형태 변화를 규명하기위한 프로토콜 클로스 트리 디움 디피 실 항생제 치료에 대한 반응

이 미생물 이미징 방법의 전반적인 목표는 약물 치료의 표현형 효과를 구별할 수 있는 보다 설명적인 수단을 제공하는 것입니다. 따라서 이 방법은 전염병 분야에서 실제로 도움이 될 수 있습니다. 특히 특정 항생제의 형태학적 효과와 그것이 C.Difficile을 어떻게 죽이는지를 살펴봅니다.

이 기술의 주요 장점은 고해상도 이미징과 체외 세포 배양 기술을 결합하여 제약 사멸 작용에 대한 자세한 전망을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 클로스트리듐 디피실 감염(Clostridium difficile infection) 또는 줄여서 CDI에 대한 치료로 확장될 수 있습니다. 그 이유는 이 기법이 항생제가 CDI 치료에 어떻게 도움이 될 수 있는지 확인할 수 있는 수단을 제공할 수 있기 때문입니다.

이 방법은 약리학적 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 혼합 배양 모델 또는 생체 내 동물 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 개인은 C.difficile을 배양하고 주사 전자 현미경을 작동하는 것이 어렵기 때문에 이 새로운 방법에 어려움을 겪습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 서로 다른 항생제의 작용 방식을 구별하려고 할 때 처음 떠올랐습니다.

오늘 만나게 될 연구팀을 소개해 드리고자 합니다. 자한기르 알람(Jahangir Alam)은 교수이자 미생물학자이다. 그는 오늘 보게 될 모든 실험실 활동을 조정합니다.

타스누바 라시드(Tasnuva Rashid)는 연구실의 대학원생이다. 그녀는 매일 많은 미생물학을 합니다. Eugenie Bassere는 박사 후 연구원입니다.

그녀는 실제로 Tasnuva에게 많은 기술을 가르쳤고 실험실에서도 도움을 주었습니다. Brad Endres는 연구실의 또 다른 박사후 연구원입니다. 그는 Long Chang의 도움으로 많은 현미경 검사를 할 것입니다.

멸균 장갑을 착용한 상태에서 환경 격리를 준비하려면 사전 멸균된 면 거즈를 사용하여 바닥, 문, 손잡이 또는 선반과 같은 관심 영역의 표면을 면봉으로 닦습니다. 그런 다음 면봉을 멸균된 튜브에 넣습니다. 샘플 간에 장갑을 교체하십시오.

임상 분리물을 준비하려면 접종 루프를 사용하여 10-100mg의 임상 대변 샘플을 세폭시틴 시클로세린 과당 한천(CCFA)에 플레이트하고 48-72시간 동안 엄격한 혐기성 조건에서 샘플을 삽관합니다. 추가 분석을 위해 C.Difficile 스톡의 분리된 콜로니를 섭씨 음의 80도의 극저온 바이알에 보관하십시오. 뇌 심장 주입 또는 BHI 국물에서 환경 면봉 샘플을 05% 타우로콜산나트륨으로 농축하고 샘플을 섭씨 37도의 혐기성 챔버에 5일 동안 놓습니다.

10, 000 시간 G에 배양의 1 밀리리터를 원심 분리기하고, 펠릿을 다시 현탁시키기 위하여 에탄올 100 마이크로리터를 이용한다. 재부유 세포 50마이크로리터를 CCFA 플레이트에 플레이트화하고 섭씨 37도의 혐기성 챔버에서 40-48시간 동안 배양합니다. 추가 분석을 위해 C.difficile 스톡의 분리된 콜로니를 섭씨 음의 80도의 극저온 바이알에 보관하십시오.

라텍스 응집 시약(PCR)을 사용하여 의심되는 C.difficile 집락을 테스트합니다. 48시간 동안 섭씨 37도의 혐기성 챔버에서 혈액 한천 플레이트에서 정제된 환경 또는 임상 C.difficile 균주를 성장시킵니다. 접종 루프를 사용하여 하나의 분리된 집락을 취하여 15ml 튜브에 있는 5ml의 BHI 배지로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 37도의 혐기성 챔버에서 24시간 동안 배양물을 성장시킵니다. 타우로콜산나트륨과 적절한 농도의 항생제가 보충된 신선하고 사전 감소된 BHIS를 사용하여 사전 배양물을 1-100에서 약 10에서 밀리리터당 6번째 CFU로 희석합니다. 피펫을 사용하여 각 시점에서 1ml의 검체를 채취한 후 혈액 한천 플레이트에 플레이트를 부착하거나 작은 부분 표본을 펴 바릅니다.

섭씨 37도의 혐기성 챔버에서 48시간 동안 플레이트를 배양하고 결과 콜로니 수를 세어 CFU를 결정합니다. 마이크로 분리기 튜브와 원심 분리기에서 각 시점으로부터 1밀리리터의 세포를 10, 000배 G로 10분 동안 모으십시오. 상등액을 버리고 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다.

샘플을 다시 회전시키고 상등액을 버립니다. 그런 다음 4%파라포름알데히드 1ml를 사용하여 세포를 다시 희석하고 튜브를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 다시 회전시키고 상등액을 버린 후 증류수를 사용하여 세포를 두 번 세척한 후 100마이크로리터의 증류수에 세포를 다시 희석합니다.

용액의 탁도에 따라 부피를 조정하십시오. 커버 슬립에 라벨을 붙인 후 40마이크로리터의 샘플을 그 위에 추가합니다. 플로우 후드 아래에서 커버 슬립을 15분 동안 배양하여 액체를 증발시키고 세포가 유리에 부착되도록 합니다.

액체가 여전히 남아 있으면 송풍기를 사용하여 제거하십시오. 커버 슬립을 책상 스퍼터링 기계에 넣고 테이프로 감습니다. 스퍼터링 기계에 순금을 고정합니다.

그런 다음 기계를 켜고 저압에서 스퍼터링을 시작합니다. 80마이크로암페어에서 30초 동안 세포를 코팅하면 20나노미터의 금 코팅이 됩니다. 이미징을 시작하려면 먼저 Vent 버튼을 눌러 컴퓨터 소프트웨어에서 SEM을 적절하게 환기시킵니다.

세포를 코팅한 후 주사 전자 현미경 또는 SEM으로 옮깁니다.탄소 테이프를 사용하여 코팅된 덮개 슬립을 금속 스테이지에 고정합니다. SEM이 환기되면 도어가 쉽게 열릴 것입니다.

금속 스테이지를 나사로 조여 SEM 챔버에 잠급니다. 그런 다음 소프트웨어에서 펌프 버튼을 클릭합니다. 시스템이 정상적으로 다시 읽으면 SEM을 사용할 준비가 된 것입니다.

Detector's 탭에서 SE detector를 클릭합니다. 전압을 표시하는 버튼을 클릭하여 빔을 켭니다. 전압을 높이기 전에 더 낮은 전압에서 이미징을 시작하십시오.

빔이 켜진 후 이미지가 나타납니다. 추적 기능을 사용하여 코팅된 커버가 미끄러져 이미지화할 영역을 찾습니다. 지역을 확대하여 Clostridium difficile을 나타내는 막대 모양의 구조를 찾습니다.

시스템을 보정하려면 이미지를 확대하고, 대충 초점을 맞추고, Z를 자유 working distance에 연결합니다. 이 작업은 15, 9, 5mm와 같은 여러 작동 거리에서 수행해야 합니다. 그런 다음 초고해상도 이미징 모드로 전환합니다.

거친초점과 미세초점(fine focus) 토글을 사용하여 고배율에서 초점을 맞춥니다. 더 선명한 이미지를 위해 난시 토글을 조정하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이미지를 디지털 방식으로 확대하여 이미지의 선명도를 확인합니다. 슬로우 스캔을 사용하여 고품질 이미지를 수집합니다.

수집된 이미지를 나중에 분석할 수 있도록 tiff 파일로 저장하고, 분석 중에 측정을 수행할 경우 데이터 막대가 선택되도록 합니다. SEM에서 스테이지를 기울여 더 많은 깊이 정보를 드러내기 위해 다양한 각도에서 이미지를 수집합니다. 느린 스캔 이미지를 수집하기 전에 초점과 난시를 최적화합니다.

이미징이 완료되면 빔을 끄고 작동 거리를 20mm로 높입니다. 그런 다음 챔버를 환기시키고 스테이지를 제거합니다. 이미지를 처리하고 피지에서 이미지 파일을 엽니다.

line 함수를 사용하여 눈금 막대를 정확하게 추적합니다. Analyze(분석) 탭을 클릭합니다. 그런 다음 배율 선택 기능을 선택합니다. 축척 막대를 기반으로 알려진 거리를 설정해야 하는 창이 나타납니다.

길이 단위도 변경하고 확인을 클릭합니다. 마지막으로, 세포 길이를 측정하려면 line 함수를 사용하여 세포 전체를 추적합니다. Analyze(분석) 탭을 다시 선택한 다음 measure(측정)를 클릭합니다.

길이는 이전에 표시된 단위로 표시되어야 합니다. 이 이미지는 성장 곡선의 지수 단계에서 포획된 C.difficile 식물 세포와 포자 세포를 보여줍니다. 식물 세포는 길고 매끄러운 막대 모양의 구조입니다. 반면 포자는 거친 외관을 가진 작은 타원형 구조입니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 대조 세포는 성장하여 고원에 도달합니다. 반면, 항생제인 반코마이신(vancomycin)과 메트로니다졸(metronidazole)로 처리된 세포는 총 CFU가 검출 한계까지 감소하여 살균 효과를 나타냅니다. 입증된 바와 같이, 반코마이신(vancomycin)과 메트로니다졸(metronidazole)은 슈퍼 MIC 농도에서 C.디피실(C.difficile)을 죽이는 데 효과적입니다. C.difficile 이미징에 SEM을 사용하는 유용성을 입증하기 위해 약물 처리 전후에 세포를 이미지화하여 형태가 어떻게 변했는지 확인했습니다.

반코마이신의 경우, 일부 세포벽이 영향을 받았고 일부 메트로니다졸 처리된 세포는 크기가 더 작았습니다. 세포 크기에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 Fiji 프로그램을 사용하여 세포 길이를 분석했습니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이 식물성 세포 크기는 대조군에서 약간 달라질 수 있습니다. 그러나 대부분은 길이가 약 6마이크로미터입니다.

그러나, 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 세포 길이는 메트로니다졸 처리한 세포에서는 영향을 받았지만, 반코마이신을 처리한 세포에서는 영향을 미치지 않았다. 이 기술을 숙달하면 이틀 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 코팅 및 이미징 전에 샘플이 고정되고 완전히 건조되었음을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 박테리아가 항생제 치료에 어떻게 반응하는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 추가 방법을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 항생제의 작용 메커니즘을 이해하는 데 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 엄청난 잠재력을 가지고 있으며 미생물학 분야의 연구자들이 클로스트리듐 디피실리의 생리학 및 약리학을 더 탐구할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다. 오늘 이 영상을 재미있게 보셨기를 바랍니다.

이를 통해 C.difficile 세포를 성장시키고 특성화하는 방법, C.Difficile에 대한 항생제의 사멸 역학을 살펴보는 방법, 그리고 높은 수준의 현미경을 사용하여 해당 사멸 패턴과 관련된 형태학적 변화를 평가하는 방법을 얻을 수 있기를 바랍니다. Clostridium difficile을 사용하는 동안 추가 예방 조치를 취하고 모든 보호 기능을 사용해야 합니다.