Name: 형태 변화를 규명하기위한 프로토콜 클로스 트리 디움 디피 실 항생제 치료에 대한 반응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 학습하세요 고해상도 현미경과 세포 배양을 결합하여 Clostridioides difficile의 항생제 처리에 따른 형태 변화를 관찰하는 방법을. 이 기술은 감염 질환 연구와 치료 전략 개선에 활용됩니다.

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이 실험은 Merck and Co. 및 Summit, PLC의 연구 보조금으로 지원되었습니다.

1. 다른 환경 적 또는 임상 적 출처로부터 C. difficile의 분리 <ol><li> 환경 분리 물 : 사전 멸균 된 면화 게이지 (0.85 % NaCl로 가볍게 적신)를 사용하여 관심 영역 (바닥, 문, 손잡이, 선반 등 )의 표면을 닦습니다. 8 멸균 된 장갑을 착용하고 완료된 후 멸균 된 튜브에 면봉을 놓습니다. </li><li> 임상 분리 물 (대변) : 접종 루프를 사용하여 cefoxitin-cycloserine-fructose 한천 (CCFA)에 임상 대변 샘플 10 ~ 100 mg을 넣고 48 ~ 72 시간 동안 엄격한 혐기 조건 하에서 배양합니다. 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 cryovials에 C. difficile 스톡의 격리 된 식민지를 저장하십시오. 7 , 9 , 10 </li><li> 0.05 % sodium taurocholate가 포함 된 BHI (brain heart infusion) 배지에서 환경 면봉 샘플을 풍부하게 만들고 37 ° C의 혐기성 챔버에 두십시오5 일 동안. 10,000 XG에서 문화 1 ML 원심 분리기와 에탄올 100 μL에 펠렛을 resuspend. </li><li> cycloserinecefoxitin fructose 한천 (CCFA) 플레이트 위에 resuspended 세포 (50 μL)를 플레이트하고 40에서 48 시간 37 ° C에서 혐기성 챔버에서 알을 품다. 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 cryovials에 C. difficile 스톡의 격리 된 식민지를 저장하십시오. </li><li> 라텍스 응집제 또는 PCR을 사용하여 의심되는 C. difficile 콜로니를 시험합니다. </li></ol> 2. C. difficile의 배양 과 Kinetic Procedures의 사멸 <ol><li> 37 ℃에서 48 시간 동안 혐기성 챔버에서 혈액 한천 평판에서 정제 된 환경 또는 임상 C. difficile 균주를 재배한다. </li><li> 접종 루프로 격리 식민지 하나를 취해 15 mL 튜브에 5 mL BHI 배지로 옮기고 37 ℃에서 혐기성 챔버에서 24 시간 동안 성장시킵니다. </li><li> 전 배양 물 1 : 100을 약 10 6 콜로니 형성 단위0.1 % 나트륨 타우로 콜레이트 및 항생제 (T0)의 적절한 농도로 보충 된 신선한 미리 감소 된 BHIS (BHI 플러스 5g / L 효모 추출물 및 1 % L- 시스테인)에서의 s (CFU) / mL. </li><li> 각 시점 (T0, T6, T24, T48)에서 피펫으로 1 ML 샘플을 수집하고 접시 / 혈액 한천 접시에 작은 나누어 (100 μL 시리얼 희석으로) 확산. 37 ° C에서 혐기성 챔버에서 48 시간 동안 혈액 한천 플레이트에서 세포가 자라도록하고 결과 CFU 수를 계산합니다. </li></ol> 3. 전자 현미경 검사 용 샘플 준비 <ol><li> microcentrifuge 튜브와 10 분 10,000 XG에서 원심 분리기의 각 시점에서 세포 1 ML을 수집합니다. 상등액을 버리고 PBS로 세포를 씻는다. </li><li> 다시 10 분 동안 10,000 xg에서 샘플을 원심 분리하고 상등액을 버린다. 4 % paraformaldehyde 1 ML에 세포를 다시 희석하고 실온에서 1 시간 품어. </li><li> 1시 10 분 동안 다시 원심 시료0,000 xg로 상등액을 버린다. 증류수로 세포를 두 번 씻고 증류수 100 μL로 다시 희석합니다. 솔루션의 탁도에 따라 볼륨을 조정합니다. 참고 : 여러 번 연속 희석을하는 것이 좋습니다. </li><li> coverslips 레이블을 추가하고 그것에 샘플의 40 μL을 추가합니다. 흐름 후드에서 15 분 동안 품어 액체를 증발시키고 세포가 coverslip에 고착하도록합니다. 액체가 여전히 남아 있으면 송풍기를 사용하여 액체를 제거하십시오. </li><li> 탁상용 스퍼터링 기계 및 테이프에 셀을 넣은 커버 슬립을 배치하십시오. 스퍼터링 기계에 순금을 확보하십시오. 기계를 켜고 저압 (50 mTorr)에서 스퍼터링을 시작하십시오. 80 nm에서 30 초 동안 코팅 세포를 코팅하면 20 nm의 금 코팅이됩니다. </li><li> 주사 전자 현미경으로 코팅 된 세포를 옮깁니다. </li></ol> 4. 주사 전자 현미경에서 영상 C. difficile 세포 <ol><li> 주사 전자 현미경 (주사 전자 현미경)을 적절히 환기 시키십시오.컴퓨터 소프트웨어의 배출 버튼을 누르십시오. </li><li> 카본 테이프를 사용하여 코팅 된 커버 슬립을 금속 스테이지에 고정시킵니다. SEM이 배출되면 문을 쉽게 열어야합니다. 금속 스테이지를 나사로 죄어 SEM 챔버에 잠급니다. </li><li> 컴퓨터 소프트웨어에서 PUMP 버튼을 클릭하십시오. 시스템이 &quot;Vac OK&quot;라고 표시되면 SEM을 사용할 수 있습니다. </li><li> Detector 탭에서 SE 탐지기를 클릭하십시오. 전압을 표시하는 버튼을 클릭하여 보를 켭니다. 전압을 높이기 전에 낮은 전압 (5 kV)에서 이미징을 시작하십시오 (최대 15 kV). 빔이 켜지면 이미지가 나타납니다. </li><li> 추적 기능을 사용하여 코팅 된 커버 슬립에서 이미지를 볼 수있는 영역을 찾습니다. 지역을 확대하고 막대 모양의 구조를 찾습니다. 이들은 클로스 트리 디움 디피 실 입니다. </li><li> 이미지를 확대하고 초점을 맞춰 시스템을 보정하십시오. 이 작업 거리는 15, 9 및 5 mm의 여러 작업 거리에서 수행해야합니다. 5mm의 작동 거리에서 이미지. </li><li> 너를 켜라.ltra 고해상도 이미징 모드로 초점을 맞추고 난시를 최적화합니다. </li><li> 높은 배율에서 초점을 맞추기 시작하십시오. 이를 위해 거친 초점과 미세한 초점을 사용하십시오. 더 명확한 이미지를 얻으려면 난시도 조정하십시오. <ol><li> 높은 배율로 난시를 조정하십시오. 이렇게하려면 비점 수식 토글 (미세한 / 거친 포커스 토글과 유사하게 보임)을 조정하고 컴퓨터 소프트웨어를 디지털 확대하여 명확하게 이미지를 확인하십시오. </li></ol></li><li> 고화질 이미지를 수집하는 느린 스캔 기능. 수집 된 이미지를 .TIFF 파일로 저장하면 분석에 사용됩니다. 분석 중에 측정이 이루어지면 데이터 막대가 선택되었는지 확인하십시오. </li><li> SEM에서 직접 각도를 수동으로 돌리면 서로 다른 각도 (최대 52 °)에서 이미지를 수집 할 수 있습니다. 각 이미지는 깊이 정보를 더 많이 나타내는 경향이 있습니다. </li><li> 이미징되는 셀에 따라 빔 전압을 변경하십시오. 이것을 모든 실험에서 5 - 15 kV로 유지하십시오. </li&gt; <li> 이미징이 완료되면 빔을 끄고 작동 거리를 20 mm로 올립니다. 그런 다음 챔버를 배출하고 스테이지를 제거 할 수 있습니다. 추가 분석을 위해 모든 이미지를 드라이브에 복사하십시오. </li></ol> 5. 이미지 처리 및 분석 <ol><li> 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어 인 FIJI (http://fiji.sc)를 다운로드하여 컴퓨터에 설치하십시오. </li><li> FIJI에서 이미지 파일을 엽니 다. </li><li> 선 기능을 사용하여 스케일 바를 정확하게 추적하십시오. </li><li> FIJI 프로그램에서 Analyze 탭을 클릭하고 Select Scale 기능을 선택하십시오. 눈금 막대를 기준으로 알려진 거리를 설정해야하는 창이 나타납니다. 길이 단위도 변경하고 확인을 클릭하십시오. </li><li> 이제 프로그램이 거리에 대해 보정되었으므로 라인 함수를 사용하여 셀 길이를 측정합니다. 길이를 얻으려면 line 함수를 사용하여 셀 전체를 추적하십시오. 분석 탭을 다시 선택한 다음 측정을 클릭하십시오. 길이는 app이어야합니다.귀는 이전에 표시된 단위로. </li></ol>

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<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
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</ol>

KWG는 Merck &; Co. 및 Summit, PLC로부터 과거 및 현재 연구 지원을 받았습니다.

현재 연구의 목표는 C. difficile을 분리 하고 항생제의 약리 작용을보다 철저히 특성화하기위한 수단으로 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 항생제 감수성을 검사하는 높은 처리량 방법을 만드는 것이 었습니다. 여기에 설명 된 프로토콜을 사용하여 우리는 항생제 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 이미지화하면 약물의 약리 작용에 대한 통찰력을 확인할 수 있음을 입증했습니다. 전체적으로,이 프로토콜의 이미징 부분은 세포를 수집 한 후 약 2 시간이 걸리지 만 일반적인 킬링 반응 연구보다 훨씬 더 차별적 일 수 있습니다. SEM을 사용하는 것을 기술적으로 요구할 수 있지만 샘플을 준비하는 것은 비교적 간단하고 빠릅니다. 우리는 여기에 설명 된 이러한 프로토콜이 항생제 치료의 약리 작용을 평가하는 객관적인 접근 방법을 제공 할 것이라고 믿는다. t 간의 유사성 고려그는 항생제 죽이는 곡선 ( 그림 2 ), 우리가 약리 치료에 대한 ...

Clostridium difficile 은 그람 양성, 포자 형성 세균으로 매년 미국에서 약 50 만 건의 감염을 일으키며 질병 위험 예방 센터 (CDC)에서 위협 수준의 긴급 병원체로 간주됩니다. 1 지난 10 년 동안 C. difficile 에 대한 항균제 개발에 상당한 약물 개발이 있었습니다 . 2 , 3 시험 관내 연구는 약물 개발 과정의 필수 구성 요소입니다. 전통적으로 in vitro 감수성 및 시간 사멸 연구는 미래의 동물 및 기타 생체 내 연구를 검증하는 데 사용됩니다. 이 방법은 살상 행동을 평가하는 데 중요한 역할을하지만, 약리학 적 치료에 대한 세포의 표현형 반응을 포착하지는 않습니다. 표준 전자 현미경 (SEM)을 통합하여동역학 연구를 중단하면 항생제 직접 효과에 대한보다 철저한 특성 분석이 가능하다. 5 , 6 , 7 여기서 우리는 SEM을 항생제 치료의 효능을 설명하는 수단으로 사용하는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>코튼 가제&nbsp;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion (BHI)&nbsp;</td><td>Criterion</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td>, <td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td>, <td>Criterion</td><td>C741</td><td></td></tr>, <tr><td>타우로콜산나트륨</td>, <td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr>, <tr><td>혐기성 챔버</td><td>Coy</td><td></td><td>, 비닐 혐기성 챔버</td></tr>, <tr><td>시클로세린세폭시틴, 과당 한천(CCFA) 플레이트</td>, <td>혐기성 시스템</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>혈액 한천 플레이트</td><td>Hardy 진단</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>라텍스 응집 시약</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff 테스트 키트</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>J. Melvin은 브랜드</td><td>7525M 75</td><td>x 25mm</td></tr><tr><td>플로우 후드</td><td>Labconco</td><td>Class II 타입 A2를</td> 해방시켰습니다.<td>생물안전성 작업대</td></tr><tr><td>책상 스퍼터링 머신</td><td>Denton 진공</td><td>데스크 II</td><td></td></tr><tr><td>테이프</td><td>플라스틱 코어</td><td>05072-AB</td><td>SPI 양면 접착 탄소 테이프</td></tr><tr><td>골드</td><td>Denton 진공</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375" 지름 x .002" 두꺼운 금박</td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

혐기성 박테리아에 대한 신약 개발로 항생제 작용을 평가하는 것은 어렵고 기술적으로 까다 롭습니다. 가능한 MOA에 대한 통찰력을 얻으려면 항생제 노출과 관련된 형태 학적 변화를 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 전통적인 살인 곡선과 SEM 이미징을 통합하면 약물 작용에 대한 우리의 통찰력을 향상시키고 약물 개발 프로세스를 향상시킬 수 있습니다. 이 전제를 테스트하기 위해 알려진 MOA (vancomycin 및 metronidazole)를 가진 약물을 사용하여 곡선을 죽이고 SEM 연구를 수행했습니다. C. difficile 세포 (R20291)는 항생제의 존재 또는 부재하에 48 시간까지 성장시켰다. 48 시간 간격으로 항생제 유효성을 결정하고 SEM에서 영상을 얻기 위해 여러 시점에서 세포를 수집했습니다. 이전 보고서와 일치하여, vancomycin과 metronidazole은 식민지 형성 단위 (colony-forming unit, CFU)에서 측정 한 24 시간 처리 후에도 상당한 살균 활성을 보였다.팅. SEM 이미징을 사용하여 metronidazole은 대조군과 vancomycin에 비해 세포 길이에 유의 한 영향을 주었다 (각 항생제의 세포 길이가 50 % 이상 감소, P &lt;0.05). 약물 치료에 대한 표현형 반응은 이전에 이러한 방식으로 문서화되지 않았지만, 약물의 MOA와 일관성이 있으며, 이미징 및 측정의 다양성과 신뢰성 및 다른 실험 화합물에 대한이 기술의 적용을 입증합니다.

Clostridium difficile 은 포자 형성 세균이며 기능 분석 전에 식물과 포자 세포 사이의 형태 학적 차이를 결정하는 것이 필수적입니다. 그림 1 은 성장 곡선과 포자 세포의 지수 단계에서 캡처 한 식물 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 묘사 된 바와 같이 식물 세포는 길고 매끄 럽고 막대 모양의 구조이며 포자는 거칠고 외형이 작은 타원형 구조입니다. 기능적으로 식물 세포는 빠르게 자라며 분열하며 독소를 분비함으로써 C.difficile 감염의 병독성을 일으키는 반면, 포자는 일반적으로 거의 활동하지 않으면 서 휴면 상태입니다. 따라서 항생제는 식물 세포에 대해 주로 활성 인 반면, 포자는 DNA로 코어를 보호하는 여러 층과 생리 활성이 없기 때문에 약물 치료에 일반적으로 저항합니다. 이 사실로 인해,형태 학적 분석은 식물 세포에 초점을 맞추고있다. 11</sup...

항생제 효능은 가장 일반적으로 사멸 역학 연구를 수행하고 집락 형성 단위(CFU)를 측정하여 결정됩니다. 주사전자현미경(SEM)을 이러한 표준 방법과 통합함으로써 다양한 항생제 간의 치료의 약리학적 효과를 구별할 수 있습니다.

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

본 미생물 이미징 방법의 전반적인 목표는 약물 치료의 표현형 효과를 구분할 수 있는 더 서술적인 수단을 제공하는 것입니다. 따라서 이 방법은 감염성 질환 분야에 실질적인 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로는 특정 항생제의 형태학적 효과와 그것이 C.Difficile을 사멸시키는 방식을 살펴봅니다.이 기술의 주요 장점은 고해상도 이미징과 인 비트로(in vitro) 세포 배양 기술을 결합하여 약물의 살균 작용에 대한 세부적인 전망을 제공한다는 점입니다. 이 기술의 응용 범위는 Clostridium difficile 감염, 즉 CDI 치료까지 확장될 수 있습니다. 그 이유는 이 기술이 항생제가 CDI 치료에 어떻게 유익하게 작용할 수 있는지 확인하는 수단을 제공할 수 있기 때문입니다.이 방법은 약리학적 작용에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 혼합 배양 모델이나 인비보(in vivo) 동물 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 C.difficile 배양과 주사 전자 현미경 조작이 어렵기 때문에 연구자들이 이 새로운 방법을 적용하는 데 어려움을 겪습니다. 저희는 서로 다른 항생제들의 작용 기전을 구분하려던 중에 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.오늘 만나게 될 연구팀을 소개해 드리겠습니다. Jahangir Alam 교수는 미생물학자로, 오늘 보시게 될 모든 실험실 활동을 총괄하고 있습니다.Tasnuva Rashid는 연구실의 대학원생입니다. 그녀는 일상적인 미생물학 실험의 많은 부분을 담당하고 있습니다. Eugenie Bassere는 박사후 연구원입니다.그녀는 Tasnuva에게 많은 기술을 가르쳤으며 실험실 업무도 돕고 있습니다. Brad Endres는 실험실의 또 다른 박사후 연구원입니다. 그는 Long Chang의 도움을 받아 많은 현미경 관찰 작업을 수행할 예정입니다.멸균 장갑을 착용한 상태에서 환경 분리물을 준비하려면, 미리 멸균된 면 거즈를 사용하여 바닥, 문, 손잡이 또는 선반과 같이 관심 있는 구역의 표면을 닦아내십시오. 그런 다음 면봉을 멸균 튜브에 넣으십시오. 샘플을 채취할 때마다 장갑을 교체하십시오.임상 분리주를 준비하려면 접종 루프를 사용하여 10~100 mg의 임상 분변 샘플을 cefoxitin cycloserine fructose agar(CCFA)에 도말하고, 엄격한 혐기성 조건에서 48~72시간 동안 배양합니다. 분리된 C.Difficile 보관 균주 콜로니는 추후 분석을 위해 -80 °C의 크라이오 바이알에 보관하십시오. 환경 스왑 샘플은 0.5% sodium taurocholate가 포함된 brain heart infusion(BHI) 배지에서 증식시킨 후, 37 °C의 혐기성 챔버에 5일 동안 둡니다.배양액 1 mL를 10,000 ×g에서 원심분리하고, 100 µL의 에탄올을 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 재현탁된 세포 50 µL를 CCFA 플레이트에 도말하고, 혐기성 챔버 내 37 °C에서 40~48시간 동안 배양합니다. 분리된 C.difficile 단일 콜로니를 cryovial에 담아 -80 °C에 보관하여 추후 분석에 사용합니다.라텍스 응집 시약 또는 PCR을 사용하여 C.difficile 의심 군락을 테스트합니다. 정제된 환경 또는 임상 C.difficile 균주를 혐기성 챔버 내의 혈액 한천 배지에서 37 °C로 48시간 동안 배양합니다. 접종 루프를 사용하여 분리된 군락 하나를 채취한 후, 15 mL 튜브에 담긴 5 mL의 BHI 배지에 옮깁니다.그 후 혐기성 챔버 내에서 37°C로 24시간 동안 배양합니다. 소듐 타우로콜레이트와 적정 농도의 항생제가 첨가된 신선한 환원 BHIS를 사용하여 전배양액을 1:100로 희석해 약 10⁶ CFU/mL가 되도록 합니다. 피펫을 사용하여 각 시점마다 1 mL의 시료를 수집하고, 소량을 혈액 한천 배지에 도말하거나 분주합니다.플레이트를 37 °C의 혐기성 챔버에서 48시간 동안 배양한 후, 생성된 콜로니 수를 측정하여 CFU를 결정합니다. 각 시간대별로 1 mL의 세포를 마이크로원심분리관에 수집하고 10,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 PBS를 사용하여 세포를 세척합니다.샘플을 다시 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드 1 mL를 사용하여 세포를 다시 희석하고 실온에서 1시간 동안 튜브를 배양합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, 증류수로 세포를 2회 세척하고 100 µL의 증류수에 세포를 다시 희석합니다.용액의 탁도에 따라 부피를 조절하십시오. 커버슬립에 라벨을 붙인 후, 샘플 40 µL를 그 위에 첨가합니다. 층류 후드 내에서 커버슬립을 15분 동안 배양하여 액체를 증발시키고 세포가 유리에 부착되도록 합니다.액체가 여전히 남아 있다면, 블로워를 사용하여 이를 제거하십시오. 커버 슬립을 데스크탑 스퍼터링 장치에 넣고 테이프로 고정하십시오. 스퍼터링 장치에 순금 타겟을 장착하십시오.그 다음 장비를 켜고 낮은 압력에서 스퍼터링을 시작합니다. 80 microamperes에서 30초 동안 코팅하면 20 nanometers 두께의 금 코팅이 입혀집니다. 이미징을 시작하려면, 먼저 컴퓨터 소프트웨어의 Vent 버튼을 눌러 SEM을 적절히 벤트합니다.세포 코팅 후, 주사 전자 현미경(SEM)으로 옮깁니다. 카본 테이프를 사용하여 코팅된 커버슬립을 금속 스테이지 위에 고정합니다. SEM의 진공이 해제되면 도어가 쉽게 열립니다.금속 스테이지를 나사로 조여 SEM 챔버에 고정합니다. 그런 다음, 소프트웨어에서 Pump 버튼을 클릭합니다. 시스템 상태가 정상으로 읽히면 SEM을 사용할 준비가 된 것입니다.Detector 탭에서 SE 검출기를 클릭하십시오. 전압이 표시된 버튼을 클릭하여 빔을 켭니다. 전압을 높이기 전에 낮은 전압에서 이미징을 시작하십시오.빔을 켜면 이미지가 나타납니다. 트래킹 기능을 사용하여 코팅된 커버슬립에서 이미징할 영역을 찾으십시오. 해당 영역을 확대하여 Clostridium difficile을 나타내는 막대 모양의 구조물을 찾으십시오.시스템을 교정하려면, 줌을 확대하고 이미지의 초점을 대략적으로 맞춘 후 Z축을 자유 작동 거리(free working distance)에 연결하십시오. 이 과정은 15, 9, 5mm와 같이 여러 작동 거리에서 수행해야 합니다. 그런 다음 초고해상도 이미징 모드로 전환하십시오.조동나사와 미동나사 조절기를 사용하여 고배율에서 초점을 맞추기 시작하십시오. 난시 조절기를 조정하여 이미지를 더 선명하게 만들고, 컴퓨터 소프트웨어의 디지털 줌 기능을 사용하여 이미지의 선명도를 확인하십시오. 느린 스캔(slow scan) 기능을 사용하여 고품질 이미지를 수집하십시오.수집한 이미지를 나중에 분석할 수 있도록 tiff 파일로 저장하며, 분석 중에 측정을 수행할 경우 데이터 바가 선택되었는지 확인하십시오. SEM의 스테이지를 기울여 다양한 각도에서 이미지를 수집함으로써 더 많은 깊이 정보를 확인하십시오. 슬로우 스캔 이미지를 수집하기 전에 초점과 비점수차를 최적화하십시오.이미징이 완료되면 빔을 끄고 작동 거리(working distance)를 20 millimeters로 높입니다. 그 다음 챔버를 벤팅하고 스테이지를 제거합니다. 이미지를 처리하고 Fiji에서 이미지 파일을 엽니다.선(line) 기능을 사용하여 스케일 바를 정확하게 따라 그립니다. 분석(Analyze) 탭을 클릭한 다음, 스케일 선택(Select Scale) 기능을 선택합니다. 스케일 바를 기반으로 기지 거리(known distance)를 설정해야 하는 창이 나타납니다.길이 단위도 변경한 후, 확인(Okay)을 클릭하십시오. 마지막으로, 세포 길이를 측정하려면 선(line) 기능을 사용하여 세포 전체를 따라 그립니다. 분석(Analyze) 탭을 다시 선택한 다음, 측정(measure)을 클릭하십시오.길이는 이전에 표시된 단위로 나타나야 합니다. 이 이미지들은 성장 곡선의 대수 증식기 동안 캡처된 C.difficile 영양 세포와 포자 세포를 보여줍니다. 영양 세포는 길고 매끄러운 막대 모양의 구조인 반면, 포자는 외벽이 거친 작은 타원형 구조입니다.이 그림에서 보듯이, 대조군 세포는 성장하여 정체기에 도달하는 반면, 항생제인 vancomycin과 metronidazole을 처리한 세포는 총 CFU가 검출 한계까지 감소하여 살균 효과가 있음을 나타냅니다. 입증된 바와 같이, vancomycin과 metronidazole는 super MIC 농도에서 C.difficile를 사멸시키는 데 효과적입니다. C.difficile 이미징에 있어 SEM 사용의 유용성을 입증하기 위해, 약물 처리 전후의 세포를 촬영하여 형태학적 변화를 확인하였습니다.반코마이신(vancomycin)의 경우, 일부 세포벽이 영향을 받았으며 메트로니다졸(metronidazole)로 처리된 일부 세포는 크기가 더 작았습니다. 세포 크기가 영향을 받았는지 테스트하기 위해, Fiji 프로그램을 사용하여 세포 길이를 분석했습니다. 이 이미지에서 알 수 있듯이, 대조군의 경우 영양 세포의 크기에 다소 차이가 있을 수 있으나, 대부분의 길이는 약 6 micrometers입니다.하지만 이 그래프에서 보듯, 세포 길이는 metronidazole 처리된 세포에서 영향을 받았으나 vancomycin 처리된 세포에서는 그렇지 않았습니다. 이 기술을 숙달하면 2일 이내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 코팅 및 이미징 전에 샘플이 고정되었으며 완전히 건조되었는지 확인하는 것이 중요합니다.본 절차를 마친 후, 박테리아가 항생제 처리에 어떻게 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 추가 방법을 수행할 수 있으며, 이는 예를 들어 항생제의 작용 기전을 이해하는 데 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 엄청난 잠재력을 가지고 있으며, 미생물학 분야의 연구자들이 Clostridium difficile의 생리학 및 약리학을 더욱 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 오늘 이 영상을 즐겁게 시청하셨기를 바랍니다.본 영상을 통해 C. difficile 세포를 배양하고 특성화하는 방법, C. difficile에 대한 항생제의 살균 역학을 관찰하는 방법, 그리고 고해상도 현미경을 사용하여 이러한 살균 패턴과 관련된 형태학적 변화를 평가하는 방법을 습득하셨기를 바랍니다. Clostridium difficile을 다루는 동안에는 각별한 주의를 기울여야 하며, 모든 보호 장비를 사용해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 윈스턴, J. A. 외 임상적으로 중요한 Clostridium difficile 균주 R20291의 Cefoperazone 처리 마우스 모델. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 감염된 마우스 모델의 대변 샘플에서 선택적 배양 기법을 사용하여 클 로스트리듐 디피실 을 정량화하는 과정을 보여줍니다. 샘플 수집, 혐기성 처리, 연속 희석, 군체 개체 수 절차를 개략적으로 제시하여 박테리아 정착과 숙주-병원체 상호작용을 평가합니다.

감염된 마우스 모델의 대변 샘플에서 클 로스트리듐 디피실 정량화

이 비디오는 박테리아 세포에서 형광 항생제 프로브의 축적을 측정하는 분석을 보여줍니다. 유출 펌프 억제제에 노출되면 박테리아 세포의 막관통 양성자 구배가 방해를 받아 형광단 접합 항생제가 추가됩니다. 파괴된 양성자 구배로 인한 유출 펌프의 억제는 박테리아 내부에 항생제의 축적을 유발합니다. 박테리아 세포를 용해시키고 형광 강도를 측정하여 항생제 축적을 확인합니다.

박테리아 세포에서 형광 항생제 프로브의 축적을 측정하기 위한 분석

클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.

배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련<em&gt; 클로스 트리 디움 디피</em&gt; 스트레인 R20291

이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

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여기에서는 대장염에 대한 Bacillus cereus 의 긍정적인 효과를 조절하는 장내 미생물총(microbiota)의 역할을 조사하기 위해 항생제 유도 pseudo-germ-free dextran sulfate 나트륨 유발 대장염 마우스 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

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학습하세요 고해상도 현미경과 세포 배양을 결합하여 Clostridioides difficile의 항생제 처리에 따른 형태 변화를 관찰하는 방법을. 이 기술은 감염 질환 연구와 치료 전략 개선에 활용됩니다.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜

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