM-Analyse hilfreich sein, um antibiotische Effekte zwischen Ribotypen oder Stämmen zu unterscheiden und könnte verwendet werden, um andere Bakterienarten zu untersuchen, die ihre breite Anwendbarkeit demonstrieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
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